专利名称：生产二肽的方法
技术领域：
本发明涉及生产二肽的方法，更具体地说，涉及简单而且便宜的从氨基酸酯和氨基酸生产二肽的方法。
背景技术：
二肽应用于各种领域。例如，二肽被用作药物和功能性食物的原料。特别是L-丙氨酰-谷氨酰胺被用作无血清培养基的组分。L-丙氨酰-谷氨酸还被用作输液溶液的组分，因为它在水中比L-谷氨酰胺更稳定、更易溶。
二肽通常用化学合成的方法生产，但是这种方法常需要复杂的步骤。这种方法的实例可包括N-苯甲氧基羰基丙氨酸(以下称“Z-丙氨酸)和被保护的L-谷氨酰胺的使用(Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)和Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))；Z-丙氨酸和被保护的L-谷氨酸-γ-甲基酯的使用(Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))；Z-丙氨酸酯和未保护的谷氨酰胺的使用(JP-1-96194A)；和用2-取代的丙酰卤作为原料通过N-(2-取代的)-丙酰谷氨酰胺衍生物作为中间体的合成(JP-6-234715A)。
然而，所有这些方法需要引入和消除保护基团或合成中间体，所以没有一个具有工业化优势并完全令人满意。
作为用酶生产二肽的典型生产方法，已知有用N-保护的-C-未保护的羧基组分与N-未保护的-C-保护的胺组分的缩合反应(以下称“反应1”)和用N-保护的-C-保护的羧基组分与N-未保护的-C-保护的胺组分的取代反应(以下称“反应2”)。反应1的实例是从Z-天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯生产Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法(JP-53-92729A)。反应2的实例是用乙酰苯丙氨酸乙酯与亮氨酰胺(leucinamide)生产乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺的方法(Biochemical J.，163，531(1977))。很少有使用N-未保护的-C-保护的羧基组分的报道。用N-未保护的-C-保护的羧基组分与N-未保护的-C-保护的胺组分的取代反应(以下称“反应3”)的实例包括，例如，WO90/01555中描述的用精氨酸乙酯与亮氨酰胺生产精氨酰亮氨酰胺的方法。用N-未保护的-C-保护的羧基组分与N-未保护的-C-未保护的胺组分的取代反应(以下称“反应4”)的实例包括，例如，EP-278787A中描述的用酪氨酸乙酯和丙氨酸生产酪氨酰丙氨酸的方法。这些生产方法中最便宜的方法是使用属于反应4的反应的生产方法，其中组分所用的保护基团数最小。
然而，在反应4(EP-278787A)的常规实例中所用的酶包括了相对昂贵的得自属于酵母属(Saccharomyces)的酵母或真菌或植物的羧基肽酶制剂。生产出的二肽含有较高疏水性的氨基酸。EP-278787A没有公开使用得自细菌或非酵母属酵母的酶的方法。另外，可以生产高亲水性的丙氨酰谷氨酰胺或丙氨酰天冬酰胺的方法尚属未知。因此，有必要开发出低成本的工业规模生产这种肽的方法。
发明公开本发明的目的是提供利用价格低廉的原料和低成本的酶源(微生物培养物、微生物细胞和处理过的微生物细胞产物)通过具有工业优势的简单途径生产二肽的方法。
作为大量研究的结果，本发明的发明人发现，能低成本培养的属于某种细菌和酵母的微生物具有从低成本的L-氨基酸酯和L-氨基酸产生二肽的能力，从而完成了本发明。
也即是说，本发明提供[1]生产二肽的方法，包括在至少一种选自微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞、处理过的微生物细胞产物和得自所述微生物的成肽酶的物质存在下，使氨基酸酯与氨基酸反应，其中该微生物具有从该氨基酸酯和氨基酸生成二肽的能力，并且属于选自以下的属Cellulophaga、威克斯氏菌属(Weeksella)、Pedobacter、Persicobacter、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、Psychroserpens、Gelidibacter、Dyadobacter、Flammeovirga、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、Tenacibaculum、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cytophaga)、Marinilabilia、Lewinella、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。
上述[1]的方法，进一步包括在至少一种选自所述微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞、处理过的微生物细胞产物和得自所述微生物的成肽酶的物质存在下，在从氨基酸酯和氨基酸生成二肽时，向反应混合物中加入金属酶抑制剂。
以上[1]或[2]的方法，其中该氨基酸酯为丙氨酸酯。
以上[1]至[3]方法中的任何一种，其中该氨基酸为L-谷氨酰胺。
本发明提供了简单且低成本生成二肽的方法。根据本发明，可以从价格低廉的氨基酸酯和氨基酸生产二肽，且不需要经过复杂的合成过程，这样，可降低作为药物和功能性食品原料的二肽的生产成本。此外，各种类型的二肽可以以各种氨基酸酯和氨基酸为原料来生产。
实施本发明的最佳模式本发明生产二肽的方法利用选自微生物培养物、从所述培养物中分离的微生物细胞、处理过的微生物细胞产物和得自所述微生物的成肽酶的一种，其中该微生物具有从氨基酸酯和氨基酸生产二肽的能力。下述反应方案体现了本发明生产二肽的方法涉及到的反应。正如下述方案所阐明的，本文用的“二肽”指只有一个肽键的肽聚合物。
(其中R代表取代或未取代的烃链；R1代表氨基酸酯的侧链；R2代表氨基酸侧链)。
氨基酸酯能以低成本得到。本发明的方法是全新的生产二肽的方法，因为该方法利用氨基酸酯和未保护的氨基酸作为原料，通过以细菌或酵母作为酶源在水溶液中进行反应。因此，该方法能够以低成本提供用作制药和功能性食物原料的二肽。
以下将按下列顺序对本发明生产二肽的方法进行详细解释[I]具有利用氨基酸酯和氨基酸生产二肽的能力的微生物，[II]生产二肽的方法，[III]编码具有成肽活性蛋白质的DNA的分离等。
具有利用氨基酸酯和氨基酸生产二肽的能力的微生物本发明中使用的微生物无特别限制，可使用任何具有利用氨基酸酯和氨基酸生产二肽的微生物。具有利用氨基酸酯和氨基酸生产二肽的能力的微生物可包括属于以下属的微生物Cellulophaga、威克斯氏菌属、Pedobacter、Persicobacter、柔发菌属、噬几丁质菌属、圆杆菌属、古字状菌属、栖热线菌属、Psychroserpens、Gelidibacter、Dyadobacter、Flammeovirga、螺状菌属、弯杆菌属、Tenacibaculum、红嗜热盐菌属、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属、噬纤维菌属、Marinilabilia、Lewinella、腐败螺旋菌属或束缚杆菌属的微生物。具体地举例说明以下微生物。
Cellulophaga lytica NBRC 14961有毒威克斯氏菌(Weeksella virosa)NBRC 16016
Pedobacter heparinus NBRC 12017Persicobacter diffluens NBRC 15940多萝丝柔发菌(Flexithrix dorotheae)NBRC 15987松噬几丁质菌(Chitinophaga pinensis)NBRC 15968海圆杆菌(Cyclobacterium marinum)ATCC 25205飘软古字状菌(Runella slithyformis)ATCC 29530死亡栖热线菌(Thermonema lapsum)ATCC 43542Psychroserpens burtonensis ATCC 700359Gelidibacter algens ATCC 700364Dyadobacter fermentans ATCC 700827Flammeovirga aprica NBRC 15941舌螺状菌(Spirosoma linguale)DSMZ 74大弯杆菌(Flectobacillus major)DSMZ 103Tenacibaculum maritimum ATCC 43398海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)DSMZ 4252Zobellia galactanivorans DSMZ 12802Muricauda ruestringensis DSMZ 13258Salegenttbacter salegens DSMZ 5424Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)NBRC 15051Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948Lewinella cohaerens ATCC 23123大腐败螺旋菌(Saprospira grandis)ATCC 23119水束缚杆菌(Haliscomenobacter hydrossis)ATCC 27775在上述提到的菌株中，带有ATCC号的已经被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(P.O.Box 1549，Manassas VA 20110，U.S.A.)，可以通过提供其各自的注册号购买。以上菌株中，带有NBRC号的保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构，生物技术部，生物资源中心(Biological Resource Center，Department of Biotechnology，National Institute of Technology andEvaluation)(日本千叶县木更津市南总镰足2-5-8，邮编292-0818)(5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818 Japan)，可以通过提供各自的注册号购买。以上菌株中，带有DSMZ号的保存于德意志微生物保藏中心(Deutche Sammiung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH)(Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，Germany)，也可通过提供注册号购买。
不论是野生株还是突变株都可以用作本文使用的微生物。由遗传技术如细胞融合或基因工程等得到的重组菌株也可用作该微生物。
这种微生物细胞可以通过在合适的培养基里培养微生物导致增殖而获得。培养基可以是任何允许微生物增殖的培养基。例如，培养基可以是含有碳源、氮源、磷源、硫源和无机离子的普通培养基。如果需要，培养基可进一步含有常用的有机营养源。
例如，作为碳源，只要以上提到的微生物能够利用的任何碳源均可使用，具体地说，可使用糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖和直链淀粉；醇，如山梨糖醇、乙醇和甘油；有机酸，如延胡索酸、柠檬酸、乙酸和丙酸以及它们的盐；烃，如石蜡；或其混合物。
作为氮源，可使用无机酸的铵盐，如硫酸铵和氯化铵；有机酸的铵盐，如延胡索酸铵和柠檬酸铵；硝酸盐，如硝酸钠和硝酸钾；有机氮化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉膏和玉米浆；或其混合物。
如果必要，培养基内也可含有普通培养基中使用的营养源，例如无机盐、微量金属盐和维生素。
培养条件无特别限制，例如，在有氧条件下，适当控制pH和温度在pH 5到8和5℃到65℃的范围内，培养12到100小时。
生产二肽的方法本发明生产二肽的方法包括在至少一种选自具有利用氨基酸酯和氨基酸生产二肽能力的微生物培养物、从该培养物中分离的微生物细胞、处理过的该微生物细胞产物和得自该微生物的成肽酶的物质存在下，使氨基酸酯与氨基酸反应形成二肽的步骤。由该微生物产生的成肽酶具有以氨基酸酯和氨基酸为底物生成二肽的能力。
微生物产生的成肽酶可以通过直接将氨基酸酯和氨基酸底物加入到培养有上述微生物的液体中而参与底物的反应。或者，可在培养结束后通过离心将细胞从培养液或培养微生物中分离出来。分离出的细胞可直接或经洗涤后重悬于缓冲液中，然后可加入氨基酸酯和氨基酸进行反应。或者，可使用通过常规的方法，如聚丙烯酰胺凝胶法、角叉藻聚糖法或藻酸盐凝胶法固定化的细胞。
也可以用破碎的细胞碎片、丙酮处理过的微生物细胞或冻干的微生物细胞作为处理过的微生物细胞产物。可通过超声破碎法、法式(Franch)压力破碎法、玻璃珠破碎法等进行破碎。此外，如需要裂解，可用蛋清溶菌酶法、肽酶处理法或它们的适当组合。而且，成肽酶可以从处理过的微生物细胞产物中回收以获得粗酶溶液。如果必要，使用前可对粗酶溶液进行纯化。至于从培养物纯化酶的方法，可使用普通的酶纯化方法。具体地说，以上提到的成肽酶可以通过下面的步骤来纯化；通过离心等收集细胞，通过机械方法如超声处理、玻璃珠处理或珠磨处理使细胞破碎，离心去除固体物质如细胞碎片，获得粗制酶，然后进行超离心分级、盐析、有机溶剂沉淀、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤或疏水层析等。
注意“得自微生物的成肽酶”不仅包括通过以上提到的纯化步骤从处理过的微生物细胞产物得到的酶，而且包括通过在异种或同种宿主菌株中表达酶基因产生的酶，即通过所谓基因工程技术产生的酶。
也就是说，可使用酶及所有含酶的产物，只要它们是具有利用氨基酸酯和氨基酸生成二肽能力的组分。本文所用的“含酶产物”可以是含有酶的任何产物。它们的具体实施方案可以包括产生酶的微生物的培养物、分离自所述培养物的微生物细胞、处理过的微生物细胞产物等。微生物培养物指通过培养微生物获得的任何物质，具体地说，微生物培养物可以是微生物细胞、用于培养微生物的培养基和被培养微生物产生的物质的混合物。而且，可洗涤微生物细胞获得洗涤过的微生物细胞再使用。而且，处理过的细胞产物可以包括破碎的微生物细胞、裂解的微生物细胞、冻干的微生物细胞等。处理过的细胞产物可进一步包括通过处理微生物细胞而回收的粗酶和通过进一步纯化粗酶而得到的纯化酶。作为纯化酶，可使用通过各种纯化方法得到的部分纯化的酶。酶可进一步通过其它步骤如共价连接法、吸附法和内含法固定化，以获得可使用的固定化酶。当一些微生物在培养过程中部分裂解时，其培养上清也可用作含酶产物。
培养物、培养的微生物细胞、洗涤过的微生物细胞和通过破碎和裂解微生物细胞获得的处理过的微生物细胞通常含有不参与肽生成而分解肽产物的酶。因此，使用时，有时优选加入金属酶抑制剂如金属蛋白酶抑制剂如乙二胺四乙酸(EDTA)。其加入的量可以在0.1mM到100mM范围内，优选1mM到50mM。
酶及含酶产物的使用量可以在有效量范围内，有效量即可以获得所需效果的量。本领域普通技术人员通过进行简单的预试验即可很容易地确定有效量。例如，在使用洗涤过的微生物细胞的情况下，洗涤过的微生物细胞的优选使用量可为每升反应混合物0.1g到500g。
使用的氨基酸酯可以是任何氨基酸酯，只要成肽酶特异性地利用该氨基酸酯和氨基酸产生二肽。它们的实例包括L-氨基酸的甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯、正丁酯、异丁酯、叔丁酯等。不仅可使用天然氨基酸的L-氨基酸酯，而且也可使用非天然氨基酸或其衍生物的L-氨基酸酯或D-氨基酸酯。在本发明中，L-丙氨酸酯可优选用作氨基酸酯。
氨基酸无特别限制，可使用任何已知氨基酸，只要成肽酶特异性地利用该氨基酸和氨基酸酯产生二肽。可使用L-氨基酸和D-氨基酸二者。它们更具体的实例可以是C-未保护的L-氨基酸、C-保护的L-氨基酸、C-未保护的D-氨基酸、C-保护的D-氨基酸等。此外，作为胺，不仅天然类型的胺，而且非天然类型的胺和它们的衍生物可以例证。而且，作为氨基酸，不仅天然类型的氨基酸，而且非天然类型的氨基酸和它们的衍生物也可以例证。除了α-氨基酸，β、γ、ω等氨基酸同样可例证。在本发明中，L-谷氨酰胺可用作优选氨基酸。
原料的浓度，即氨基酸酯和氨基酸浓度，各为1mM到10M，优选0.05M到2M。在某些情况下，优选加入与氨基酸酯等量或过量摩尔数的氨基酸。如果必要，底物可以分步加入到反应体系中。例如，如果具体底物在高浓度时可抑制反应，可分步加入这种底物，以将它们的浓度控制在这种抑制水平之下。
反应温度可以为3℃到70℃，优选5℃至50℃。反应pH为2到12，优选3到11。通过反应2到100小时，可以生成二肽并在反应混合物中积累。产生的二肽可以用常规的方法回收，必要时进行纯化。
编码具有成肽活性的蛋白质的DNA的分离等[III-1]DNA分离本发明中使用的微生物具有利用氨基酸酯和氨基酸生成二肽的能力。可用基因工程技术从这种微生物中分离到DNA，其编码具有利用氨基酸酯和氨基酸生成二肽活性的蛋白质。分离到的DNA可进一步用于构建转化体，其产生具有利用氨基酸酯和氨基酸产生二肽能力的蛋白质(成肽酶)。以下是从微生物中分离蛋白质的编码DNA并构建其转化体的方法的实施方案，该蛋白质利用L-氨基酸酯和氨基酸生成二肽。
首先，从以上[II]中所述的微生物获取成肽酶。然后确定纯化后的成肽酶的氨基酸序列。这种测定可以用Edman法进行(Edman，P.，Acta Chem.，Scand.，4，227(1950))，也可用Applied Biosynstems，Inc.生产的测序仪。对纯化的成肽酶，确定其氨基端的30个氨基酸残基。根据已确定的氨基酸序列，推测编码成肽酶的DNA的碱基序列。推测DNA碱基序列时采用通用密码子。
根据推测的碱基序列，合成约30碱基对的DNA分子。合成DNA的方法在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)上有公开。或者，DNA分子可以用Applied Biosystems，Inc.生产的合成仪来合成。该DNA分子可以用作从微生物的染色体基因文库中分离全长成肽酶编码DNA的探针。或者，当用PCR法扩增成肽酶的编码DNA时，可用该DNA分子作引物。但是用PCR法扩增的DNA不包含编码成肽酶的全长DNA，因此，通过用PCR扩增的DNA作为探针，从微生物染色体文库中分离出编码成肽酶的全长DNA。
White，T.J.等在Trends Genet.，5，185(1989)中描述了PCR的操作方法。制备染色体DNA的方法和从基因文库中分离目的DNA分子的方法在“Molecular Cloning(分子克隆)”第二版，Cold SpringHarbor Press(1989)等上有描述。
确定分离到的成肽酶的编码DNA碱基序列的方法在″A PracticalGuide to Molecular Cloning″，John Wiley & Sons，Inc.(1985)上有描述，此外，也可用Applied Biosystems，Inc.生产的测序仪来确定碱基序列。
本发明中使用的DNA不限于用上述获得的DNA。使用的DNA也可包括任何DNA，只要它编码成肽酶，即使该DNA是通过对从某种微生物染色体DNA中分离到的成肽酶编码DNA进行突变得到的人工突变DNA。常用的人工突变的方法可以是Method.in Enzymol.，154(1987)上描述的定点突变。
本发明中可使用的DNA也可包括具有在严格条件下与多核苷酸(DNA或RNA)杂交的碱基序列的DNA，该多核苷酸具有与分离自DNA如上述染色体DNA的DNA的碱基序列互补的碱基序列，该DNA编码的蛋白质具有成肽活性。
本文使用的术语“严格条件下”指在该条件下，只形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异杂交。虽然用数字值精确表达该条件有难度，但这种条件的实例可以是，在此条件下具有高度同源性，如50％或以上、优选80％或以上、更优选90％或以上同源性的DNA相互杂交，具有较低同源性的DNA不相互杂交，或Southern杂交中漂洗的一般条件，即在1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下60℃杂交，优选0.1×SSC和0.1％SDS，60℃杂交，更优选0.1×SSC和0.1％SDS，65℃杂交。成肽酶的活性如以上阐述。然而，对于在严格条件下与互补碱基序列杂交的碱基序列，期望其编码的蛋白在50℃和pH 8的条件下，保留具有原氨基酸序列的蛋白的约50％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上的酶活性。
此外，与分离的DNA编码的蛋白基本相同的蛋白也可用于本发明。因此，用于本发明的DNA也可包括DNA，其编码的蛋白在分离的DNA编码的氨基酸序列中含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并具有成肽酶活性，即具有催化利用L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽反应的能力。术语“数个”在本文指不会对蛋白质的三维结构或成肽酶活性造成显著破坏的氨基酸残基数量的范围。具体地说，“数个”通常指2到50个，优选2到30个，更优选2到10个。成肽酶活性在以上已有阐述。但对于含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，期望这种氨基酸序列在50℃和pH 8的条件下，保留具有原氨基酸序列的蛋白的约50％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上的酶活性。
如上所述，当DNA分离自微生物，以下DNA优选用于本发明。在以下实例中，分离DNA的具体碱基序列被称为碱基序列y，该碱基序列编码的氨基酸序列被称为氨基酸序列Y。可以用于本发明的DNA序列包括(i)由碱基序列y组成的DNA，
(ii)在严格条件下与多核苷酸杂交的DNA，该多核苷酸由与碱基序列y互补的碱基序列组成，并且该DNA编码具有成肽活性的蛋白，该蛋白催化利用L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应，(iii)编码具有氨基酸序列Y的蛋白的DNA，(iv)编码的蛋白有与含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列Y相对应的氨基酸序列，并具有成肽活性的DNA，该成肽活性催化利用L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应。
转化体的制备随后将阐述表达具有成肽活性蛋白的转化体的构建。已有某些利用重组DNA技术获得有用蛋白质如酶和生理活性物质的已知实例。重组DNA技术的使用使天然情况下存在量很小的有用蛋白质的大量生产成为了可能。
用于本发明方法的转化体的优选实例包括能表达以下(A)、(B)或(C)中描述的蛋白质的转化体(A)具有氨基酸序列Y的蛋白，(B)具有与含有一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列Y相对应的氨基酸序列，并有催化从L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反应的成肽活性的蛋白，(C)DNA编码的蛋白，该DNA能在严格条件下与由与碱基序列y互补的碱基序列组成的多核苷酸杂交，编码的蛋白有催化利用L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽反应的成肽活性。
表达(A)到(C)中具有成肽酶活性蛋白的转化体可以通过引入任何以上[III-1]中讨论的DNA(i)、(ii)、(iii)和(iv)而产生。也即是说，可以将(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的DNA整合入可在宿主细胞中表达的表达载体并导入到宿主细胞中。
以上(B)中提到的突变可以通过，例如，定点突变技术获得，通过该技术，本发明酶基因的碱基序列被修饰，使得酶基因特殊位点编码的氨基酸被取代、缺失、插入或添加。以上描述的修饰DNA也可通过常规已知的突变处理来获得。这种突变处理的实例包括，例如，用羟胺等在体外对编码本发明酶的DNA进行处理，用人工突变常用的诱变剂如紫外线、N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸处理含有编码本发明酶的DNA的埃希氏杆菌(Escherichia)属细菌。
在用重组DNA技术大量生产该蛋白的一个优选实施方案中，蛋白质分子可涉及到在产生该蛋白的转化体内形成蛋白包涵体。这种表达和生产方式的优点在于可以保护目标蛋白免受微生物细胞中存在的蛋白酶的消化，并且通过破碎微生物细胞继而进行离心可很容易地纯化目标蛋白。
如此获得的蛋白包涵体可以用蛋白变性剂(modifier)溶解。溶解后的蛋白可通过例如除去变性剂进行复性(activating reconstitution)，以转化为正确折叠的、有生理活性的蛋白。已有许多这样的实例，如人白介素-2的再活化(JP-61-257931A)。
从蛋白包涵体中回收活性蛋白可需要一系列的操作，如溶解和复性，这使其操作较直接生产活性型蛋白要更复杂。然而，如果微生物细胞内生产的蛋白可影响细胞生长，蛋白在细胞内以这种无活性包涵体的形式积累有利于减轻这种蛋白对细胞的影响。
作为包涵体大规模地生产目标蛋白可以通过在强启动子控制下简单表达目标蛋白来进行，也可以表达由目标蛋白和其他已知大量表达的蛋白组成的融合蛋白。
此外，可利用在合适位置整合入限制性蛋白酶的识别序列，将目标蛋白从表达后的融合蛋白上切下来。
当用重组DNA技术大量生产蛋白时，待转化的宿主细胞可以是细菌细胞、放线菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞等。它们之中，肠细菌，优选大肠杆菌(Escherichia coli)，可以用作宿主细胞，因为很多蛋白质的大量生产技术的发现都是用肠细菌如大肠杆菌进行的。以下描述用转化的大肠杆菌生产成肽酶的一个实施方案。
用于表达编码成肽酶的DNA的启动子可以包括常用于在大肠杆菌生产外源蛋白的启动子。这种启动子的实例可包括强启动子如T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子和λ噬菌体的PR和PL启动子。
为了以融合蛋白包涵体的形式生产成肽酶，在成肽酶基因的上游或下游连接编码其他蛋白、优选亲水肽的基因，形成融合蛋白基因。编码这种其他蛋白的基因可以是任何增加融合蛋白积累量和在变性与复性步骤后增加融合蛋白溶解度的基因。它们的候选者可以包括，例如，T7基因10、β-半乳糖苷酶基因、脱氢叶酸还原酶基因、干扰素-γ基因、白介素-2基因和凝乳酶原基因。
将这些基因与成肽酶基因相连时，它们的密码子的读框应该相互对应。可以通过在合适的酶切位点进行连接，或通过使用含有合适序列的合成DNA来达到这种对应。
为了提高成肽酶的产量，某些情况下优选在融合蛋白的下游连接终止子，即转录终止序列。该终止子可以包括，例如，T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因终止子和大肠杆菌trpA基因终止子。
作为将编码成肽酶或由成肽酶和其他蛋白组成的融合蛋白的基因导入大肠杆菌的载体，优选所谓的多拷贝型载体。它们的实例可以包括含有ColE1来源复制起点的质粒，例如基于pUC的质粒和基于pBR322的质粒或它们的衍生物。本文所用的“衍生物”指经过碱基取代、缺失、插入、添加或倒位而修饰的质粒。本文所用的修饰可以包括通过用诱变剂和UV照射进行诱变处理的修饰和自发突变的修饰。更具体地说，所用载体可以包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。另外，也可使用载体如噬菌体DNA和转座子DNA。
为了方便转化体的筛选，优选含有标记如氨苄青霉素抗性基因的载体。这种质粒作为带有强启动子的表达载体(基于pUC的载体(由Takara Shuzo，Co.，Ltd.生产)、基于pRROK的载体(由ClonetechLaboratories，Inc.生产)、pKK233-2载体(由Clonetech Laboratories，Inc.生产等)已经市场化。
可以通过将启动子、编码成肽酶或成肽酶和其他蛋白的融合蛋白的基因以及终止子以该顺序连接，得到DNA片段，然后再将其连接到载体DNA上而获得重组DNA。
用重组DNA转化大肠杆菌，并对其进行培养，从而导致成肽酶或成肽酶和其他蛋白的融合蛋白的表达和产生。待转化的宿主可以是常用来表达外源基因的任何菌株。例如，优选大肠杆菌JM109。进行转化的方法和筛选转化体的方法在Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harbor Press(1989)上有描述。
当以融合蛋白的形式表达成肽酶时，设计融合蛋白使成肽酶可被限制性蛋白酶从融合蛋白上切下来，该限制性蛋白酶识别不存在于成肽酶中的序列作为识别序列，如凝血因子Xa或激肽释放酶。
使用的生产培养基可以是任何常用于培养大肠杆菌的培养基，如M9-酪蛋白氨基酸培养基和LB培养基。此外，培养和诱导生产的条件可以根据所用载体的标记物和启动子类型及宿主微生物作适当选择。
成肽酶或成肽酶和其他蛋白的融合蛋白可通过，例如，以下方法回收如果成肽酶或其融合蛋白在微生物细胞内是可溶的，可以通过收获微生物细胞，随后破碎或裂解而获得可用的粗酶溶液。如果必要，粗酶溶液可被纯化，如通过常规的沉淀、过滤和柱层析，以获得可用的纯化成肽酶或其融合蛋白。在此种情况下，也可用利用抗成肽酶或其融合蛋白的抗体的纯化方法。
当形成蛋白质包涵体时，该蛋白包涵体可用变性剂来溶解。成肽酶可与微生物细胞蛋白一起被溶解。然而，考虑到随后的纯化操作，优选从微生物细胞中将包涵体分出，再溶解包涵体。从微生物细胞中回收包涵体可以用已知的常规方法进行。例如，可以破碎微生物细胞并通过离心等回收包涵体。溶解蛋白包涵体的变性剂可以包括，例如，盐酸胍(例如6M，pH 5-8)或尿素(例如8M)。
通过透析等操作除去调节剂，蛋白质可复性为活性形式。透析液的实例包括，例如，Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液。其浓度和pH分别可以是20mM到0.5M和pH 5-8。
在复性步骤中，蛋白质的浓度优选保持在约500μM/ml或更低。为了避免复性的成肽酶自身交联，优选将透析温度保持为5℃或更低。除透析外的其他除去变性剂的方法可以包括稀释法、超滤法等。通过使用这些方法中的任一种将再生活性。
基于文献如Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)中描述的技术，可实施基因工程技术。
实施例通过以下参考实施例对本发明作更详细的描述。然而，不应该认为本发明受限于这些实施例。在这些实施例中，L-丙氨酸和L-丙氨酰-谷氨酰胺通过高效液相色谱定量(柱InertsiL ODS-2，由GLScience，Inc生产；洗脱液磷酸水溶液(pH 2.2，5.0mM 1-辛磺酸钠/甲醇＝100/15，流速1.0ml/min，检测210nm))。
实施例1产生L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的微生物Cellulophaga lytica NBRC14961和多萝丝柔发菌NBRC 15987使用在1升DAIGO人工海水SP(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd生产)中含1克胰蛋白胨、1克酵母提取物和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH7.2，120℃灭菌15分钟)培养。Celulophaga lytica NBRC 14961或多萝丝柔发菌NBRC 15987细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃下大量培养48小时。
有毒威克斯氏菌NBRC 16016使用绵羊血琼脂培养基(NissuiPlate，由Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd生产)培养。有毒威克斯氏菌NBRC 16016细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃下大量培养48小时。
Pedobacter heparinus NBRC 12017使用在1升蒸馏水中含10克蛋白胨、2克酵母提取物、1克MgSO4·7H2O和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。Pedobacter heparinusNBRC 12017在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃下大量培养48小时。
Persicobacter diffluens NBRC 15940用在1L DAIGO人工海水SP中含0.5克KNO3、0.1克甘油磷酸钠、1克[三(羟甲基)]氨基甲烷、5克胰蛋白胨、5克酵母提取物、15克琼脂和1ml微量元素溶液的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。微量元素溶液在1升蒸馏水中含2.85克H3BO4、1.8克MnCl2·dH2O、136克FeSO4·7H2O、26.9毫克CuCl2·2H2O、20.8毫克ZnCl2、40.4毫克CoCl2·6H2O、25.2毫克Na2MoO4·2H2O和1.77克酒石酸钠。Persicobacter diffluens NBRC 15940细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃下大量培养48小时。
松噬几丁质菌NBRC 15968用在1L蒸馏水中含3克细菌用酪胨、1克酵母提取物、1.36克CaCl2·2H2O和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。松噬几丁质菌NBRC 15968细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
海圆杆菌ATCC 25205用在1升DAIGO人工海水SP中含5克蛋白胨、1克酵母提取物、0.2克FeSO4·7H2O和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养，海圆杆菌ATCC 25205细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
飘软古字状菌ATCC 29530用在1L蒸馏水中含1克蛋白胨、1克酵母提取物、1克葡萄糖和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。飘软古字状菌ATCC 29530细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
死亡栖热线菌ATCC 43542用在1L蒸馏水中含0.2克次氮基三乙酸、2ml 0.03％FeCl3溶液、0.12克CaSO4·2H2O、0.2克MgSO4·7H2O、0.016克NaCl、0.21克KNO3、1.4克NaNO3、0.22克Na2HpO4、2ml微量元素和15克琼脂的固体培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。微量元素溶液在1L蒸馏水中含0.5ml H2SO4、2.2克MnSO4、0.5克ZnSO4、0.5克H3BO3、0.016克CuSO4、0.025克Na2MoO4和0.046克CoCl2。死亡栖热线菌ATCC 43542细胞在该培养基中60℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在60℃大量培养48小时。
Gelidibacter algens ATCC 700364、Lewinella cohaerens ATCC23123、Psychroserpens burtonensis ATCC 700359和Salegentibactersalegens DSMZ 5424用海水琼脂(Marine Agar)2216(Difco生产)培养。Gelidibacter algens ATCC 700364或Psychroserpens burtonensisATCC 700359的细胞在该培养基中10℃预培养72小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在10℃大量培养72小时。Lewinellacohaerens ATCC 23123细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。Salegentibacter salegens DSMZ 5424细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
Dyadobacter fermentans ATCC 700827用在1L蒸馏水中含0.8克NH4Cl、0.25克KH2PO4、0.4克K2HPO4、0.505克KNO3、15毫克CaCl2·2H2O、20毫克MgCl2·6H2O、7毫克FeSO4·7H2O、5毫克Na2SO4、5毫克MnCl2·4H2O、0.5毫克H3BO3、0.5毫克ZnCl2、0.5毫克CoCl2·6H2O、0.5毫克NiSO4·6H2O、0.3毫克CuCl2·2H2O、10毫克Na2MoO4·2H2O、0.5克酵母提取物、0.5克蛋白胨、0.5克酪蛋白氨基酸、0.5克葡萄糖、0.5克可溶淀粉、0.5克丙酮酸钠和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。Dyadobacterfermentans ATCC 700827细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
Flammeovirga aprica NBRC 15941用在1L DAIGO人工海水SP中含2克胰蛋白胨、0.5克牛肉提取物、0.5克酵母提取物、0.2克醋酸钠和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。Flammeovirga aprica NBRC 15941细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
舌螺状菌DSMZ 74和大弯杆菌DSMZ 103用在1L蒸馏水中含1克葡萄糖、1克蛋白胨、1克酵母提取物和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。舌螺状菌DSMZ 74或大弯杆菌DSMZ 103细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
Tenacibaculum maritimum ATCC43398用在700ml DAIGO人工海水SP中含0.5克胰蛋白胨、0.5克酵母提取物、0.2克牛肉提取物、0.2克醋酸钠和15克琼脂的固体培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。Tenacibaculum maritimum ATCC43398细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
海洋红嗜热盐菌DSMZ 4252用在中含1L培养基中含2.5克酵母提取物、2.5克胰蛋白胨、100毫克次氮基三乙酸、40毫克CaSO4·2H2O、200毫克MgCl2·6H2O、0.5ml 0.01M柠檬酸铁、0.5ml微量元素溶液、100ml磷酸盐缓冲液、900ml蒸馏水和28克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。微量元素溶液在1升蒸馏水中含12.8克次氮基三乙酸、1克FeCl2·4H2O、0.5克MnCl2·4H2O、0.3克CoCl2·4H2O、50毫克CuCl2·2H2O、50毫克Na2MoO4·2H2O、20毫克H3BO3和20毫克NiCl2·6H2O。磷酸盐缓冲液在1L蒸馏水中含5.44克KH2PO4和43克K2HPO4。海洋红嗜热盐菌DSMZ 4252细胞在该培养基中60℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在60℃大量培养48小时。
Zobellia galactanivorans DSMZ 12802用含BACTO MARINEBROTH(DIFCO 2216)的固体琼脂培养基(1.5％琼脂，pH 7.6，120℃灭菌15分钟)培养。Zobellia galactanivorans DSMZ 12802细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
Muricauda ruestringensis DSMZ 13258用在1L蒸馏水中含1.5克酵母提取物、2.5克蛋白胨、2克十六烷、17.7克NaCl、0.48克KCl、34克MgCl2·6H2O、4.46克MgSO4·7H2O、0.98克CaCl2和15克琼脂的固体培养基(pH 7.2，120℃灭菌15分钟)培养。Muricaudaruestringensis DSMZ 13258细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116用在1L蒸馏水中含3克酪胨、1克酵母提取物、1.36克CaCl2·2H2O和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.2，120℃灭菌15分钟)培养。Taxeobactergelupurpurascens DSMZ 11116细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
哈氏噬纤维菌NBRC 15051用在1L蒸馏水中含3克酪胨、1克酵母提取物、1.36克CaCl2·2H2O、5克纤维二糖和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.2，120℃灭菌15分钟)培养。哈氏噬纤维菌NBRC15051细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948用在250ml蒸馏水和750ml DAIGO人工海水SP的混合物中含10克蛋白胨、2克酵母提取物、0.5克MgSO4·7H2O和15克琼脂的固体琼脂培养基(pH 7.2，120℃灭菌15分钟)培养。Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
大腐败螺旋菌ATCC 23119用在1L DAIGO人工海水SP中含0.5克KNO3、0.1克甘油磷酸钠、1克[三(羟甲基)]氨基甲烷、2克胰蛋白胨、2克酵母提取物、15克琼脂和1ml微量元素溶液的固体琼脂培养基(pH 7.0，120℃灭菌15分钟)培养。微量元素溶液在1L蒸馏水中含2.85克H3BO4、1.8克MnCl2·H2O、1.36克FeSO4·7H2O、26.9毫克CuCl2·2H2O、20.8毫克ZnCl2、40.4毫克COCl2·6H2O、25.2毫克Na2MoO4·2H2O和1.77克酒石酸钠。大腐败螺旋菌ATCC 23119细胞在该培养基中30℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在30℃大量培养48小时。
水束缚杆菌ATCC 2777用在1L蒸馏水中含27毫克KH2PO4、40毫克K2HPO4、40毫克Na2HPO4·2H2O、50毫克CaCl2·2H2O、75毫克MgSO4·7H2O、5毫克FeCl3·6H2O、3毫克MnSO4·H2O、1.31克谷氨酸、2.5毫克无葡萄糖的Trypticase Soy Broth、04毫克硫胺、0.01毫克维生素B12、2克葡萄糖和1ml微量元素溶液的固体琼脂培养基(pH 7.5，120℃灭菌15分钟)培养。微量元素溶液在1L蒸馏水中含0.1克ZnSO4·7H2O、0.03克MnCl2·4H2O、0.3克H3BO3、02克CoCl2·6H2O、0.01克CuCl2·2H2O、0.02克NiCl2·6H2O和0.03克Na2MoO4·H2O。水束缚杆菌ATCC 27775细胞在该培养基中25℃预培养48小时，然后将培养的细胞用相同的培养基在25℃大量培养48小时。
从琼脂培养基回收这种方法培养所得的各株微生物细胞，将其悬浮于含10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，制成含100g/l湿重微生物细胞的悬液。取0.1ml的各微生物细胞悬液，与0.1ml含10mM EDTA、200mM盐酸L-丙氨酸甲酯和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液混合，制成0.2ml反应混合物，其在20℃按表1列出的时间进行反应。各反应产生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的量(mM)见表1。
表1
实施例2从各种L-丙氨酸酯底物生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺用与实施例1中相同的方法培养Pedobacter heparinus NBRC12017细胞，并从琼脂培养基上回收。将回收的微生物细胞悬浮于含10mM EDTA的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 9.0)中，制成含100g/l湿重微生物细胞的悬液。将0.1ml微生物细胞悬液与0.1ml含10mMEDTA、200mM表2中所述盐酸L-丙氨酸酯和400mM L-谷氨酰胺的100mM硼酸盐缓冲液混合，制成0.2ml反应混合物，然后20℃反应1小时。各反应产生的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)的量(mM)见表2。
表2
工业适用性本发明有助于生产二肽。
参考文献JP-1-96194AJP-6-234715AJP-53-92729AWO 90/01555EP 278787ABull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962)Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964)Biochemical J.，163，531(1977)
权利要求
1.一种生产二肽的方法，所述方法包括在至少一种选自微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞、处理过的微生物细胞产物和得自所述微生物的成肽酶的物质存在下，使氨基酸酯和氨基酸反应生成二肽，其中所述微生物具有从氨基酸酯和氨基酸生成二肽的能力，并且属于选自以下的属Cellulophaga、威克斯氏菌属(Weeksella)、Pedobacter、Persicobacter、柔发菌属(Flexithrix)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)、圆杆菌属(Cyclobacterium)、古字状菌属(Runella)、栖热线菌属(Thermonema)、Psychroserpens、Gelidibacter、Dyadobacter、Flammeovirga、螺状菌属(Spirosoma)、弯杆菌属(Flectobacillus)、Tenacibaculum、红嗜热盐菌属(Rhodothermus)、Zobellia、Muricauda、Salegentibacter、整形杆菌属(Taxeobacter)、噬纤维菌属(Cytophaga)、Marinilabilia、Lewinella、腐败螺旋菌属(Saprospira)和束缚杆菌属(Haliscomenobacter)。
2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括在至少一种选自所述微生物培养物、分离自所述培养物的微生物细胞、所述处理过的微生物细胞产物和得自所述微生物的成肽酶的物质存在下，从所述氨基酸酯和所述氨基酸生成二肽时，向反应混合物中加入金属酶抑制剂。
3.权利要求1的方法，其中所述氨基酸酯为L-丙氨酸酯。
4.权利要求1的方法，其中所述氨基酸为L-谷氨酰胺。
全文摘要
本发明提供利用价格低廉的原料通过具有工业优势的简单途径生产二肽的方法。通过利用具有从氨基酸酯和氨基酸生产二肽的能力的微生物培养物、从所述培养物中分离的微生物细胞或处理过的微生物细胞产物，从氨基酸酯和氨基酸生产二肽。
文档编号C12N1/20GK1826413SQ200480021328
公开日2006年8月30日 申请日期2004年7月26日 优先权日2003年7月25日
发明者横关健三, 阿部巧, 原诚一 申请人:味之素株式会社