二肽的结晶及其制备方法与流程

本发明涉及二肽的结晶及其制备方法。

背景技术：
一般而言，要求药品等被人体摄取的化合物尽可能去除杂质，特别是去除非天然化合物。例如，日美EU三极药品认证审察调和国际会议(ICH)的医药品原药指导手册中记载了应当将杂质控制在0.05重量％以下。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是可以在输液成分等药品原料和化妆品等中使用的二肽，在药品原料等中使用时需要达到这种标准。作为通过化学合成法进行的二肽的制备方法，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的制备方法，已知的有N-苄氧羰基丙氨酸与添加了保护基的谷氨酰胺相缩合，脱保护进行合成的方法(非专利文献1和非专利文献2)、N-苄氧羰基丙氨酸与没有保护基的谷氨酰胺相缩合，脱保护进行合成的方法(专利文献1)、通过使N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物与氨反应进行合成的方法(专利文献2和非专利文献3)等。作为使用酶或微生物制备在构成成分中不含D-氨基酸的二肽的方法，已知有使L-氨基酸酰胺水解酶作用于L-氨基酸酰胺和L-氨基酸的方法(专利文献3)、使各种微生物作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法(专利文献4)、使脯氨酸亚氨肽酶作用于L-氨基酸酯和L-氨基酸的方法(专利文献5)、使来源于稳杆菌属(Empedobacter)或鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)细菌的酶作用于L-氨基酸酯或L-氨基酯酸酰胺和L-氨基酸的方法(专利文献6)和采用具有由1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的方法(专利文献7)等。这些方法中，化学合成法容易引起氨基的异构化和三肽的副产品、例如、非专利文献3中记载了通过重复再结晶获得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶中残留了0.19％的D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。而且，还提示在以氨基酸酯和氨基酸酰胺作为原料的酶合成法中可能生成由3个以上的氨基酸构成的多肽(专利文献6)。因此，希望不含下述杂质等的二肽的结晶及其制备方法，所述杂质为以D-氨基酸作为构成成分的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽。非专利文献1：Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)非专利文献2：Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962)非专利文献3：Org.ProcessRes.Dev.，4，147(2000)专利文献1：美国专利第5,032,675号专利文献2：特开平6-234715号专利文献3：国际公开号第03/010187号小册子专利文献4：国际公开号第03/010189号小册子专利文献5：国际公开号第03/010307号小册子专利文献6：国际公开号第2004/022733号小册子专利文献7：国际公开号第2004/058960号小册子

技术实现要素：
发明要解决的问题本发明的目的在于提供下述二肽的结晶及其制备方法，所述二肽的结晶基本上不含构成成分中含有D-氨基酸的二肽和三肽。用于解决问题的方法本发明涉及以下(1)～(11)：(1)二肽的结晶，其基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽。(2)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶，其基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽。(3)上述(2)的结晶，其中构成成分中含有D-氨基酸的二肽是D-丙氨酰-L-谷氨酰胺，由3个以上的氨基酸构成的多肽是丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺。(4)上述(1)～(3)中任一项的结晶，其基本上不含氨基酸酰胺。(5)上述(4)的结晶，其中氨基酸酰胺是丙氨酰胺。(6)上述(1)～(5)中任一项的结晶的制备方法，其包括下述步骤：在培养基中培养下述微生物，使之在该培养基中生成、积累二肽，其中所述微生物具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力，以及具有生产下述蛋白质的能力，所述蛋白质具有由选自L-氨基酸和甘氨酶的1种以上的氨基酸生成二肽的活性，(7)上述(6)的制备方法，其中具有由选自L-氨基酸和甘氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质是选自下述[1]～[4]的蛋白质：具有序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的蛋白质；由与序列号1～8任一项所示的氨基酸序列具有至少65％以上的同源性的氨基酸序列构成的、并且具有生成二肽的活性的蛋白质；由在序列号1～8任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质；含有与序列号18所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、并且具有二肽的合成活性的蛋白质；(8)上述(6)或(7)的制备方法，其中选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸是L-丙氨酸或L-谷氨酰胺，二肽是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。(9)上述(2)～(5)任一项的结晶的制备方法，其包括在培养基中培养具有下述能力的微生物，使之在培养物中生成、积累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后，进行下述的[1]或[2]的步骤：对含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养物、或由该培养物制备的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液进行加热处理的步骤；由含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养物制备含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液，通过向该溶液中添加甲醇使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺析出结晶的步骤；其中，所述微生物具有生产L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力、以及具有生产下述蛋白质的能力，所述蛋白质具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性。(10)上述(2)～(5)任一项的结晶的制备方法，其特征在于，使用具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白质、具有生产该蛋白质能力的微生物的培养物、或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源、L-丙氨酸和L-谷氨酰胺共存于水性介质中，在该水性介质中生成、积累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，从该水性介质制备含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液后，通过向该溶液中添加甲醇使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺析出结晶。(11)上述(10)的制备方法，具有由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白质是选自下述的[1]～[4]的蛋白质：具有序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的蛋白质；由与序列号1～8任一项所示的氨基酸序列具有至少65％以上的同源性的氨基酸序列构成、并且具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白质；由在序列号1～8任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白质；含有与序列号18所示的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，并且具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成活性的蛋白质。发明的效果根据本发明，可以制备下述二肽的结晶，其中基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽。具体实施方式1.本发明的二肽的结晶作为本发明的二肽的结晶，其中基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽，可以例举下述二肽的结晶：其中基本上不含在构成成分中含有1种或2种以上的构成目的二肽结晶的氨基酸的D型氨基酸的二肽、和在构成成分中含有构成目的二肽结晶的氨基酸和/或该氨基酸的D型氨基酸的由3个以上的氨基酸构成的1种或2种以上的多肽、优选1种或2种以上的三肽。在本发明中作为在构成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例举在构成成分中含有选自下述氨基酸的二肽，所述氨基酸为：D-丙氨酸(D-Ala)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-缬氨酸(D-Val)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-色氨酸(D-Trp)、D-蛋氨酸(D-Met)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-酪氨酸(D-Tyr)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-精氨酸(D-Arg)、D-组胺酸(D-His)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-α-氨基丁酸(D-α-AB)、D-重氮丝氨酸(D-Azaserine)、D-茶氨酸(D-theanine)、4-羟基-D-脯氨酸(4-D-HYP)、3-羟基-D-脯氨酸(3-D-HYP)、D-鸟氨酸(D-Orn)、D-瓜氨酸(D-Cit)和6-重氮基-5-羰基-D-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-D-norleucine)等D-氨基酸。此外，在本发明中，作为由3个以上的氨基酸构成的多肽，可以例举由选自下述氨基酸等的3个以上的氨基酸构成的多肽，优选三肽，所述氨基酸为：丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、酪氨酸(Tyr)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组胺酸(His)、天冬氨酸(Asp)、α-氨基丁酸(α-AB)、重氮丝氨酸(Azaserine)、茶氨酸(theanine)、4-羟基脯氨酸(4-HYP)、3-羟基脯氨酸(3-HYP)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、D-6-重氮基-5-羰基正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-norleucine)、甘氨酸(Gly)和β-丙氨酸(β-Ala)。作为本发明的基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶，只要是基本上不含上述构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶，可以是任何二肽的结晶，不过优选可以例举有由选自下述氨基酸中的1种或2种氨基酸构成的二肽的结晶，所述氨基酸为：L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-缬氨酸(L-Val)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-异亮氨酸(L-Ile)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-色氨酸(L-Trp)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-丝氨酸(L-Ser)、L-苏氨酸(L-Thr)、L-半胱氨酸(L-Cys)、L-天冬酰胺(L-Asn)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-赖氨酸(L-Lys)、L-精氨酸(L-Arg)、L-组胺酸(L-His)、L-天冬氨酸(L-Asp)、L-α-氨基丁酸(L-α-AB)、L-重氮丝氨酸(L-Azaserine)、L-茶氨酸(L-theanine)、4-羟基-L-脯氨酸(4-L-HYP)、3-羟基-L-脯氨酸(3-L-HYP)、L-鸟氨酸(L-Orn)、L-瓜氨酸(L-Cit)、6-重氮基-5-羰基-L-正亮氨酸(L-6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、Gly和β-Ala。而且，作为本发明的二肽的结晶，优选基本上不含下述二肽或多肽，所述二肽为作为构成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例举有构成成分中含有1种或2种以上的选自D-Ala、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Gln、D-Glu、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Pro、D-Phe、D-Trp、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-Asp、D-α-AB、4-D-HYP、3-D-HYP、D-Orn和D-Cit等的D-氨基酸的二肽，所述多肽作为3个以上的氨基酸构成的多肽，在构成成分中含有选自Ala、Met、Ser、Thr、Gln、Glu、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Asn、Tyr、Lys、Arg、His、Asp、α-AB、4-HYP、3-HYP、Orn、Cit、Gly和β-Ala等的3个以上的氨基酸构成的1种或2种以上的多肽、优选1种或2种以上的三肽，作为本发明的二肽的结晶可列举式(I)表示的二肽的结晶：R1-R2(I)[其中，R1为L-Ala、L-Met、L-Ser、L-Thr或β-Ala，R2为L-Gln、L-Glu、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit或Gly]，更优选地，本发明的二肽的结晶基本上不含下述在构成成分中含有D-氨基酸的二肽，和由3个以上的氨基酸构成的多肽，其中，作为构成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例举有构成成分中含有1种或2种以上选自D-Ala、D-Gln、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Phe、D-Trp、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-α-AB和D-Cit等的D-氨基酸的二肽；作为由3个以上的氨基酸构成的多肽，可以例举在构成成分中含有选自Ala、Gln、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Ser、Thr、Cys、Asn、Tyr、Lys、Arg、His、α-AB、Cit、Gly和β-Ala等3个以上的氨基酸构成的1种或2种以上的多肽，优选1种或2种以上的三肽，可以列举有式(II)表示的二肽的结晶，R3-R4(II)[其中，R3为L-Ala时，R4为L-Gln、Gly、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB或L-Cit，R3为Gly时，R4为L-Gln、Gly、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-α-AB或L-Cit，R3为L-Met时，R4为L-Phe、L-Met、L-Cys、L-Tyr、L-Lys或L-His，R3为L-Ser时，R4为L-Gln、Gly、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Tyr、L-His或L-α-AB，R3为L-Thr时，R4为L-Gln、L-Leu、L-Phe、L-Met、L-Ser、L-Thr或L-α-AB，R3为L-Gln时，R4为L-Phe或L-α-AB，R3为L-Phe时，R4为L-Gln，R3为L-Trp时，R4为Gly，R3为L-Cys时，R4为L-Ala、L-Gln、Gly或L-Met，R3为L-Lys时，R4为L-Ala、Gly或L-Met，R3为L-Arg时，R4为L-α-AB，R3为L-His时，R4为L-Met，R3为L-α-AB时，R4为L-Ala、L-Gln、Gly、L-Ser、L-Thr、L-Arg或L-α-AB，R3为β-Ala时，R4为L-His]。作为本发明的二肽的结晶，更为优选基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽和由3个以上的氨基酸构成的多肽，其中，作为构成成分中含有D-氨基酸的二肽，可以例举有选自L-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB和L-Cit等的L-氨基酸的氨基与选自D-Ala、D-Gln、D-Val、D-Leu、D-Ile、D-Phe、D-Trp、D-Met、D-Ser、D-Thr、D-Cys、D-Asn、D-Tyr、D-Lys、D-Arg、D-His、D-α-AB和D-Cit等的D-氨基酸的羧基形成肽键的二肽，作为由3个以上氨基酸构成的多肽，是在构成成分中含有3个以上选自L-Ala、L-Gln、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-α-AB、L-Cit、Gly和β-Ala等的氨基酸构成的1种或2种以上的多肽、优选1种或2种以上的三肽，可列举式(II)[其中，R3和R4均与上述意义相同]表示的二肽的结晶。作为本发明的二肽的结晶，作为特别优选，可以例举下述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶，其中，其中基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽，和由3个以上的氨基酸构成的多肽，所述在构成成分中含有D-氨基酸的二肽是D-Ala-L-Gln，作为由3个以上的氨基酸构成的二肽为丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Ala-Gln)。而且，作为本发明的基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶，除了上述的结晶之外，还可以例举有基本上不含氨基酸酰胺的结晶。作为氨基酸酰胺，可以例举有选自丙氨酰胺(AlaNH2)、甘氨酰胺和天冬氨-α-酰胺的氨基酸酰胺，优选AlaNH2。作为本发明的二肽的结晶，优选这样的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶：其基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽如D-Ala-L-Gln、由3个以上的氨基酸构成的多肽如Ala-Ala-Gln和氨基酸酰胺如AlaNH2。而且，本发明的二肽的结晶可以是任意一种晶形，例如，可以例举有针状结晶等。所谓基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽，是指在本发明的二肽的结晶中的重量％为可以例举：(a)构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.014重量％，优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.010重量％以下，更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.005重量％以下，更为优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.002重量％以下、或构成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004重量％，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.032重量％，优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.003重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.020重量％以下，更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.010重量％以下，更为优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.005重量％以下，特别优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002重量％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.002重量％以下。所谓的基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、和氨基酸酰胺，可以例举，在二肽的结晶中的重量％为：(b)在构成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004重量％，由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.032重量％，并且氨基酸酰胺不到0.023重量％；优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.003重量％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.020重量％以下，并且氨基酸酰胺为0.015重量％以下；更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002重量％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.010重量％以下，并且氨基酸酰胺为0.012重量％以下；更为优选、构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002重量％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.002重量％以下，并且氨基酸酰胺为0.009重量％以下。而且，所谓的基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、并且基本上不含由3个以上的氨基酸构成的多肽，是指可以例举，与用HPLC分析本发明的二肽的结晶时的本发明的二肽的结晶的峰对应的区域％为：(c)构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.018％；优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.013％以下；更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.006％以下；更为优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.05％以下，并且3个以上的氨基酸构成的多肽为0.003％以下，或构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.004％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.032％；优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.003％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.026％以下；更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.018％以下；更为优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002％以下，并且由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.013％以下。所谓基本上含构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、和氨基酸酰胺，是指可以例举，与用HPLC分析本发明的二肽的结晶时的本发明的二肽的结晶的峰对应的区域％为：(d)构成成分中含有D-氨基酸的二肽不到0.004％，由3个以上的氨基酸构成的多肽不到0.041％，并且氨基酸酰胺不到0.005％；优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.003％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.026％以下，并且氨基酸酰胺为0.003％以下；更优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.013％以下，并且氨基酸酰胺为0.003％以下；更为优选构成成分中含有D-氨基酸的二肽为0.002％以下，由3个以上的氨基酸构成的多肽为0.002％以下，并且氨基酸酰胺为0.002％以下。此外，作为本发明的二肽的结晶，可以列举基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽，并且二肽占全部二肽结晶的区域％或重量％为优选99.90％以上、更优选99.91％以上、更为优选99.92％以上的二肽的结晶；以及基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、和氨基酸酰胺，并且区域％或重量％为优选99.90％以上、更优选99.91％以上、更为优选99.92％以上的二肽的结晶。作为本发明的二肽的结晶中的构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、氨基酸酰胺、和本发明的二肽的结晶的重量％的测定法，只要是可以测定上述各成分的量的方法，可以是任意一种方法，例如适合使用用HPLC等分离本发明的二肽的结晶中所含的各种成分，基于参照标准的峰面积和量，根据其面积计算各成分的量的方法。而且，对应于本发明的二肽的结晶中的构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、和氨基酸酰胺的本发明的二肽的结晶的峰的区域％，可以通过用HPLC分离上述各成分，计算对应于本发明的二肽的结晶的峰面积的各成分的峰面积来测定。作为HPLC的分析条件，例如可以例举下述分析条件：分析条件柱：InertsilODS-3V(GLscience公司制)柱温度：30℃移动相：溶液A[0.01mol/l庚烷磺酸钠、0.01mol/l磷酸二氢钾(pH2.5)]∶甲醇＝99∶1流量：1.2ml/min检测：UV210nm还可以列举有可以根据提供给分析的二肽的试样中所含的构成成分中含有D-氨基酸的二肽、由3个以上的氨基酸构成的多肽、和氨基酸酰胺的种类，适当变更移动相的溶液组成，使用采用多种溶液的浓度调配溶液，变更检测波长等，并用FMOC(fluorenylmethylchloroformate)等将试样中的物质衍生物化，检测其发光的方法等。2.本发明的二肽的结晶的制备方法本发明的结晶可以通过以下方法制备：使用具有由选自i)L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质、具有生产该蛋白质能力的微生物的培养物、或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源以及选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸共存于水性介质中，使之在该水性介质中生成、积累二肽，从该水性介质中获取二肽的结晶的方法；ii)在培养基中培养具有下述能力的微生物，所述微生物具有生成、积累选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力，以及生产具有可由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，使该微生物在该培养基中生成、积累二肽，从该培养基获取二肽的结晶的方法等。(1)本发明的制备方法中使用的蛋白质(a)作为本发明的制备方法中使用的具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质，只要是具有该活性的蛋白质，就没有特别的限定，例如，可以例举有以下[1]～[4]中记载的蛋白质：具有序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的蛋白质；由与序列号1～8任一项所示的氨基酸序列具有至少65％以上，优选80％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质；由在序列号1～8任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质；含有与序列号18所示的氨基酸序列具有80％以上，优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的的同源性的氨基酸序列，并且具有二肽合成活性的蛋白质。序列号18所示的氨基酸序列是具有序列号1～7所示的氨基酸序列的蛋白质之间的保守区域，并且是各种微生物的具有Ala-Ala连接酶活性的蛋白质的共有序列的对应的区域。因此，含有与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列并且具有生成二肽的活性的蛋白质是还具有生成二肽的活性的蛋白质。为了使含有与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质是具有生成二肽的活性的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与序列号1～7任一项所示的氨基酸序列之间的同源性理想的是具有至少65％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性。在上述内容中，由缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质可以通过采用MolecularCloning，ALaboratoryManual，ThridEdition，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)(以下、简称为分子克隆第3版)、CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下、简称为分子生物学现行操作规程)、NucleicAcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、NucleicAcidsResearch，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中记载的位点特异的变异导入法，在编码例如由序列号1～8所示的氨基酸序列构成的具有二肽生成活性的蛋白质的任一蛋白质的DNA中导入位点特异的变异来获得。缺失、取代或添加的氨基酸的数目只要是可以通过上述的位点特异的变异法等公知的方法进行缺失、取代或添加的程度的数目，就没有特别的限定，通常为1个至数十个、优选1～20个、更优选1～10个、更为优选1～5个。所谓在由序列号1～8所示的氨基酸序列构成的蛋白质中的任一个中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸，是指也可以在同一序列中的任意位置中缺失、取代或添加1个或多个氨基酸。缺失、取代或添加可以同时发生，取代或添加的氨基酸可以是天然型或非天然型。作为天然型氨基酸，可以例举有L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-组胺酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。以下，列出可以相互取代的氨基酸的例子。包含于同一组中的氨基酸可以相互取代。A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、环己基丙氨酸B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C组：天冬酰胺、谷氨酰胺D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸F组：丝氨酸、苏氨酸、同型丝氨酸G组：苯丙氨酸、酪氨酸另外，导入缺失、取代或添加上述的1个以上的氨基酸的位置只要是使具有导入了该变异的氨基酸序列的蛋白质具有二肽合成活性的位置，就没有特别限定，例如可例举与用公知的比对软件比较序列号1～8所示的氨基酸序列时，在所有氨基酸序列中的1个以上氨基酸序列中不保守的氨基酸。作为公知的比对软件，可以例举有例如包含于基因分析软件Genetyx(软件开发株式会社)中的比对分析软件。可以使用默认值作为该分析软件的分析参数。此外，作为上述的缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质并且具有生成二肽的活性的蛋白质，可以列举，例如与序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的同源性为至少65％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的蛋白质。在上述内容中，氨基酸序列或碱基序列的同源性可以采用Karlin和Altschul提出的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993)]或FASTA[MethodsEnzymol.，183，63(1990)]进行测定。基于该BLAST算法，已经开发了一般称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]。在基于BLAST以BLASTN分析碱基序列时，参数为例如Score＝100，wordlength＝12。而且，基于BLAST用BLASTX分析氨基酸序列时，参数为例如score＝50，wordlength＝3。在使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。(b)作为本发明的具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质，只要是具有该活性的蛋白质，就没有特别的限定，例如，可以例举有以下[5]～[8]中记载的蛋白质：具有序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的蛋白质，由与序列号1～8任一项所示的氨基酸序列具有至少65％以上，优选80％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质，由在序列号1～8任一项所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质，含有与序列号18所示的氨基酸序列具有80％以上，优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的的同源性的氨基酸序列，并且具有合成二肽的活性的蛋白质。序列号18所示的氨基酸序列为具有上述(a)特征的序列。因此，含有与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列的、并且具有二肽合成活性的蛋白质是还具有生成二肽的活性的蛋白质。为了含有与序列号18所示的氨基酸序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质是具有生成二肽的活性的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列与序列号1～7任一项所示的氨基酸序列之间的同源性理想的是具有至少65％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性。在上述内容中，由缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有生成二肽的活性的蛋白质，与上述(a)同样可以通过分子克隆第3版等中记载的方法获得。缺失、取代或添加的氨基酸的数目与上述(a)相同。所谓在由序列号1～8所示的氨基酸序列构成的蛋白质任一个中缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸与上述(a)相同。缺失、取代或添加可以同时发生，取代或添加的氨基酸与上述(a)相同。另外，导入缺失、取代或添加上述的1个以上氨基酸的位置只要是使导入该变异的氨基酸序列的蛋白质具有二肽合成活性的位置，就没有特别限定，例如可例举与上述(a)相同的位置。此外，作为上述缺失、取代或添加了1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质并且具有生成二肽的活性的蛋白质，可以列举与上述(a)相同的蛋白质。在上述内容中，氨基酸序列或碱基序列的同源性可以采BLAST或FASTA测定。(2)本发明的二肽的结晶的制备中使用的微生物(a)作为本发明的具有生产具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力的微生物，只要是具有生产上述(1)的(a)的蛋白质的能力的微生物，就没有特别的限定，但可以列举，例如具有生产上述(1)的(a)的[1]～[4]中任一项记载的蛋白质能力的微生物。作为选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸，优选可以列举选自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、L-Azaserine、L-theanine、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit、L-6-diazo-5-oxo-L-norleucine、Gly和β-Ala中的1种以上的氨基酸，更优选选自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit、Gly和β-Ala中的2种氨基酸，更为优选L-Ala和L-Gln。作为上述具有生产(1)的(a)的[1]～[4]任一项的蛋白质能力的微生物，可以列举，例如记载于WO2004/058960号中的具有杆菌溶素合成酶基因的属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物、优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、更优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168株(ATCC23857)、枯草芽孢杆菌ATCC15245、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌IAM1213、枯草芽孢杆菌IAM1107、枯草芽孢杆菌IAM1214、枯草芽孢杆菌ATCC9466、枯草芽孢杆菌IAM1033、枯草芽孢杆菌ATCC21555、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)IFO3022和经编码上述(1)的[1]～[4]任一项的蛋白质的DNA转化的微生物。作为编码上述(1)的[1]～[4]的蛋白质的DNA，可以列举：具有序列号9～17任一项所示的碱基序列的DNA，与具有与序列号9～17任一项所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、并且编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA、和包括与序列号19表示的碱基序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的碱基序列、并且编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA。这里所称“杂交”是DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分杂交的步骤。因此，该具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分的碱基序列可用作Northern或Southern分析的探针，或者也可以是可用作PCR分析的寡核苷酸引物使用的长度的DNA。作为探针使用的DNA，可以列举至少100碱基以上、优选200碱基以上、更优选500碱基以上的DNA，但也可以是至少10碱基以上、优选15碱基以上的DNA。DNA的杂交实验方法是公知的，例如，如果是本领域技术人员，可以按照本申请说明书确定杂交的条件。该杂交的条件可以按照分子克隆第2版、第3版(2001年)、MethodsforGeneralandMolecularBacteriolgy，ASMPress(1994)、Immunologymethodsmanual，Academicpress(Molecular)中记载以及其它多种标准的教科书进行。上述的“严格条件”，是指可以采用例如在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％的硫酸葡聚糖、和20μg/l变性的鲑鱼精子DNA的溶液中将固定了DNA的滤膜与探针DNA于42℃温育一晚后，例如在约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该滤膜的条件，但也可以使用更低的严格条件。严格条件的变化可以通过调整甲酰胺的浓度(甲酰胺的浓度降得越低，严格度越低)、改变盐浓度和温度条件进行。作为低严格条件，可以列举，例如在含有6×SSCE(20×SSCE为3mol/l的氯化钠、0.2mol/l的磷酸二水素钠、0.02mol/l的EDTA、pH7.4)、0.5％的SDS、30％的甲酰胺、100μg/l的变性的鲑鱼精子DNA的溶液中，于37℃温育一晚后，用50℃的1×SSC、0.1％SDS溶液清洗的条件。而且，作为更低严格条件，可以列举在上述低严格条件中，用高盐浓度(例如5×SSC)的溶液进行杂交后，再清洗的条件。上述各种条件，还可以通过添加、或改变用于抑制杂交实验的背景的封闭试剂来设定。上述封闭试剂的添加可以伴随杂交条件的改变以使之适应条件。作为可以在上述严格条件下杂交的DNA，可以列举，例如，用上述BLAST和FASTA等程序，基于上述参数计算时，与上述任一DNA的碱基序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA。碱基序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序测定。可以通过制作表达该DNA的重组DNA，使用将该重组DNA导入宿主细胞获得的微生物作为酶源，使该酶源和选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸共存于水性介质中，通过HPLC等分析是否在该水性介质中生成积累二肽的方法来确认与上述DNA在严格条件下杂交的DNA是编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA。(b)作为可以在本发明的制备方法中使用的具有生产具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力以及具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力的微生物，只要是具有该能力的微生物，就没有特别的限定，但是，可以列举，例如具有生产上述(1)的(b)的[5]～[8]中任一项记载的蛋白质能力的微生物，并且具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力的微生物。作为选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸，可以列举优选L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB、4-L-HYP、3-L-HYP、L-Orn、L-Cit和Gly的1种以上的氨基酸、更优选选自L-Ala、L-Gln、L-Glu、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Pro、L-Phe、L-Trp、L-Met、L-Ser、L-Thr、L-Cys、L-Asn、L-Tyr、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Asp、L-α-AB和Gly的2种氨基酸、更为优选L-Ala和L-Gln。作为具有生产具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力、和具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力的微生物，可以列举具有生产上述(1)的(b)的蛋白质能力、和具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力的微生物。作为该微生物，可以列举被编码上述(1)的(b)的[5]～[8]的蛋白质的DNA转化的微生物，并且强化了生产、蓄积选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物。作为编码(1)的(b)的[5]～[8]的蛋白质的DNA，可以列举[12]具有序列号9～17任一项所示的碱基序列的DNA、与具有与序列号9～17任一项所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交、并且编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA、和包括与序列号19表示的碱基序列具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的碱基序列、并且编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA。所谓上述“杂交”与上述(a)意义相同。通过制备表达该DNA的重组DNA，使用通过在宿主细胞中导入该重组DNA获得的微生物作为酶源，使该酶源、选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸共存于水性介质中，通过HPLC等分析该水性介质中是否生成、积累二肽的方法，可以确认与上述DNA在严格条件下杂交的DNA是编码具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA。(c)本发明的制备方法中使用的生产具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的微生物、以及具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力和由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生产二肽能力的微生物是上述(a)或(b)的微生物，同时1)具有1种以上的肽酶和1种以上的肽转运活性的蛋白质(以下、简称为肽转运蛋白质)的活性降低或丧失的微生物、或2)3种以上的肽酶的活性降低或丧失的微生物。1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质的活性降低或丧失的微生物，可以列举，只要该微生物能正常生长，降低或丧失任意1种以上的肽酶和任意1种以上的肽转运蛋白质的活性的微生物；优选1种以上9种以下、更优选1种以上7种以下、更为优选1种以上4种以下的肽酶的活性降低或丧失，并且优选1种以上5种以下、更优选1种以上3种以下、更为优选1种以上2种以下、尤为优选1种肽转运蛋白质的活性降低或丧失的微生物。作为这种该微生物，更具体的是，存在于该微生物的基因组DNA的编码肽酶的基因(以下、简称为肽酶基因)和编码肽转运蛋白质的基因(以下、肽转运蛋白质基因)中，1种以上的肽酶基因的碱基序列和1种以上的肽转运蛋白质基因的碱基序列中，由于缺失该碱基序列的全部或一部分，或该碱基序列中存在碱基的取代或添加，而导致该肽酶和该肽转运蛋白质的活性降低或丧失的微生物。所谓肽酶的活性降低，是指与上述碱基没有发生缺失、取代或添加的肽酶相比，肽分解活性最好不降低，优选与由没有发生上述碱基的缺失、取代或添加的野生型基因编码的肽酶相比，肽酶活性降低了至少20％以上、更优选50％以上、更为优选80％以上、特别优选90％以上。微生物的肽分解活性可以通过以下方法测定：使作为基质的肽与微生物菌体共存于水性介质中，进行肽分解反应后，用公知的方法例如采用HPLC的分析法等定量残存的肽量。作为上述肽酶，只要是具有肽分解活性的蛋白质可以是任意一种，可以列举，优选二肽分解活性高的蛋白质，更优选二肽酶。作为更具体的肽酶，可以列举，例如存在于大肠杆菌的具有序列号20所示的氨基酸序列的PepA、具有序列号21所示的氨基酸序列的PepB、具有序列号22所示的氨基酸序列的PepD、具有序列号23所示的氨基酸序列的PepN、PepP[GenBank登记号(以下、简称为GenBank)AAC75946]、PepQ(GenBankAAC76850)、PepE(GenBankAAC76991)、PepT(GenBankAAC74211)、Dcp(GenBankAAC74611)和IadA(GenBankAAC77284)等、存在于枯草芽孢杆菌中的AmpS(GenBankAF012285)、PepT(GenBankX99339)、YbaC(GenBankZ99104)、YcdD(GenBankZ99105)、YjbG(GenBankZ99110)、YkvY(GenBankZ99111)、YqjE(GenBankZ99116)、YwaD(GenBankZ99123)等、存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB97732、BAB97858、BAB98080、BAB98880、BAB98892、BAB99013、BAB99598和BAB99819(均为日本DNA数据库的登录号)所示的氨基酸序列的蛋白质等、存在于酿酒酵母的OCT1(GenBankNC_001143)、SPC2(GenBankNC_003143)、SPY2[Saccharomycesgenomedatabase(http://www.yeastgenome.org/)登记号L0002875]和YIM1(GenBankNC_001145)等，作为二肽酶，可以列举具有序列号20～23所示的氨基酸序列的PepA、PepB、PepD和PepN、和PepQ、PepE、IadA。而且，可以列举于序列号20～23任一项的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性并且具有肽酶活性的蛋白质作为二肽分解活性高的蛋白质。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序进行测定。而且，所谓肽转运蛋白质(peptideincorporatingprotein)的活性降低，是指与上述碱基没有发生缺失、取代或添加的DNA编码的肽转运蛋白质相比，肽转运活性最好不降低，优选与由没有发生上述碱基的缺失、取代或添加的野生型基因编码的肽转运蛋白质相比，肽转运蛋白质活性降低了至少20％以上、更优选50％以上、更为优选80％以上、特别优选90％以上。微生物的肽转运活性可以通过以下方法测定：使作为基质的肽与微生物菌体共存于水性介质中，进行肽转运反应后，用公知的方法例如采用HPLC的分析法等定量水性介质中残存的肽量。作为上述肽转运蛋白质，只要是染色体DNA上形成操纵子的基因所编码的蛋白质、通过在细胞膜上形成复合体表达二肽转运活性的蛋白质、和作为单独的蛋白质具有肽转运活性的蛋白质等与微生物的肽转运相关的蛋白质，可以是任意一种，优选可以列举肽转运活性高的蛋白质。作为更具体的肽转运蛋白质，例如存在于大肠杆菌的具有序列号24所示的氨基酸序列的DppA、具有序列号25所示的氨基酸序列的DppB、具有序列号26所示的氨基酸序列的DppC、具有序列号27所示的氨基酸序列的DppD、具有序列号28所示的氨基酸序列的DppF、OppA(GenBankAAC76569)、OppB(GenBankAAC76568)、OppC(GenBankAAC76567)、OppD(GenBankAAC76566)、OppF(GenBankAAC76565)、YddO(GenBankAAC74556)、YddP(GenBankAAC74557)、YddQ(GenBankAAC74558)、YddR(GenBankAAC74559)、YddS(GenBankAAC74560)、YbiK(GenBankAAC73915)、MppA(GenBankAAC74411)、SapA(GenBankAAC74376)、SapB(GenBankAAC74375)、SapC(GenBankAAC74374)、SapD(GenBankAAC74373)、和SapF(GenBankAAC74372)等、存在于枯草芽孢杆菌的DppA(GenBankCAA40002)、DppB(GenBankCAA40003)、DppC(GenBankCAA40004)、DppD(GenBankCAA40005)、DppE(GenBankCAA40006)、OppA(GenBankCAA39787)、OppB(GenBankCAA39788)、OppC(GenBankCAA39789)、OppD(GenBankCAA39790)、OppF(GenBankCAA39791)、AppA(GenBankCAA62358)、AppB(GenBankCAA62359)、AppC(GenBankCAA62360)、AppD(GenBankCAA62356)、AppF(GenBankCAA62357)、YclF(GenBankCAB12175)和YkfD(GenBankCAB13157)等、存在于谷氨酸棒杆菌的具有BAB99048、BAB99383、BAB99384、BAB99385、BAB99713、BAB99714、BAB99715、BAB99830、BAB99831、BAB99832(均为日本DNA数据库的登录号)所示的氨基酸序列的蛋白质等、存在于酿酒酵母的OPT1(GenBankNP_012323)、OPT2(GenBankNP_015520)和PTR2(GenBankCAA82172)等，而且，作为肽转运活性高的蛋白质，可以例举有具有序列号24～28所示的氨基酸序列的DppA、DppB、DppC、DppD、DppF和与它们的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的蛋白质。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序进行测定。作为3种以上的肽酶的活性降低或丧失的微生物，可以列举只要该微生物能正常地生长，任意3种以上的肽酶的活性降低或丧失的微生物，优选，可以列举3种以上9种以下、更优选3种以上6种以下、更为优选3种或4种的肽酶的活性降低或丧失的微生物。作为具体的肽酶，可以列举存在于上述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母中的肽酶和二肽酶。而且，可以列举与序列号20～23任一项的氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更为优选98％以上、特别优选99％以上的同源性的氨基酸序列构成的、并且具有肽酶活性的蛋白质作为二肽分解活性高的蛋白质。氨基酸序列的同源性可以使用上述BLAST或FASTA等程序进行测定。(3)在本发明的制备方法中使用的微生物的制备方法(a)具有生产下述蛋白质的能力的微生物的制备方法，所述蛋白质具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性WO2004/058960号中记载的具有杆菌溶素合成酶基因的枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、具体的是枯草芽孢杆菌ATCC23857、枯草芽孢杆菌ATCC15245、枯草芽孢杆菌ATCC6633、枯草芽孢杆菌IAM1213、枯草芽孢杆菌IAM1107、枯草芽孢杆菌IAM1214、枯草芽孢杆菌ATCC9466、枯草芽孢杆菌IAM1033、枯草芽孢杆菌ATCC21555、淀粉液化芽孢杆菌IFO3022由于具有生产下述蛋白质的能力，所述蛋白质具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，因此所述微生物可以用于本发明的制备方法。而且，具有生产下述蛋白质能力的微生物还可以通过用编码该蛋白质的DNA转化宿主微生物来获得，其中所述蛋白质具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性。编码下述蛋白质的DNA的制备方法，所述蛋白质具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的DNA可以通过WO2004/058960号记载的方法进行制备，例如，使用可以基于序列号9～17表示的碱基序列进行设计的探针，使用基于与微生物、优选属于芽孢杆菌属的微生物的染色体DNA文库Southern杂交、或序列号9～17表示的碱基序列设计的引物DNA，以微生物、优选属于芽孢杆菌属的微生物的染色体DNA作为模板的PCR[PCRProtocols，AcademicPress(1990)]、以及，对于各种的基因序列数据库，检索与编码序列号1～8任一项所示的氨基酸序列的DNA的碱基序列具有75％以上、优选85％以上、更优选90％以上、更为优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同源性的序列，基于由该检索获得的碱基序列，通过上述方法从具有该碱基序列的生物的染色体DNA、cDNA文库等中获得编码具有生成二肽的活性的蛋白质的DNA。将获得的DNA照原样，或用适当的限制性内切酶等切断，通过常规方法整合到载体中，将获得的重组DNA导入到宿主细胞后、通过常用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]或使用373A.DNA测序仪(Perkin-Elmer公司制)等的碱基序列分析装置进行分析，可以测定该DNA的碱基序列。测定碱基序列的结果是，获得的DNA为部分长度时，通过使用该部分长度DNA作为探针、针对染色体DNA文库的Southern杂交法等，可以获得全长DNA。进而，还可以基于测定的DNA的碱基序列，通过使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成装置等进行化学合成来获得目的DNA。作为如上述方式获得的DNA，可以列举，例如、具有序列号9～17表示的碱基序列的DNA。作为整合了上述的DNA的载体，可以列举pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司制)、pDIRECT[NucleicAcidsRes.，18，6069(1990)]、pCR-ScriptAmpSK(+)(Stratagene公司制)、pT7Blue(Novagen公司制)、pCRII(Invitrogen公司制)和pCR-TRAP(Genhunter公司制)等。作为大肠杆菌，例如可举大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌ATCC12435、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ME8415等。作为重组体DNA的导入方法，只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法可以使用任一种方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。被编码具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA转化的微生物的制备方法以由上述[1]的方法获得的DNA为基础，根据需要，制备含有编码具有二肽合成活性的蛋白质的DNA的部分的适当长度的DNA片段。而且，为了使编码该蛋白质的部分的碱基序列成为宿主的表达中最适的密码子，通过取代碱基可以使该蛋白质的生产率提高。通过将该DNA片段插入到适当表达载体的启动子的下游，制作重组体DNA。通过将该重组体DNA导入到适合该表达载体的宿主细胞，可以得到生产具有二肽合成活性的蛋白质的转化体。作为宿主细胞，可以使用细菌和酵母等，只要是可以表达目的基因的微生物都可以使用。作为表达载体，可以使用可在上述宿主细胞自我复制或可整合到染色体中，在可转录编码具有生成二肽活性的蛋白质的DNA的位置含有启动子的载体。使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，具有编码具有生成二肽活性的蛋白质的DNA的重组体DNA优选在原核生物中可自我复制的同时，由启动子、核糖体结合序列、编码具有生成二肽活性的蛋白质的DNA，由转录终止序列构成的重组体DNA。也可以含有控制启动子的基因。作为表达载体，例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(都是BoehringerMannheim公司制)、pHelixl(RocheDiagnostics公司制)、pKK233-2(AmershamPharmaciaBiotech公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(Qiagen公司制)、pET-3(Novagen公司制)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIIKS(-)(Stratagene公司制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制备]、pPAC31(WO98/12343)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(宝酒造公司制)、pUC118(宝酒造公司制)、pPA1(特开昭63-233798)等。作为启动子，只要是在大肠杆菌等宿主细胞中可发挥作用的，无论什么样的启动子都可以。例如可例举trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌和噬菌体等的启动子、SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。也可以使用使两个Ptrp串联(直列)的启动子、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子那样人为设计改变的启动子等。作为启动子，也可以使用用于在芽孢杆菌属细菌中表达的xylA启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，35，594-599(1991)]和用于在棒杆菌属细菌中表达的P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679(2000)]等。优选使用将作为核糖体结合序列的S-D(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子的间距调节到适当距离(例如6～18核酸)的质粒。在使编码具有二肽合成活性的蛋白质的DNA结合于表达载体的重组体DNA中，不一定需要转录终止序列，但最好是紧接在结构基因的下面配置终止序列。作为这样的重组体DNA，可以列举记载于WO2004/058960中的pPE43。作为宿主细胞使用的原核生物，如使用属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、或棒杆菌属等的微生物、例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、枯草芽孢杆菌ATCC33712、巨大芽孢杆菌、球形芽孢杆菌FERMBP-6030、淀粉液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297等。作为导入重组体DNA的方法，只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法，可以使用任一个方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。使用属于酵母属的菌株作为宿主细胞时，作为表达载体，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作为启动子，只要是在属于酵母属的菌株中发挥作用的，可以使用任一个，例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。作为宿主细胞，可以列举如属于酵母属等的菌株，具体来说，可以列举酿酒酵母等。作为重组体DNA的导入方法，只要是可向酵母导入DNA的方法都可以使用，例如电穿孔法[MethodsEnzymol.，194，182(1990)]、spheroplast法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889(1984)]、醋酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的制备方法具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质可以通过以下方式制备：在培养基中培养可以通过用可以用上述[1]的方法制备的编码该蛋白质的DNA转化宿主细胞获得的转化体，从培养物中分离、纯化该蛋白质。作为宿主细胞，只要是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞等、植物细胞等可以表达编码该蛋白质的基因的细胞，可以使用任意一种，优选，可以列举细菌、更优选原核生物、更为优选属于埃希氏杆菌属的原核生物。作为在培养基中培养上述转化体的方法、和从培养物中分离纯化该蛋白质的方法，可以列举公知方法、例如WO2004/058960号中记载的方法。(b)具有下述能力的微生物的制备方法，所述能力为生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力和生产由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力本发明的制备方法中使用的具有下述能力的微生物，所述微生物具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力和具有生产由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，在微生物原来具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力时，还可以通过用编码具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的DNA转化的方法获得该微生物，例如可以通过以下方法获得：(i)通过公知的方法人为强化下述能力的微生物的生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的方法，所述微生物具有生产由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力、(ii)通过用编码下述蛋白质的DNA转化生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力被强化的微生物株的方法等，所述蛋白质具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性。具有生产具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力的微生物可以用与上述(a)的具有生产由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质能力的微生物的制备方法相同的方法制备。具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物、以及用公知的方法强化了生产该氨基酸的能力的微生物可以是用公知的方法被人为改变成生产、蓄积该氨基酸的微生物，作为该公知的方法，可以例举有：缓和或解除至少一种控制选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的生物合成的机制中的方法、表达强化至少一种与该氨基酸的生物合成相关的酶的方法、使至少一种与该氨基酸的生物合成相关的酶基因的拷贝数增加的方法、从该氨基酸的生物合成途径中弱化或阻断至少一种分支到该氨基酸的其它的代谢产物的代谢途径的方法、和选择与野生型株相比，对该氨基酸的类似物抗性度高的细胞株的方法等，上述公知的方法可以单独或组合使用。上述[1]的具体的方法记载于Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)、J.Bacteriol.，110，761-763(1972)和Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)等中。上述[2]的具体方法记载于Agric.Biol.Chem.，43，105-111(1979)和J.Bacteriol.，110，761-763(1972)等中。上述[3]的具体的方法记载于Appl.Microbiol.Biotechnol.，39，318-323(1993)和Agric.Biol.Chem.，39，371-377(1987)等中。上述[4]的具体的方法记载于Appl.Environ.Micribiol.，38，181-190(1979)和Agric.Biol.Chem.，42，1773-1778(1978)等中。上述[5]的具体的方法记载于Agric.Biol.Chem.，36，1675-1684(1972)、Agric.Biol.Chem.，41，109-116(1977)、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)和Agric.Biol.Chem.，51，2089-2094(1987)等中。可以参考上述文献等制备具有生产、积累各种氨基酸的能力的微生物。进而，通过上述[1]～[5]任一项或它们的组合的方法制备具有生产、积累氨基酸的能力的微生物的制备方法，在Biotechnology2nded.，Vol.6，ProductsofPrimaryMetabolism(VCHVerlagsgesellschaftmbH，Weinheim，1996)section14a，14b和AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology79，1-35(2003)、氨基酸发酵、学会出版中心、相田浩等人(1986)中记载了许多实例，而且除上述以外，具体的制备具有生产、积累氨基酸能力的微生物的制备方法已有特开2003-164297、Agric.Biol.Chem.，39，153-160(1975)、Agric.Biol.Chem.，39，1149-1153(1975)、特开昭58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.，4，272-283(1958)、特开昭63-94985、Agric.Biol.Chem.，37，2013-2023(1973)、WO97/15673、特开昭56-18596、特开昭56-144092和特表2003-511086等多报道，通过参照上述文献等可以制备具有生产、蓄积选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物。作为可以由上述方法制备的具有生产氨基酸能力的微生物，可以列举，例如作为L-谷氨酰胺生产菌的缺失了glnE基因和/或glnB基因的微生物、作为L-丙氨酸生产菌的丙氨酸脱氢酶基因(ald基因)的表达被强化的微生物、作为L-脯氨酸生产微生物的表达苯丙氨酸的脱敏作用型pheA基因和/或酪氨酸的脱敏作用型aroF基因的微生物等。作为具有生产上述氨基酸能力的微生物，如果是可以应用上述[1]～[5]的方法的微生物或具有上述遗传特征的微生物，可以是任意一种，优选可以列举原核生物、更优选细菌。作为原核生物，可以列举属于埃希氏菌(Escherichia)属，沙雷氏菌属(Serratia)，芽孢杆菌属，短杆菌属(Brevibacterium)，棒状杆菌属(Corynebacterium)，微杆菌属(Microbacterium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)，鱼腥蓝细菌属(Anabaena)，アナシステイス(Anacystis)属、节杆菌(Arthrobacter)属、固氮杆菌属(Azotobacter)，着色菌属(Chromatium)，欧文氏菌属(Erwinia)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，席蓝细菌属(Phormidium)，红细菌属(Rhodobacter)，红甲单胞菌属(Rhodopseudomonas)，红螺菌属(Rhodospirillum)，栅藻属(Scenedesmus)，链霉菌属(Streptomyces)，聚球蓝细菌属(Synechoccus)和发酵单胞菌属(Zymomonas)的微生物。例如、可以列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、未成熟短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、产乳酸短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)、无花果沙雷氏菌(Serratiaficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、假单胞菌·エルギノ一サ(Pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacteriumrubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaenadoliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anabaenaflos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、球形节杆菌(Arthrobacterglobformis)，Arthrobacterhydrocarbonglutamicus，迈索尔节杆菌(Arthrobactermysorens)，烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)，石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)，原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)，玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacterroseoparaffinus)，硫磺节杆菌(Arthrobactersulfureus)，产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)，巴氏着色菌(Chromatiumbuderi)，微温着色菌(Chromatiumtepidum)，酒色着色菌(Chromatiumvinosum)，沃氏着色菌(Chromatiumwarmingii)，Chromatiumfluviatile，噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)，胡萝卜软腐欧文氏菌(erwiniacarotovora)，菠萝欧文氏菌(Erwiniaananas)，草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)，Erwiniapunctata，Erwiniaterreus，罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)，扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)，席蓝细菌属种(Phormidiumsp.)ATCC29409，荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)，类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，生芽红假单胞菌(Rhodopseudomonasblastica)，海红菌(Rhodopseudomonasmarina)，血色红假单孢菌(Rhodopseudomonaspalustris)，深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)，需盐红螺菌(Rhodospirllumsalexigens)，盐场红螺菌(Rhodospirillumsalinarum)，产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)，金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)，金色链霉菌(Streptomycesaureus)，杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)，灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)，灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)，浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)，橄榄灰链霉菌(Streptomycesolivogriseus)，枝链霉菌(Streptomycesrameus)，田无链霉菌(Streptomycestanashiensis)，酒红链霉菌(Streptomycesvinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)等，作为优选原核生物，可以列举属于埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属或链霉菌属等的细菌、例如，属于上述埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属或链霉菌属等的种，作为更优选的细菌，可以列举大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、产乳酸棒杆菌、黄色棒杆菌、棒杆菌·エフイカシス、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、恶臭假单胞菌、Pseudomonasaeruginosa、Streptomycesセリカラ一或浅青紫链霉菌，特别优选大肠杆菌。作为具有生产L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力的微生物的具体例子，可以列举作为L-谷氨酰胺生产株的后述大肠杆菌JGLE1和大肠杆菌JGLBE1等、作为L-丙氨酸生产株的携带ald基因表达质粒的大肠杆菌JM101株等、作为L-谷氨酰胺和L-丙氨酸生产株的携带ald基因表达质粒的大肠杆菌JGLE1和大肠杆菌JGLBE1等。作为具有生产、蓄积选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物的具体的例子，可以例举有作为L-谷氨酸生产株的FERMBP-5807和ATCC13032等、作为L-谷氨酰胺生产株的FERMP-4806和ATCC14751等、作为L-苏氨酸生产株的ATCC21148、ATCC21277和ATCC21650等、作为L-赖氨酸生产株的FERMP-5084和ATCC13286等、作为L-蛋氨酸生产株的FERMP-5479、VKPMB-2175和ATCC21608等、作为L-异亮氨酸生产株的FERMBP-3757和ATCC14310等、作为L-缬氨酸生产株的ATCC13005和ATCC19561等、作为L-亮氨酸生产株的FERMBP-4704和ATCC21302等、作为L-丙氨酸生产株的FERMBP-4121和ATCC15108等、作为L-丝氨酸生产株的ATCC21523和FERMBP-6576等、作为L-脯氨酸生产株的FERMBP-2807和ATCC19224等、作为L-精氨酸生产株的FERMP-5616和ATCC21831等、作为L-鸟氨酸生产株的ATCC13232等、作为L-组胺酸生产株的FERMBP-6674和ATCC21607等、作为L-色氨酸生产株的DSM10118、DSM10121、DSM10123和FERMBP-1777等、作为L-苯丙氨酸生产株的ATCC13281和ATCC21669等、作为L-酪氨酸生产株的ATCC21652等、作为L-半胱氨酸生产株的W3110/pHC34(特表2003-511086记载)等、作为L-4-羟基脯氨酸生产株的WO96/27669记载的大肠杆菌SOLR/pRH71等、作为L-3-羟基脯氨酸生产株的FERMBP-5026和FERMBP-5409等、作为L-瓜氨酸生产株的FERMP-5643和FERMP-1645等。而且，上述FERM编号表示的菌株可以从独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本)获得、ATCC编号表示的菌株可以从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(美国)获得、VKPM编号表示的菌株可以从RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(俄罗斯)获得、DSM编号表示的菌株可以从DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(德国)获得。通过采用可以通过上述(a)的[1]的方法获得的DNA，用上述(a)的[2]的方法转化上述代表具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物株，可以制备本发明的制备方法中使用的微生物。(c)具有肽酶和肽转运活性的蛋白质的活性降低或丧失的微生物的制备方法作为在本发明的制备方法中使用的微生物，可以列举在通过上述(a)或(b)的方法制备的微生物中，具有1种以上的肽酶和1种以上的肽转运活性的蛋白质(以下、简称为肽转运蛋白质)的活性降低或丧失的微生物、或3种以上的肽酶的活性降低或丧失微生物。该微生物可以通过以下方法获得：如(i)通过上述(a)的方法给予1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质的功能降低或丧失了的微生物、或3种以上的肽酶的功能降低或丧失了的微生物生产具有生成二肽的活性的蛋白质的能力的方法、(ii)使可以通过上述(a)的方法制备的具有生产生成二肽的活性的蛋白质的能力的微生物的、a)1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质、或b)3种以上的肽酶、的功能降低或丧失的方法、(iii)通过上述(b)的方法给予1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质的功能降低或丧失了的微生物、或由3种以上的肽酶的功能降低或丧失了的微生物生产具有生成二肽的活性的蛋白质的能力、和具有生成积累选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的方法、以及(iv)使可以通过上述(b)的方法制备的具有生产具有生成二肽的活性的蛋白质的能力、和具有生产、蓄积选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力的微生物的a)1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质、或b)3种以上的肽酶的功能降低或丧失方法等。肽酶和肽转运蛋白质的活性降低或丧失了的微生物只要是可以获得该微生物的方法，其获得方法就没有限制，但是，可以通过例如在以下所示的微生物的染色体DNA的肽酶基因和肽转运蛋白质基因中导入碱基的缺失、取代或添加的方法来获得。作为在微生物的染色体DNA的基因中导入碱基的缺失、取代或添加的方法，可以列举利用同源重组的方法。作为一般的利用同源重组的方法，可以列举采用可以通过将导入了碱基的缺失、取代或添加的变异基因与带有在要导入碱基的缺失等的宿主细胞内无法自我复制的抗药性基因的质粒DNA连接进行制备的同源重组用质粒的方法。将该同源重组用质粒通过常用方法导入宿主细胞后，以抗药性作为指标，选择通过同源重组在染色体DNA上整合了该同源重组用质粒的转化株。将得到的转化株在不含有该药物的培养基中培养数小时～1天培养后，涂布于含有该药物琼脂培养基和不含有该药物的琼脂培养基上，通过选择在前者培养基中不生长，而在后者培养基中可以生长的菌株，可以获得在染色体DNA上出现第2次同源重组的菌株。通过对染色体DNA上导入了缺失等的基因存在的区域的碱基序列进行测定，能够确认染色体DNA上的目的基因中导入碱基的缺失、取代或添加。作为通过上述方法，可以在染色体DNA上的目的基因中导入碱基缺失、取代或添加的微生物，可以列举，例如属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属的微生物。另外，作为利用对多个基因有效导入碱基缺失、取代或添加的同源重组的方法，可以列举如使用直链DNA的方法。具体来说，是使含有要导入的碱基的缺失、取代或添加的基因的直链DNA转运到细胞内，在染色体DNA与导入了的直链DNA之间发生同源重组的方法。本方法只要是可有效整合直链DNA的微生物，可运用任一种微生物，作为优选的微生物，可以列举，例如用埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物、更优选大肠杆菌、特别优选表达来自λ噬菌体的重组蛋白质组(Red重组系统)的大肠杆菌。作为表达λRed重组系统的大肠杆菌，如带有作为含有λRed重组系统基因的质粒DNA的pKD46[从大肠杆菌基因贮存中心(美国耶鲁大学)可获得]的大肠杆菌JM101株等。作为在同源重组中使用的DNA，可以列举：在抗药性基因的两端具有存在于作为碱基缺失、取代或添加导入对象的染色体DNA上区域的两外侧的DNA或具有与该DNA有同源性的DNA的直链DNA、直接连接了存在于作为碱基缺失、取代或添加导入对象的染色体DNA上区域两外侧的DNA或与该DNA具有同源性的DNA的直链DNA、在抗药性基因和阴性筛选中能够使用的基因的两端具有存在于作为碱基缺失、取代或添加导入对象的染色体DNA上区域两外侧的DNA或与该DNA具有同源性的DNA的直链DNA、在上述[1]的直链DNA，在存在于抗药性基因和染色体DNA上的区域的两外侧的DNA或与该DNA有同源性的DNA之间，以及具有来自酵母的Flp重组酶[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，82，5875(1985)]识别的碱基序列的DNA。作为抗药性基因，只要是对于宿主微生物表现出敏感性的药物赋予抗药性的抗药性基因，可以使用任一种抗药性基因。宿主微生物使用大肠杆菌时，作为抗药性基因，可以列举，例如卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、链霉素抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因等。所谓阴性筛选中可使用的基因指的是使该基因在宿主微生物表达时，在一定培养条件下，导致该微生物致死的基因，作为该基因，可以列举，例如来自属于芽孢杆菌属的微生物的sacB基因[Appl.Environ.Microbiol.，59，1361-1366(1993)]和来自属于埃希氏菌属的微生物的rpsL基因[Genomics，72，99-104(2001)]等。存在于上述直链DNA的两末端的位于成为染色体DNA上取代或缺失导入对象的区域两端外侧的DNA或与该DNA有同源性的DNA在直链DNA中在与染色体DNA上方向相同方向上配置，其长度优选10bp～100bp左右，更优选20bp～50bp左右，再优选30～40bp左右。所谓来自酵母的Flp重组酶识别的碱基序列只要是该蛋白质识别、催化同源重组的碱基序列，没有特别限定，优选具有序列编号38表示的碱基序列的DNA和具有在该DNA中缺失、取代或添加了1个～数个碱基的碱基序列，而且具有来自酵母的Flp重组酶识别的、催化同源重组的碱基序列的DNA。所谓具有同源性的DNA，上述直链DNA是在染色体DNA上的目的区域中，同源重组发生程度具有同一性的DNA，作为具体的同源性，可以列举，例如具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、、更为优选98％以上、特别优选99％以上、最优选100％同源性的DNA。上述碱基序列的同源性可以使用上述的BLAST或FASTA等程序测定。上述直链DNA片段可以通过PCR制作。另外，还可以在将含有上述直链DNA的DNA在质粒上构建后，通过限制性内切酶处理获得目的直链DNA。作为向微生物的染色体DNA导入碱基缺失、取代或添加的方法，可以列举例如以下的方法1～4：方法1：将上述[1]或[2]的直链DNA导入宿主微生物，通过以抗药性为指标选择该直链DNA通过同源重组插入到染色体DNA上的转化株的方法。方法2：向通过上述方法1得到的转化株导入直接连接了存在于作为碱基的缺失、取代或添加的导入对象的染色体DNA上区域两外侧的DNA或与该DNA有同源性的DNA的DNA，通过消除利用该方法插入到染色体DNA上的药物基因，使微生物的染色体DNA上的区域取代或缺失的方法。方法3：a)将上述[3]的直链DNA导入宿主微生物，以抗药性为指标选择该直链DNA通过同源重组插入到染色体DNA上的转化株，b)合成在与染色体DNA上的方向同一方向上连接了与位于染色体DNA上的取代或缺失对象区域两端外侧的DNA有同源性的DNA的DNA，导入到上述a)得到的转化株，c)在阴性筛选中可以使用的基因表达的条件下，培养进行了上述b)操作的转化株，作为在抗药性基因和阴性筛选中能够使用的基因从染色体DNA上被删除的菌株，选择在该培养中可生长的菌株的方法。方法4：a)将上述[4]的直链DNA导入宿主微生物，以抗药性为指标，选择该直链DNA通过同源重组插入到染色体DNA上的转化株，b)将Flp重组酶基因表达质粒导入到上述a)得到的转化株中，使该基因表达后，获得对上述a)使用的药物具有敏感性的菌株的方法。作为在上述方法中使用的将直链DNA导入宿主微生物的方法，只要是向该微生物导入DNA的方法，可以使用任一个方法，例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法[NucleicAcidsRes.，16，6127(1988)]等。可在方法2或方法3b)使用的DNA中，通过使用在该DNA的中央部附近整合要插入到染色体DNA上的任意基因的DNA，在消除抗药性基因等的同时，可以将任意基因插入到染色体DNA上。上述方法2～4中，由于是在最终得到的转化株的染色体DNA上不留下在抗药性基因和阴性筛选中可以使用的基因等外源基因的方法，所以通过使用该方法，使用在同一的抗药性基因和阴性筛选中使用的基因，通过反复进行上述操作、能够制造在染色体DNA上位置不同的2个以上区域具有碱基缺失、取代或添加的微生物。(4)本发明的二肽的结晶的制备方法(a)可以通过以下方法制备本发明的二肽的结晶：使用具有由选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质、具有生产该蛋白质能力的微生物的培养物、或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源以及选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸中的1种以上的氨基酸共存于水性介质中，使之在该水性介质中生成积累二肽，从该水性介质中收集二肽的结晶。该微生物的培养物可以通过在培养基中培养该微生物获得，培养方法可以按照在微生物的培养中常规的方法进行。也就是说，如果是含有该微生物可以同化的碳源、氮源、无机盐类等，能够有效进行该微生物的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基的任意一种。作为碳源，可以是该微生物可以同化的碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些物质的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、正丙醇等醇类等。作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解产物、豆饼和豆饼水解产物、各种发酵菌体、和其消化物等。作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙等。通常在振荡培养或在深度通气搅拌培养等需氧条件下进行培养。培养温度优选为15～40℃，培养时间通常是5小时至7天。在培养过程中，将pH维持在3.0～9.0。使用有机酸或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行pH调节。而且，培养中可以根据需要，在培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。当培养经采用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化的微生物时，根据需要，还可以向培养基中加入诱导物。例如，在培养经采用lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等；在培养经采用trp启动子的表达载体转化的微生物时，可以向培养基中加入吲哚丙烯酸等。在上述制备方法中，使用具有生成二肽的活性的蛋白质作为酶源时，作为底物使用的每1mg氨基酸添加0.01～100mg该酶源、优选0.1mg～10mg，根据需要可以在反应液中添加0.5mmol～10mol/L浓度的ATP。在上述制备方法中，在水性介质中在一开始或反应途中添加终浓度为0.1～500g/L、优选0.2～200g/L的作为底物使用的氨基酸。作为可以在上述制备方法中使用的水性介质，只要不抑制二肽的生成反应，任意成分、组成的水性介质都可以，例如、可以列举水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液等。而且，还可以含有甲醇、乙醇等醇类、醋酸乙酯等酯类、丙酮等甲酮类、乙酰胺基等酰胺基类。而且，使用微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源时，除上述水性介质外，还可以使用作为酶源使用的微生物的培养液作为水性介质，作为ATP的供给源，可以在水性介质中添加通过微生物代谢可以生产ATP化合物、例如葡萄糖等糖类、乙醇等醇类、醋酸等有机酸类等。进而，根据需要，还可以在水性介质中添加表面活性剂或有机溶剂。作为表面活性剂，如果是聚氧乙烯十八烷基胺(例如NymeenS-215，日本油脂公司制)等非离子表面活性剂，例如溴化十六烷基三甲铵和烷基二甲基苄基氯化铵(例如cationF2-40E，日本油脂公司制)等阳离子表面活性剂，例如月桂酰肌氨酸盐等阴离子表面活性剂，和例如烷基二甲胺(例如叔胺FB，日本油脂公司制)等叔胺等促进二肽的生成的物质可以是任意一种，它们可以单独使用或者也可以组合使用。表面活性剂通常以0.1至50g/l的浓度使用。作为有机溶剂，可例举有二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、醋酸乙酯等，通常以0.1至50m/l的浓度使用。使用培养物或该培养物的处理物作为酶源时，该酶源的量根据当该酶源的比活性等而不同，例如、每1mg作为底物使用的氨基酸添加5～1000mg、优选10～400mg的湿菌体重量。作为在本发明的制备方法中使用的微生物的培养物的处理物，可以列举通过培养上述(2)的微生物的培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、通过对该培养物离心分离、或过滤等获得的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械的磨碎处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、和含有作为该菌体的固定化物等的酶源的与该微生物具有相同功能的活菌体的培养物的处理物。二肽的生成反应在水性介质中、以pH5～11、优选pH6～10、20～65℃、优选25～55℃、更优选30～45℃的条件通常进行1分钟～150小时、优选3分钟～120小时、更优选30分钟～100小时。作为收集在水性介质中生成、积累的本发明的二肽的结晶的方法，只要是可以获得构成成分中基本上不含含有D-氨基酸的二肽和3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶、或可以获得基本上不含氨基酸酰胺的二肽的结晶，没有特别的限制，例如，可以列举使用蛋白质作为酶源时，照原样使用、使用培养物或该培养物的处理物作为酶源时，通过离心分离或过滤除去菌体后、通过用于分离夹杂的氨基酸和多肽的合成吸附剂、阳离子交换树脂和阴离子交换树脂等离子交换树脂、活性碳对含有本发明的二肽的溶液进行处理、结晶处理，并且根据需要单独或组合进行用于除去特定的夹杂物的处理后、结晶目的二肽的方法。没有特别的限定，例如，可以列举非极性的多孔的吸附树脂，具体可以列举HP10、HP20等DiaionHP系列(三菱化学公司制)、SP800、SP825等DiaionSP800系列(三菱化学公司制)、SP205、SP207、SP207S等DiaionSP200系列(三菱化学公司制)、和XAD4、XAD1600等离子交换树脂XAD系列(RohmandHaas公司制)等。作为阳离子交换树脂，只要是可以分离目的二肽和夹杂物的，没有特别的限制，作为强酸性阳离子交换树脂，可以列举124Na、252Na等离子交换树脂IR系列(Organo公司制)、MarathonC、XUS-40232.01等Dowex(Dow化学公司制)等、作为弱酸性阳离子交换树脂，可以列举IRC50、IRC70等离子交换树脂IRC系列(Rohm&Haas公司制)、WK40等WK系列(三菱化学公司制)等。作为阴离子交换树脂，只要是可以分离目的二肽和夹杂物的，没有特别的限制，作为强碱基性阴离子交换树脂，可以列举PA306、PA312、PA412等DiaionPA系列(三菱化学公司制)等、作为弱碱基性阴离子交换树脂，可以列举WA10、WA20、WA30等DiaionWA系列(三菱化学公司制)等。作为收集L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶的方法，可以列举，例如，使用通过以下方法获得的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶的方法：反应终止后、反应液中含有菌体时，通过离心分离或过滤等除去菌体后，用含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的溶液通过强酸性阳离子交换树脂、例如MarathonC中，获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的洗脱级分后，将该洗脱级分通过弱酸性阳离子、例如IRC50上，获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的洗脱级分，然后将该洗脱级分装到强碱性阴离子交换树脂(例如PA412)上。作为用于除去特定的夹杂物的处理，可以列举例如，水性介质中残留作为底物使用的选自L-氨基酸、甘氨酸和β-丙氨酸的氨基酸时，用于除去这种残留的氨基酸的处理。作为该处理，如果是例如残留L-谷氨酰胺时，可以除去L-谷氨酰胺的处理，可以是任意一种处理，但是优选树脂处理、加热处理、酸或碱基处理等可以分解除去L-谷氨酰L-谷氨酰胺的处理、更优选加热处理。作为具体的热处理方法，可以列举使用L-丙氨酸和L-谷氨酰胺作为底物，使之在水性介质中生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、在55℃～120℃处理该水性介质5分钟～24小时、优选于70℃～100℃处理15分钟～6小时的方法。作为使二肽结晶的方法，只要是可以结晶目的二肽的方法，没有特别的限定，但可以列举在含有二肽的水溶液中添加甲醇、乙醇和正丙醇等低级醇、丙酮等甲酮类、和四氢呋喃等溶剂的方法。结晶条件，只要是可以使结结晶出的条件就没有特别的限定，但可以列举在20～70℃下、添加含有二肽的水溶液的2～5倍体积的结晶用溶剂，如果需要再将溶液冷却至10～30℃的条件。例如、作为结晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，可以列举在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中，于20～70℃、优选50～70℃的温度下添加该水溶液的约2～5倍体积、优选3～4倍体积的甲醇后、冷却至10～30℃、优选15～25℃的方法。而且结晶时，可以在含有作为晶种的二肽的溶液中加入目的二肽的结晶，例如在结晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺时，在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中添加该水溶液的0.3～0.5倍体积的甲醇后、添加该水溶液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的1～5重量％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶，然后再添加甲醇至总体积为原水溶液的4倍体积的方法。(b)通过在培养基中培养具有下述能力的微生物，所述微生物具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸能力、和生产具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，使微生物在该培养基中生成积累二肽后、从该培养基中收集二肽的结晶，可以获得本发明的二肽的结晶。作为培养该微生物的方法，可以列举上述(a)的方法。但是，在该微生物的培养中使用的培养基中，不必含有构成目的二肽的氨基酸，但存在着天然培养基、或用于培养氨基酸要求性株的培养基中含有该氨基酸的情况。在本发明的制备方法中使用的培养基中可以含有本发明中可使用的微生物、其成长所需要的量的氨基酸。也就是说，常规的培养基中所含的氨基酸的量，由于与可以使用的微生物所生成积累的该氨基酸的量相比，非常少，因此常规培养基中所含的该氨基酸的量，由于本发明制备的二肽的生产量基本上不受该氨基酸的有无而改变，故在本发明的制备方法中使用的培养基中可以含有这种程度的该氨基酸。作为可以在本发明中使用的培养基中所含的氨基酸量，例如，如果是天然培养基，通常可以含有不到2.5g/L、优选0.5g/L以下、更优选0.1g/L以下、更为优选20mg/L以下的该氨基酸、如果是合成培养基，通常可含有1g/l以下、优选50mg/L以下、更优选1mg/L以下、更为优选0.5mg/L以下的该氨基酸。但是，在用本发明的制备方法制备2种不同的氨基酸构成的二肽时，所使用的微生物只有生产构成该二肽的氨基酸中的1种氨基酸的能力时，本发明中使用的培养基中可以添加该微生物无法生成、积累的残留的1种氨基酸。此时添加的氨基酸的量通常为0.5g/L～100g/L、优选2g/L～50g/L。作为收集培养基中生成、积累的本发明的二肽的结晶的方法，可以列举上述(a)的方法。具体可以列举，通过离心分离或过滤培养物等从培养基除去菌体后，用与上述(a)相同的方法结晶二肽的方法。而且，培养具有生产L-丙氨酸或L-谷氨酰胺的能力，和由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的能力的微生物，使之在培养基中生成积累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺时，作为除去作为残留在培养基中的夹杂物的L-谷氨酰胺的方法，可以列举与上述(a)的水性介质同样处理该培养基的方法、优选加热处理的方法。作为具体的加热处理方法，可以列举使培养基中生成积累L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、于55℃～120℃处理该培养基5分钟～24小时、优选于70℃～100℃处理15分钟～6小时处理的方法。作为结晶二肽的方法，可以列举与上述(a)相同的方法。具体而言，作为结晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，可以列举在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中，于20～70℃、优选50～70℃的温度下添加该水溶液的约2～5倍体积、优选3～4倍容量的甲醇后、冷却至10～30℃、优选15～25℃的方法。而且，结晶时，可以在含有作为晶种的二肽溶液中添加目的二肽的结晶，例如上述方法中结晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺时，在含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的水溶液中添加该水溶液的0.3～0.5培养量的甲醇后，添加该水溶液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的1～5重量％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶，然后添加甲醇至总体积为原水溶液的4倍体积的方法。以下，以参考例表示对市售的丙氨酰谷氨酰胺的结晶中所含的物质进行分析的结果。参考例市售的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺结晶的分析下表1表示了在以下条件下对各市售药进行HPLC分析的结果，上行表示用HPLC分析时的区域％、下行表示根据该区域％计算出的重量％。分析条件柱：InertsilODS-3V(GLscience公司制)温度：30℃移动相：溶液A[0.01mol/l庚烷磺酸钠、0.01mol/l磷酸二氢钾(pH2.5)]∶甲醇＝99∶1流量：1.2ml/min检测：UV210nm表1：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺试剂所含物质的分析结果表中，ND表示检测界限(区域％：0.002％)以下，DL体表示D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。任意-种试剂基本含有选自DL体、丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺和丙氨酰胺的1以上的物质。以下公开了下述微生物的制备方法的实验例，但是该微生物的制备方法并不限于该实验例，所述微生物具有生产选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸的能力以及生产具有由选自L-氨基酸和甘氨酸的1种以上的氨基酸生成二肽的活性的蛋白质的能力，并且1种以上的肽酶和1种以上的肽转运蛋白质的活性降低或丧失、或3种以上的肽酶的活性降低或丧失。实验例1pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺陷株的制备按照利用λ噬菌体的同源重组系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，66441-6645(2000)]制备了大肠杆菌染色体DNA上的特定基因发生缺失的菌株。以下中记载的质粒pKD46、pKD3和pCP20由大肠杆菌GeneticStockCenter(美国耶鲁大学)获得携带该质粒的大肠杆菌株，使用从该大肠杆菌提取的质粒。(1)基因缺失用DNA片段的克隆以使存在于大肠杆菌K12株的染色体DNA上的具有序列号29表示的碱基序列的pepD基因、具有序列号30表示的碱基序列的pepN基因、具有序列号31表示的碱基序列的pepB基因、具有序列号32表示的碱基序列的pepA基因和具有序列号33表示的碱基序列的dppA基因、具有序列号34表示的碱基序列的dppB基因、具有序列号35表示的碱基序列的dppC基因、具有序列号36表示的碱基序列的dppD基因和具有序列号37表示的碱基序列的dppF基因缺失为目的，用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成机，合成与大肠杆菌K12株的染色体DNA上的位于各个缺失目的基因的上游和下游的36bp构成的碱基序列相同的碱基序列、和具有序列号38表示的酵母来源Flp重组酶识别的碱基序列的DNA。但是，由于dppA基因、dppB基因、dppC基因、dppD基因和dppF基因形成操纵子，因此合成具有与位于该操纵子的上游和下游的碱基序列相同的碱基序列的DNA。也就是说，分别合成作为pepD基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号39和40、作为pepN基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号41和42、作为pepA基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号43和44、作为pepB基因缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号45和46、作为dpp操纵子缺失用DNA片段扩增用引物组的序列号47和48表示的碱基序列构成的DNA。接着，使用上述合成的DNA作为引物组，以pKD3DNA作为模板进行PCR。使用含有10ng的质粒DNA、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶(Stratagene公司制)、4μl的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液(Stratagene公司制)、200μmol/l的各deoxyNTP(dATP、dGTP、dCTP和TTP)的40μl反应液，重复30次于94℃1分钟、于55℃2分钟、于72℃3分钟的步骤进行PCR。对各个反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的片段扩增后，添加与残留的反应液等量的TE〔10mmol/lTris-HC1(pH8.0)、1mmol/lEDTA〕饱和苯酚/氯仿(1vol/1vol)，进行混合。离心分离该混合液后，在获得的上层加入2倍容量的冷乙醇并混合，于-80℃放置30分钟。离心分离该溶液，获得含有pepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失用氯霉素抗性基因DNA片段。(2)pepD基因缺失大肠杆菌JM101的制备用pKD46转化大肠杆菌JM101株，通过涂布于含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于30℃培养进行选择。将λRed重组酶基因插入于质粒pKD46上，并且设计成其表达由L-阿拉伯糖所诱导。因此，如果使用支链DNA转化在L-阿拉伯糖存在下生长的大肠杆菌，就会以高频率发生同源重组。而且，由于pKD46具有温度敏感性的复制起点，通过使之在42℃下生长，可以使质粒容易脱落。用电脉冲法在通过添加10mmol/lL-阿拉伯糖和50μg/ml氨苄青霉素进行培养获得的大肠杆菌JM101/pKD46中导入由上述方式获得的pepD基因缺失用氯霉素抗性基因含有DNA片段，pepD基因缺失用氯霉素抗性基因含有DNA片段通过同源重组整合到大肠杆菌JM101的染色体DNA上，通过将转化株涂布于含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨、5g/l细菌用酵母提取物、5g/l氯化钠、15g/l琼脂)中，于30℃培养进行选择。将选择出的氯霉素抗性株接种于含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基中，于42℃培养14小时后，分离单菌落。获得的各菌落在含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上复制，于37℃培养，通过选择显示出氯霉素抗性和氨苄青霉素敏感性的菌落，获得pKD46脱落株。然后，用pCP20转化上述获得的pKD46脱落株，通过在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行选择，获得了带有pCP20的pKD46脱落株。将酵母来源的Flp重组酶基因插入质粒pCP20，设计成基因的表达在42℃被诱导。而且，由于含有上述制备的PepD基因、pepN基因、pepB基因、pepA基因和dpp操纵子缺失用氯霉素抗性基因DNA片段的、Flp重组酶识别的碱基序列存在于氯霉素抗性基因的两端，因此通过Flp重组酶催化的同源重组可以使该抗性基因容易地脱落。而且，由于pCP20具有温度敏感性的复制起点，通过使pCP20保持株在42℃生长，可以同时诱导Flp重组酶的表达和pCP20的脱落。将上述获得的带有pCP20的pKD46脱落株接种于不添加药剂的LB琼脂培养基，于42℃培养14小时后、分离单菌落。获得的各菌落在不添加药剂的LB琼脂培养基、含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基和含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上复制，于30℃培养，选择显示出氯霉素敏感性和氨苄青霉素敏感性的菌落。按照常规方法从上述选择出的各株中分别制备染色体DNA(生物工学实验害、日本生物工学会编97～98页、培風館、1992年)。使用基于缺失的目的基因pepD基因的内部碱基序列设计的具有序列号49和50表示的碱基序列的DNA作为引物组，以染色体DNA作为模板进行PCR。使用含有0.1μg染色体DNA、0.5μmol/l各引物、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μlPfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/l各deoxyNTP的40μl反应液，通过重复30次的94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟构成的步骤进行PCR。在上述PCR中，没有检测出扩增DNA片段的菌株为pepD基因缺失株，命名为大肠杆菌JPD1株。(3)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepD基因和pepN基因ガ发生缺失的菌株的制备用pKD46转化上述(2)获得的大肠杆菌JPD1株，通过涂布于含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃培养进行选择。通过电脉冲法将含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段导入获得的转化株(大肠杆菌JPD1/pKD46)，获得了含有pepN基因缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段通过同源重组被整合到大肠杆菌JPD1/pKD46的染色体DNA上的转化株。接着，通过进行与上述(2)相同的操作，获得氯霉素抗性基因从染色体DNA上缺失的菌株，将该菌株命名为大肠杆菌JPDN2。(4)大肠杆菌JM101的染色体DNA上的pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操纵子发生缺失的菌株、和多重基因缺失株的制备使用上述(1)制备的含有各基因或操纵子缺失用氯霉素抗性基因的DNA片段，通过与上述(2)相同的方法制备pepN基因、pepA基因、pepB基因或dpp操纵子的缺失株。使用具有基于各个缺失基因的内部碱基序列设计合成的序列号51～58表示的碱基序列的DNA作为引物组，通过与上述(2)相同的PCR确认由上述方法获得的各个基因缺失株。其中，序列号51和52表示的碱基序列构成的DNA为pepN基因缺失确认用引物组、序列号53和54表示的碱基序列构成的DNA是pepA基因缺失确认用引物组、序列号55和56表示的碱基序列构成的DNA是pepB基因缺失确认用引物组、序列号57和58表示的碱基序列构成的DNA是dpp操纵子缺失确认用引物组。将上述方法获得的dpp操纵子缺失株命名为大肠杆菌JDPP1株、将pepN基因缺失株命名为大肠杆菌JPN1株、将pepA基因缺失株命名为大肠杆菌JPA1株、将pepB基因缺失株命名为大肠杆菌JPB7株。而且，按照上述(3)的方法，制备选自pepD基因、pepN基因、pepA基因、pepB基因和dpp操纵子构成的组的2以上的基因或操纵子的多重缺失株。可以获得多重缺失株的确认通过与上述(2)相同的PCR进行确认。将由前述方法获得的pepD基因和dpp操纵子发生缺失的二重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDP49株，将pepB基因、pepD基因和pepN基因发生缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆菌JPDNB43株，将pepD基因、pepN基因和dpp操纵子发生缺失的三重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDDP36株，将pepA基因、pepD基因、pepN基因和dpp操纵子发生缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDAP5株，将pepB基因、pepD基因、pepN基因和dpp操纵子发生缺失的四重基因缺失株命名为大肠杆菌JPNDBP7株。表2表示各基因缺失株中的缺失基因名。表2基因缺陷株和缺失基因实验例2具有生成并积累氨基酸的能力、并且二肽酶和二肽转运蛋白发生缺失的微生物的制备按照利用λ噬菌体的同源重组系的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97，6641-6645(2000)]进行大肠杆菌的染色体DNA上的特定基因的缺失。(1)基因缺失用抗药性基因片段的克隆与大肠杆菌K12株的L-谷氨酰胺的生物合成调节相关的glnE基因和glnB基因的碱基序列已经是否清楚[Science，5331，1453-1474(1997)]。基于已经报道的碱基序列，使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成机，合成序列号59和60表示的碱基序列构成的DNA作为glnE基因缺失用的引物DNA，合成序列号61和62表示的碱基序列构成的DNA作为glnB基因缺失用的引物DNA。基于位于各个缺失的目的基因的上游和下游的36bp构成的碱基序列设计合成的引物DNA。使用上述合成的DNA作为各个引物组，以pKD3DNA作为模板进行PCR。使用含有10ng质粒DNA、引物各0.5mol/L、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μLPfuDNA聚合酶用10缓冲液、deoxyNTP各200μmol/L的40μL反应液，通过重复30次的94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟构成的步骤进行PCR。对反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳、确认目的片段扩增后、添加与残留的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿，进行混合。离心分离该混合液后，在获得的上层加入2倍体积的冷乙醇并混合，于-80℃放置30分钟。通过离心分离该溶液DNA使之沉淀后，将该DNA溶解于20μL的TE中。通过上述操作，获得glnE基因、glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段。(2)染色体DNA上的glnE基因发生缺失的大肠杆菌JPNDDP36株的制备用pKD46转化上述(1)获得的大肠杆菌JPNDDP36株后、选择在含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上带有pKD46的大肠杆菌JPNDDP36株(以下、称为大肠杆菌JPNDDP36/pKD46)。通过电脉冲法用glnE基因缺失用氯霉素抗性基因片段转化在10mmol/LL-阿拉伯糖和50μg/ml氨苄青霉素存在下培养的大肠杆菌JPNDDP36/pKD46，在含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基上选择氯霉素抗性基因插入于JPNDDP36株的染色体DNA上的glnE基因中，glnE结构基因缺失的重组株。获得的氯霉素抗性株在含有25mg/l氯霉素的LB琼脂培养基上复制，在42℃保温的状态下实施单菌落分离。获得的各菌落在含有25mg/L的氯霉素和100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上复制，选择显示出氯霉素抗性和氨苄青霉素敏感性的菌落。接着，用pCP20转化该pKD46脱落株，涂布于含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基，于30℃培养一夜。慢慢生长的氨苄青霉素抗性株在不添加药剂的LB琼脂培养基上复制，在42℃保温的状态下实施单菌落分离。获得的各菌落在不添加药剂的、和含有25mg/L氯霉素和100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基上分别复制，选择显示出氯霉素敏感性和氨苄青霉素敏感性的菌落。其中，按照常规方法(生物工学实验書、日本生物工学会编97～98页、培風館、1992年)由获得的各菌株制备各个染色体DNA。使用以作为缺失的目的的glnE基因的内部序列作为基础设计的序列号63和64表示的碱基序列构成的引物DNA，进行菌落PCR。使用含有通过使200μl移液管接触菌落获得的量的菌体、0.5μmol/l各引物、2.5unitsPfuDNA聚合酶、4μlPfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/l各deoxyNTP的40μl反应液，通过重复30次的94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟构成的步骤进行菌落PCR。提供给PCR的菌株中没有发现基因扩增的菌株，确认其为glnE基因缺失株，命名为大肠杆菌JPNDDPGLE1。(3)染色体DNA上的glnE基因和glnB基因发生缺失的大肠杆菌JPNDDP36株的制备用pKD46转化上述(2)获得的大肠杆菌JPNDDPGLE1株后，涂布于含有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂培养基，通过于30℃培养一夜，获得带有pKD46的大肠杆菌JPNDDPGLE1株(以下、称为大肠杆菌JPNDDPGLE1/pKD46)。用glnB基因缺失用氯霉素抗性基因片段通过电脉冲法转化大肠杆菌JPNDDPGLE1/pKD46，获得了氯霉素抗性基因插入于染色体DNA上的glnB基因的glnB结构基因缺失了的重组株。使用基于glnB基因的内部序列设计的序列号65和66表示的碱基序列构成的引物DNA，进行上述(2)的条件下的菌落PCR。通过该PCR确认没有发现基因扩增的菌株是glnB基因缺失株，命名为大肠杆菌JPNDDPGBE1。实验例4表达具有生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的活性的蛋白质的质粒DNA的制备用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成机，合成具有序列号67～70中记载的序列的DNA(以下、分别称为引物A、引物B、引物C、引物D)。序列号67的序列是在用WO2004/058960号中记载的方法制备的质粒pQE60ywfE的ywfE基因的含有核糖体结合序列-Shine-Dalgarno序列的区域的5′添加了含有XhoI识别序列的序列。序列号68的序列是在与含有ywfE基因的终止密码子的序列的互补序列的5′添加了含有BamHI识别序列的序列。而序列编号69的序列是在含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域序列的5′端附加了含有EcoRI识别序列的序列。序列编号70的序列是在与含有trp启动子的表达载体pTrS30的trp启动子区域序列互补的序列的5′附加了含有XhoI识别序列的序列。以质粒pQE60ywfE作为模板，在ywfE片段的扩增中，作为引物组使用上述的引物A和引物B，在trp启动子区域片段的扩增中使用引物C和引物D分别作为引物组进行PCR。通过制备含有10ng的pQE60ywfE、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μl的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/l的各dNTP的40μl的反应液，反复进行30次94℃1分钟、55℃2分钟、72℃3分钟的循环步骤进行PCR。将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认在使用引物A和引物B的PCR中，相当于ywfE基因片段的约1.4kb扩增，在使用引物C和引物D的反应中相当于trp启动子区域的片段的约0.3kb片段扩增后，添加与余下的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿溶液，并混合。向将该溶液离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离后得到的DNA溶解于20μl的TE中。将使用上述得到的各DNA溶液5μl通过引物A和引物B扩增的DNA用限制性内切酶XhoI和BamHI切断，另外就将通过引物C和引物D扩增的DNA用限制性内切酶EcoRI和XhoI切断，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，通过GENECLEANII试剂盒分别回收含有ywfE基因的1.4kb和含有trp启动子区域的0.3kbDNA片段。用限制性内切酶EcoRI和BamHI切断0.2μg的含有trp启动子的表达载体pTrS30后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样回收4.5kb的DNA片段。使用连接试剂盒对上述得到的含有ywfE基因的1.4kb片段、含有trp启动子区域的0.3kb片段以及4.5kb片段于16℃下进行16小时连接反应。使用该反应液按照使用钙离子的方法转化大肠菌NM522株后，将该转化体涂布于含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基后，于30℃下培养过夜。按照众所周知的方法从逐渐生长的转化体的菌落提取质粒。通过限制性内切酶消化确认了该质粒是在trp启动子下游含有ywfE基因的表达载体，命名为pPE56。基于表达质粒pPE56，按照以下方法构建同时组成型表达枯草芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶基因(ald基因)的表达质粒。使用PerSeptiveBiosystems公司制8905型DNA合成机，合成具有序列号71和序列号72表示的碱基序列的DNA(以下、分别称为引物E、引物F)。序列号71表示的碱基序列是在ald基因的含有核糖体结合序列-Shine-Dalgarno序列的区域的5′添加了含有BamHI识别序列的碱基序列的序列。序列号72表示的碱基序列是在ald基因的含有与终止密码子的序列相互补的序列的5′添加了含有BamHI识别序列的序列的序列。以枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板，使用上述引物E和引物F作为引物组进行PCR。通过制备含有0.1μg的染色体DNA、0.5μmol/l的各引物、2.5units的PfuDNA聚合酶、4μl的PfuDNA聚合酶用×10缓冲液、200μmol/l的各dNTP的40μl的反应液，反复进行30次94℃1分钟、55℃2分钟、72℃3分钟的循环步骤进行PCR。将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认扩增了相当于ald基因片段的约1.2kb的片段后，添加与余下的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿溶液，并混合。向将该溶液离心分离后得到的上层加2倍容量的冷乙醇，并混合，于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离获得的DNA的沉淀，溶解于20μl的TE中。使用5μL该溶解液，用限制性内切酶BamHI切断扩增的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，通过GENECLEANIIKit回收含有ald基因的1.2kb的DNA片段。用限制性内切酶BamHI切断pPE56(0.2μg)后，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，用与上述相同的方法回收6.3kb的DNA片段。通过在60℃下、碱性磷酸酶(E.coliC75、takarabio公司制)处30分钟进行该6.3kb的DNA片段的末端脱磷酸化。添加与反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿溶液、并混合，然后离心分离后，在获得的上层中加入2倍容量的冷乙醇、于-80℃下放置30分钟。将该溶液离心分离获得的DNA的沉淀，溶解于20μl的TE中。用连接试剂盒于16℃，使上述获得的含有ald基因的1.2kb的DNA片段与经碱性磷酸酶处理的6.3kb的DNA片段进行16小时连接反应。使用该反应液按照使用钙离子的方法转化大肠菌NM522株后，将该转化体涂布于含有氨苄青霉素50μg/ml的LB琼脂培养基后，于30℃下培养过夜。按照众所周知的方法从逐渐生长的转化体的菌落提取质粒。通过限制性内切酶消化确认了获得了ald基因与ywfE基因同向插入的质粒，将其命名为pPE86。实验例5具有生产具有生成二肽的活性的蛋白质的能力、和生成L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的能力，并且二肽酶和二肽转运基因发生缺失的微生物的制备用上述实验例4制备的pPE86转化上述实验例2中获得的大肠杆菌JPNDDPGBE1株，获得携带该质粒的大肠杆菌JPNDDPGBE1/pPE86。以下公开实施例，但本发明不限于下述实施例。实施例1L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的发酵生产将上述实验例5中获得的大肠杆菌JPNDDPGBE1/pPE86接种于含有含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l氯化钠)的试管中，于28℃培养17小时。在含有氨苄青霉素100μg/ml的TF培养基(16g/l磷酸氢二钠、14g/l磷酸二氢钾、5g/l硫酸铵、1g/l柠檬酸、0.5g/l酪蛋白氨基酸、1g/l脯氨酸、2.5g/l丙氨酸、2.5g/l谷氨酰胺、10mg/l维生素B1、25mg/l硫酸镁、50mg/l硫酸铁、10g/l葡萄糖)中按1％添加获得的培养液，于30℃培养24小时。用F-moc化法将培养终止后的培养上清衍生物化后，用HPLC分析。在使用HPLC进行的分析中，使用ODS-HG5(野村化学公司制)作为分离柱，使用A液(用6ml/l醋酸、20％(v/v)乙腈、三乙胺，调整到pH4.8)和B液(用6ml/l醋酸、70％(v/v)乙腈、三乙胺，调整到pH4.8)作为洗脱液，在到分析开始5分钟，A液∶B液＝8∶2、到5分钟～20分钟，到20分钟时A液∶B液＝1∶1那样进行线性梯度洗脱的条件下进行分析。其结果，确认了在培养上清中积累了1g/l的丙氨酰谷氨酰胺。实施例2L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶的制备将大肠杆菌JPNDDPGBE1/pPE86接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的三角烧瓶中，于28℃培养24小时。在含有1.95L的JF培养基(6g/l磷酸氢二钠、3g/l磷酸二氢钾、5g/l氯化钠、5g/l酵母提取物、2g/l硫酸镁、0.2g/l硫酸亚铁、0.01g/l硫酸锰、1g/l氯化铵、0.2g/l脯氨酸、0.01g/l硫胺盐酸盐、10g/l葡萄糖)的溶剂为6L的罐中添加50ml获得的培养液、一边通气搅拌一边于32℃下培养。培养中，除了添加适当的葡萄糖、L-谷氨酰胺和L-丙氨酸外，用氨水将pH维持在6.6-7.0，培养60小时，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在培养液中积累。在上述获得的含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养液中加入盐酸使pH为pH3，于80℃加热1小时，分解残留的谷氨酰胺。冷却至室温后、通过离心分离除去菌体后、以1.6ml上清/ml树脂的负载量将上清上柱于填充了强酸性阳离子交换树脂-MarathonC(Dow化学公司制)的柱中，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺吸附于该树脂。充分水洗后、用0.7mol/l的水酸化钠洗脱L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，分离获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的级分。将该级分以10ml级分液/ml树脂的负载量上柱于填充了弱酸性阳离子交换树脂IRC50(Rohm&Haas公司制)的柱中，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后，用水通柱，使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺洗脱，分离获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的级分。以23ml级分液/ml树脂的负载量将该级分上柱于填充了强碱基性阴离子交换树脂PA412(三菱化学公司制)的柱，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、用水通柱，分离获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的级分。减压浓缩该级分，获得了浓度为约450g/l的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓缩液。用盐酸将pH调整成5.7后、于60℃一边缓慢搅拌一边添加甲醇。甲醇的浓度达到约33％时，以浓缩液中所含的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的2.5重量％量添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶作为晶种后、再添加甲醇直至其浓度达到80％。该甲醇溶液冷却至20℃后，通过过滤分离产生的结晶，获得粗结晶。然后，将该粗结晶溶解于水中，以2800ml溶解液/ml树脂的负载量上柱于填充了弱碱基性阴离子交换树脂WA30(三菱化学公司制)的柱中，使之吸附L-丙氨酰-L-谷氨酰胺后、用水上柱使之洗脱L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，分离获得含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的级分。与上述同样方式浓缩后，添加甲醇使结晶析出。过滤获得的结晶后进行干燥，获得针状结晶的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的纯化样本。下面列出了结晶的分析结果。并且，旋光度的测定中，用HORIBASEPA-200(堀埸制作所公司制)、粉末X射线衍射中使用RAD-X(理学電机公司制)，按照各机器的使用说明书进行测定。纯化样本的旋光度(20℃)：+9.7°粉末X射线衍射[衍射角(2θ°)、()内表示相对强度比(表示I/I0)]：6.80(4)，11.10(2)，13.70(100)，18.60(4)，19.55(5)，20.65(75)，21.36(17)，21.60(9)，22.45(14)，23.25(8)，24.05(4)，24.75(3)，25.45(12)，26.00(2)，27.55(6)，29.85(3)，30.45(2)，32.40(2)，32.95(2)，33.95(2)，34.80(25)，35.15(3)，36.45(7)，36.80(3)，42.55(2)，43.40(2)以与参考例相同的方法分析上述获得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶中所含的杂质。结果示于表3。表3L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶中所含物质的分析结果表中ND表示检测限(区域％：0.002％)以下，DL体表示D-丙氨酰-L-谷氨酰胺。如表3所示，清楚了本发明的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶不含DL-体、丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺和丙氨酰胺。也就是说，获得了基本上不含在构成成分中含有D-氨基酸的二肽、和由3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶。实施例3甲醇的结晶效果以与实施例2相同的方式将实施例2中获得的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的粗结晶(含0.111％丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺)溶解于水后、使用WA30树脂进行分馏，然后进行浓缩。将获得的浓缩液分成两份。另一方面，以与实施例2相同，添加甲醇，另一方面，除了使用乙醇代替甲醇，添加乙醇直至其浓度达到75％之外，用与实施例2相同的方法使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶析出。干燥获得的结晶后、用与参考例相同的方法测定丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺的量。结果示于表4。表4甲醇和乙醇的结晶效果表中的结晶率表示用[(溶剂添加前的溶液中的L-Ala-L-Gln量)-(残留于结晶后的上清中的L-Ala-L-Gln量)]/(溶剂添加前的溶液中的L-Ala-L-Gln量)×100计算的值。如表4所示，清楚了通过使用甲醇结晶L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，可以从L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的结晶中有效除去丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺。工业实用性根据本发明，可以提供构成成分中含有D-氨基酸的二肽、且基本上不含3个以上的氨基酸构成的多肽的二肽的结晶。序列表序列号38-人工序列的说明：合成的DNA序列号39-人工序列的说明：合成的DNA序列号40-人工序列的说明：合成的DNA序列号41-人工序列的说明：合成的DNA序列号42-人工序列的说明：合成的DNA序列号43-人工序列的说明：合成的DNA序列号44-人工序列的说明：合成的DNA序列号45-人工序列的说明：合成的DNA序列号46-人工序列的说明：合成的DNA序列号47-人工序列的说明：合成的DNA序列号48-人工序列的说明：合成的DNA序列号49-人工序列的说明：合成的DNA序列号50-人工序列的说明：合成的DNA序列号51-人工序列的说明：合成的DNA序列号52-人工序列的说明：合成的DNA序列号53-人工序列的说明：合成的DNA序列号54-人工序列的说明：合成的DNA序列号55-人工序列的说明：合成的DNA序列号56-人工序列的说明：合成的DNA序列号57-人工序列的说明：合成的DNA序列号58-人工序列的说明：合成的DNA序列号59-人工序列的说明：合成的DNA序列号60-人工序列的说明：合成的DNA序列号61-人工序列的说明：合成的DNA序列号62-人工序列的说明：合成的DNA序列号63-人工序列的说明：合成的DNA序列号64-人工序列的说明：合成的DNA序列号65-人工序列的说明：合成的DNA序列号66-人工序列的说明：合成的DNA序列号67-人工序列的说明：合成的DNA序列号68-人工序列的说明：合成的DNA序列号69-人工序列的说明：合成的DNA序列号70-人工序列的说明：合成的DNA序列号71-人工序列的说明：合成的DNA序列号72-人工序列的说明：合成的DNA<110>协和发酵工业株式会社<120>二肽的结晶及其制备方法<130>11761<150>JP2005-95103<151>2005-03-29<160>72<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌168(Bacillussubt讣is168)<400>1MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheLysSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAsnLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GluMetPheGlyAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluIleLysLeuMetLysAsnArgGluPro305310315320GlyLeuIleGluSerAlaAlaArgPheAlaGlyTrpAsnMetIlePro325330335AsnIleLysLysValPheGlyLeuAspMetAlaGlnLeuLeuLeuAsp340345350ValLeuCysPheGlyLysAspAlaAspLeuProAspGlyLeuLeuAsp355360365GlnGluProTyrTyrValAlaAspCysHisLeuTyrProGlnHisPhe370375380LysGlnAsnGlyGlnIleProGluThrAlaGluAspLeuValIleGlu385390395400AlaIleAspIleProAspGlyLeuLeuLysGlyAspThrGluIleVal405410415SerPheSerAlaAlaAlaProGlyThrSerValAspLeuThrLeuPhe420425430GluAlaPheAsnSerIleAlaAlaPheGluLeuLysGlySerAsnSer435440445GlnAspValAlaGluSerIleArgGlnIleGlnGlnHisAlaLysLeu450455460ThrAlaLysTyrValLeuProVal465470<210>2<211>472<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌ATCC6633<400>2MetGluArgLysThrValLeuValIleAlaAspLeuGlyGlyCysPro151015ProHisMetPheTyrLysSerAlaAlaGluLysTyrAsnLeuValSer202530PheIleProArgProPheAlaIleThrAlaSerHisAlaAlaLeuIle354045GluLysTyrSerValAlaValIleLysAspLysAspTyrPheGlnSer505560LeuAlaAspPheGluHisProAspSerIleTyrTrpAlaHisGluAsp65707580HisAspLysProGluGluGluValValGluGlnIleValLysValAla859095GlnMetPheGluAlaAspAlaIleThrThrAsnAsnGluLeuPheIle100105110AlaProMetAlaLysAlaCysGluArgLeuGlyLeuArgGlyAlaGly115120125ValGlnAlaAlaGluAsnAlaArgAspLysAsnLysMetArgAspAla130135140PheAsnLysAlaGlyValLysSerIleLysAsnLysArgValThrThr145150155160LeuGluAspPheArgAlaAlaLeuGluGluIleGlyThrProLeuIle165170175LeuLysProThrTyrLeuAlaSerSerIleGlyValThrLeuIleThr180185190AspThrGluThrAlaGluAspGluPheAsnArgValAsnAspTyrLeu195200205LysSerIleAsnValProLysAlaValThrPheGluAlaProPheIle210215220AlaGluGluPheLeuGlnGlyGluTyrGlyAspTrpTyrGlnThrGlu225230235240GlyTyrSerAspTyrIleSerIleGluGlyIleMetAlaAspGlyGlu245250255TyrPheProIleAlaIleHisAspLysThrProGlnIleGlyPheThr260265270GluThrSerHisIleThrProSerIleLeuAspGluGluAlaLysLys275280285LysIleValGluAlaAlaLysLysAlaAsnGluGlyLeuGlyLeuGln290295300AsnCysAlaThrHisThrGluIleLysLeuMetLysAsn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