专利名称：：一种提取聚唾液酸的方法
技术领域：
：种提取聚唾液酸的方法，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：唾液酸是一类神经氨酸的衍生物，其化学结构是一个含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根据5号碳位上不同的连接基团构成了不同的唾液酸衍生物，最主要的两种唾液酸为5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N—乙酰神经氨酸)和3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由这两种衍生而成。其中，N—乙酰神经氨酸在脊椎动物体内更为常见，如鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等动物。哺乳动物体内普遍存在唾液酸，相对而言在脑脊液和粘液中最多。婴儿在幼年期唾液酸含量较高，对其身体发育具有重要意义。聚唾液酸(Polysialicacid，Colominicacid)是唾液酸以a-2，8和/或a-2，9酮苷键连接的线性同聚物，是少数几种细菌的胞外多糖组分。1957年Barry和Goebel首先在Esc/^n'c/w'aco//K-235和K-l中发现该聚合物，以后又陆续在7Ve&sen'G附/"/"g"/cfcB,5"a/mowe〃a她cra048,C"raZflcter戶ew"(i"05中发现该物质。a-2，8酮苷键连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形成内酯(甲单体的羧基和乙单体的9号碳位上的羟基脱水縮合形成)，对聚唾液酸的稳定起到一定的作用，这也是大多数的聚唾液酸以a-2，8酮苷键连接的主要原因之一。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>聚唾液酸是无色的，易溶于水，在水溶液中很稳定，4t:时贮藏数月不发生变化。如果溶液中含有非常微量的有机酸或者pH大于10，其稳定性就受到很大的影响。游离的唾液酸能有效地抑制感冒病毒和其他病原微生物入侵红细胞。唾液酸的类似物Zanamivir(N-乙酰基-2，3-二脱氧-4-胍基唾液酸)和Tamiflu(oseltamivirphosphate)的抗流感机理一样，可以抑制流感病毒上唾液酸酶唾液酸的一般结构的活性，己经被美国FDA正式批准为治疗禽流感的特效药。唾液酸衍生物SialylLewiSx作为重要的抗粘附药物，可有效阻止白细胞过量聚集，治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克等疾病。同时，唾液酸是一种止咳祛痰剂，对于中心和外周神经性疾病以及脱髓鞘病均有疗效。如唾液酸胆固醇可以治疗老年痴呆症。此外，唾液酸在脑中的含量很高，可能作为神经传导质，参与离子外流和神经兴奋。单唾液酸神经节苷酯对于治疗脑缺血、帕金森症和神经创伤有一定功能。近年来发现，唾液酸还具有免疫抑制作用。以唾液酸为先导进行生物活性物质的探索已经成为新药研究的一个新领域。聚唾液酸可以作为一些药物的缓释剂，也可以用于固定酶以用于诊断，或对一些药物产品进行化学修饰。聚唾液酸可以用作治疗一些疾病的疫苗而避免其它细胞组分如脂多糖或蛋白质引起的副作用。近年来，生物可降解聚合物在药物传递系统研究领域越来越受瞩目，部分聚合物已应用于各种剂型。目前比较成功用于多肽与蛋白质类药物传递系统的是聚乙二醇(PEG);但是，PEG是人工合成、在体内不可降解的，容易在膀胱积累，而且还可能产生抗PEG的抗体。在寻找替代PEG的可降解聚合物中，a-2，8连接的聚唾液酸(PSA)是目前发现最好的多肽与蛋白类药物的控释剂。英国的LipoXen公司临床试验了聚唾液酸化干扰素、胰岛素、天冬酰胺酶和人红细胞生长素等，发现其效果比PEG化的效果好、半衰期更长；其中主要应用分子量约为7000Da15000Da、a-2，8连接的聚唾液酸。随着基因工程与蛋白质工程在医药领域的快速发展，未来越来越多的药物将是各种蛋白质和多肽类药物，因此聚唾液酸作为医药中间体在未来将会有巨大的市场潜力。而且目前世界上还没有任何公司能够进行聚唾液酸的规模化生产，因此开发高纯度聚唾液酸分离纯化的技术具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供一种提取聚唾液酸的方法，以提高聚唾液酸的纯度，达到化妆品和医药生产的要求，使其竞争力更强。本发明的技术方案一种提取聚唾液酸的方法，以一株大肠杆菌(^C^enW2^co//)K235-JYlI-74的发酵液为原料，经过板框过滤去除菌体，上清液加入适量氯化钠和乙醇溶剂沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再用板框过滤去除变性蛋白质，滤液经过碱性蛋白酶处理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵络合沉淀并解离后，再用适量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超纯水溶解，通过层析柱进行分级纯化，收集洗脱液经过透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品；各步骤工艺条件为(1)过滤发酵液中加入1020g/L的80200目的珍珠岩助滤剂，发酵液经过板框过滤去除菌体，过滤方式选择110目工业滤布；(2)沉淀过滤去除菌体后的清液加入氯化钠，使氯化钠质量浓度达2%~5%，溶解后再加入24倍体积的95%质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75%质量浓度的乙醇洗涤24次；(3)溶解、过滤聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，加入1020g/L的80200目的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤或者硅藻土过滤机进行过滤，通过过滤去除部分变性蛋白质；(4)酶处理过滤去除部分变性蛋白后的滤液加入碱性蛋白酶进行处理，其工艺为碱性蛋白酶活力25万U/mL，pH7~8，加量为10mL/kg聚唾液酸，3070'C酶解37小时；(5)络合沉淀酶处理过的聚唾液酸溶液加入过量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵进行络合沉淀，氯代十六垸基吡啶或十六垸基三甲基溴化铵加量为13g/g聚唾液酸，温度为1015°C;(6)解离经过络合得到的聚唾液酸沉淀加入24倍量0.50.8M的氯化钠溶液，406(TC水浴解离38小时；(7)乙醇沉淀解离后的溶液再加入24倍体积的95%质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75%质量浓度的乙醇洗涤24次；(8)溶解、柱层析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超纯水溶解后进行层析分离，其工艺为层析柱填料为DEAE-纤维素或者葡聚糖凝胶，层析柱用0.010.05M磷酸盐缓冲液进行平衡，洗脱液为0.020.08M氯化钠溶液，洗脱速度为l5mL/min,分别收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析层析收集得到的分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分别用截留分子量为7000Da、1200014000Da透析膜进行透析4872小时；(10)冷冻干燥两种透析液体分别经过冷冻干燥得到两种规格的聚唾液酸产品。本发明的有益效果本发明提出一种有效的聚唾液酸分离纯化方法。发酵液用过量乙醇使聚唾液酸和蛋白质同时沉淀下来，沉淀溶解后用板框过滤使得变性的蛋白质更容易去除，有利于后续提取纯化。碱性蛋白酶添加到聚唾液酸溶液中可以降解剩余的蛋白质，而氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵能够与聚唾液酸专一性络合形成沉淀，有利于把聚唾液酸和其他一些大分子、小分子物质分离开。聚唾液酸进一步通过层析分离，可以收集不同分子量范围的聚唾液酸，利用透析可以去除一些小分子物质，经过冷冻干燥后，聚唾液酸的纯度达到97%以上。图l聚唾液酸的提取流程示意图。生物材料样品说明大肠杆菌(&c/^/c/'aco//)K235-JYlI-74江南大学生物工程学院生化工程实验室保藏和提供，该菌株已在《无锡轻工大学学报》2002，21(5)，456459公开。根据专利审査的有关规定，申请人保证该菌种从申请日起20年内向公众发放。具体实施例方式实施例1.聚唾液酸发酵液的制备菌株大肠杆菌(^c/^WcWaco/OK235-JYlI-74。发酵培养基(g/L)山梨醇20，氯化铵2.0，磷酸氢二钾1.5，MgSO40.9,胰蛋白胨1.5，pH7.8。利用30L发酵培养基，在50LB.Braum机械搅拌罐上采用pH控制方法进行发酵，接种量4%，灭菌前加入少量聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚(泡敌)以控制发酵过程中的泡沫，发酵罐转速300500rpm，通风量为30L/min，表压0.05Mpa，发酵温度37°C。调节pH值的氨水是浓氨水，盐酸浓度3M。菌体生长阶段的pH自然下降到6.4,然后用氨水和盐酸把pH值控制在6.4左右，直至发酵结束。发酵过程中，间隔一定时间取样测定山梨醇浓度，发酵至第12h开始补加山梨醇。根据底物浓度的变化，估计菌体对底物的消耗速率，调整控制补料液流加速率，使碳源浓度控制在5g/L到20g/L之间。发酵培养60小时下罐，测定聚唾液酸产量达到3.5g/L。实施例2.聚唾液酸的提取取5L发酵液，经过板框过滤去除菌体，所得过滤清液加入100-250g氯化钠(NaCl)并搅拌使其溶解，含氯化钠的清液再加入24倍体积的95%质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75%质量浓度乙醇洗涤24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于适量的去离子水中，所得浑浊液体经过板框过滤去除部分蛋白质，得到的滤液调节pH78并加入约50mL碱性蛋白酶(酶活25万U/mL)，在307(TC恒温水浴条件下处理37小时，再加入过量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵进行络合，隔夜静置后，倾析或者离心收集沉淀，沉淀加入0.50.8M的氯化钠溶液进行解离，4060"C水浴解离38小时，解离得到清液加入24倍体积的95%质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75%质量浓度乙醇洗涤24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于适量的超纯水中，得到澄清液体，该溶液通过蠕动泵进入平衡好的层析柱，用0.020.08M氯化钠溶液进行洗脱，洗脱速度为15mL/min，分别收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸，分别用截留分子量为7000Da或1200014000Da透析膜进行透析4872小时，最后透析液体经过冷冻干燥得聚唾液酸产品，纯度达到97%以上。表1聚唾液酸提取纯化的收率〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种提取聚唾液酸的方法，其特征是以一株大肠杆菌(Escherichiacoli)K235-JYII-74的发酵液为原料，经过板框过滤去除菌体，上清液加入氯化钠和乙醇溶剂沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再用板框过滤或者硅藻土过滤去除变性蛋白质，滤液经过碱性蛋白酶处理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵络合沉淀并解离后，再用乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超纯水溶解，通过层析柱进行分级纯化，收集洗脱液经过透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品；各步骤工艺条件为(1)过滤发酵液中加入10～20g/L的80～200目的珍珠岩助滤剂，发酵液经过板框过滤去除菌体，过滤方式选择110目工业滤布；(2)沉淀过滤去除菌体后的清液加入氯化钠，使氯化钠质量浓度达2％～5％，溶解后再加入2～4倍体积的95％质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75％质量浓度的乙醇洗涤2～4次；(3)溶解、过滤聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，加入10～20g/L的80～200目的珍珠岩助滤剂，通过板框过滤或者硅藻土过滤机进行过滤，通过过滤去除部分变性蛋白质；(4)酶处理过滤去除部分变性蛋白后的滤液加入碱性蛋白酶进行处理，其工艺为碱性蛋白酶活力2～5万U/mL，pH7～8，加量为10mL/kg聚唾液酸，30～70℃酶解3～7小时；(5)络合沉淀酶处理过的聚唾液酸溶液加入过量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵进行络合沉淀，氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化铵加量为1～3g/g聚唾液酸，温度为10～15℃；(6)解离经过络合得到的聚唾液酸沉淀加入2～4倍量0.5～0.8M的氯化钠溶液，40～60℃水浴解离3～8小时；(7)乙醇沉淀解离后的溶液再加入2～4倍体积的95％质量浓度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过倾析或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用少量75％质量浓度的乙醇洗涤2～4次；(8)溶解、柱层析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超纯水溶解后进行层析分离，其工艺为层析柱填料为DEAE-纤维素或者葡聚糖凝胶，层析柱用0.01～0.05M磷酸盐缓冲液进行平衡，洗脱液为0.02～0.08M氯化钠溶液，洗脱速度为1～5mL/min，分别收集分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析层析收集得到的分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分别用截留分子量为7000Da、12000～14000Da透析膜进行透析48～72小时；(10)冷冻干燥两种透析液体分别经冷冻干燥得到两种规格的聚唾液酸产品。全文摘要一种提取聚唾液酸的方法，属于生物工程
技术领域：
。本发明以一株产聚唾液酸大肠杆菌的发酵液为原料，经过过滤去除菌体，上清液加入适量氯化钠和乙醇等溶剂沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再用过滤去除变性蛋白质，滤液经过碱性蛋白酶处理、氯代十六烷基吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)络合沉淀并解离后，再用过量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超纯水溶解，用层析柱进行分级纯化，收集洗脱液经过透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品。本发明提出一种有效的聚唾液酸分离纯化方法，得到97％以上纯度的聚唾液酸产品，以用做药品和化妆品的原料。文档编号C08B37/00GK101195661SQ20071019136公开日2008年6月11日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日发明者吴剑荣,莉朱,詹晓北,郑志永申请人:江南大学