专利名称：一种高效溶解初生血栓的聚氨酯材料及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医用功能高分子材料领域，具体涉及一种具有高效溶解初生血栓 功能的聚氨酯材料的制备方法。
背景技术：
心血管疾病已经成为威胁人类健康的最大杀手之一，用于诊断和治疗心血管疾病 的材料和器件都不可避免的要与血液相接触。因此，与血液相接触的生物医用材料具有十 分广阔的应用前景和大量的市场需求，这些材料包括心血管系统的植入体(支架、瓣膜、血 管移植体、心脏辅助器件、导管)和体外血液处理设备(血液透析、体外循环)等，然而材料 表面引起血栓问题一直制约着该类材料的发展。以生物惰性高分子链为间隔臂将具有结合 抗凝血因子的生物活性分子固定于材料表面是解决血栓问题的一条有效途径。现有技术中，通常选用亲水性高分子链聚乙二醇(PEG)及其衍生物作为惰性间 隔臂从而有效排斥非特异性蛋白质吸附，再通过活化其链末端来引入特定的生物活性分 子，进而可以实现从血液中选择性结合抗凝血物质。如通过该方法，Kim等人制备了具 有抑制凝血功能的肝素化材料表面(参见=Biomaterials, 21,121-130, 2000)；专利号为 200610124540. 6的中国发明公开了一种具有抗凝血和溶解血栓功能的聚氨酯材料，其由修 饰层和基层组成，基层由普通商用聚氨酯材料或合成聚氨酯材料构成，修饰层是在该基层 的表面通过化学修饰方法而形成，修饰层中含有与聚氨酯基底材料通过共价健链接的聚乙 二醇柔性间隔基，以及进一步利用聚乙二醇分子上的活性基团通过共价健链接的生物活性 物质赖氨酸；该材料的制备方法是通过化学修饰方法，先在基层表面接枝带有活性基团 的聚乙二醇柔性间隔基，使其具有抗凝血的功能，然后利用聚乙二醇上的活性基团链接生 物活性物质赖氨酸，使其具有溶解血栓的功能，从而构成修饰层。虽然PEG具有很好的排斥非特异性蛋白质吸附的能力，但是在氧和过度金属离子 存在的环境中，PEG易被氧化而分解，因此长期应用于生理环境时会导致生物膜的形成从而 限制了其在人体植入材料中的应用。此外，在材料表面化学接枝PEG往往很难实现高密度 接枝，这从很大程度上限制了生物活性分子的接枝密度，从而无法达到高效率的抗凝血过程。因此，需要选用一种更具生物惰性，同时可以在聚氨酯表面高密度接枝的材料作 为惰性间隔臂来制备一种可以更高效溶解血栓的聚氨酯材料。
发明内容
本发明目的是提供一种具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料及其制备方法，通过 在聚氨酯基层表面高密度接枝生物惰性的聚合物链来固定高密度的ε _赖氨酸分子，从而 高效溶解初生血栓。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种具有溶解初生血栓功能的聚氨 酯材料的制备方法，首先，以聚氨酯材料为基层，在聚氨酯基层表面修饰亲水性高分子作为惰性间隔臂；然后，活化惰性间隔臂的侧链末端，然后结合生物活性分子ε _赖氨酸，得到 所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其中，所述亲水性高分子为聚甲基丙烯酸羟乙 酯(PHEMA)。具体地，上述技术方案包括以下步骤(1)丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液和甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液的制备将甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯缓慢滴入硫氰酸钾溶液中，搅拌反应，反应温度为 0 35°C，反应时间为1 24小时，得到甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧异硫氰 酸酯溶液；优选地，其中，甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯与硫氰酸钾的摩尔比为1 1 1 1.2; 所述硫氰酸钾溶液为硫氰酸钾乙腈溶液；(2)聚氨酯材料表面接碳碳双键将聚氨酯材料置于甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液中， 在三乙胺存在下进行反应，反应温度为45 80°C，反应时间为2 12小时，得到表面接有 碳碳双键的聚氨酯材料；其中，所述聚氨酯材料为普通医用聚氨酯材料，其形状为粒状、薄膜、管状、棒状或 其它形状的固态聚氨酯材料；优选地，所述甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯或丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液中的溶剂乙腈 或甲苯；按W/ν计，三乙胺用量为所述溶液的1 3% ；(3)聚氨酯材料表面共聚合接枝PHEMA 将表面接有碳碳双键的聚氨酯材料置于含有引发剂和甲基丙烯酸-2-羟基乙酯 (HEMA)的甲醇溶液中进行进行表面自由基聚合反应，反应温度为60 80°C，反应时间为 2 12小时，得到聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)修饰的聚氨酯；其中，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过氧化二苯甲酰、过氧化二碳 酸二乙基己酯、异丙苯过氧化氢、过硫酸钾_亚硫酸盐体系或过氧化氢_亚铁酸盐体系；(4) PHEMA修饰的聚氨酯材料表面接枝ε -赖氨酸将PHEMA修饰的聚氨酯置于琥珀亚胺碳酸二酯(DSC)溶液中，在三乙胺存在下进 行室温反应，反应时间为4 12小时；将反应后的聚氨酯清洗后置于ε -氨基被叔丁氧 羰基保护的赖氨酸(H-Lys (t-BOC)-0Η)溶液中，室温反应12 24小时；反应结束后用水 清洗改性的聚氨酯，再置于三氟乙酸溶液中进行保护基团的脱除，最后用水充分清洗，得到 ε“赖氨酸修饰的聚氨酯材料；优选地，所述DSC溶液为乙腈溶液，并且按W/V计，DSC用量为1 2. 5% ；三乙胺 与DSC摩尔比比值为1 2. 5 ；所述H-Lys (t-BOC) -OH溶液中的溶剂为水或PBS缓冲液，溶 液浓度为1 10mg/mL，溶液pH为8 9 ；所述的三氟乙酸溶液为25 30%水溶液，脱保 护温度为15 25°C，脱保护时间为1 2小时。本发明的原理为利用PHEMA间隔层的生物惰性功能，该间隔层可以有效排斥非 特异性蛋白质吸附，这样不但能够在一定程度上抑制血栓在材料表面的形成，还尽可能的 排除了体系中其他蛋白质对ε _赖氨酸和纤溶酶原之间结合的干扰，保证了材料表面对纤 溶酶的特异性结合；二是利用PHEMA分子链的梳状结构，该结构中包含丰富的侧链，侧链末 端的羟基经化学活化后用于共价结合赖氨酸分子，这样每一个表面聚合的PHEMA都能够结合很多赖氨酸分子，极大的提高了表面赖氨酸的密度，进而也提高了表面结合纤溶酶原的 效率。总之，通过利用PHEMA的生物惰性和梳状结构，一方面可以在排斥非特异性蛋白质吸 附的同时提高对纤溶酶原的特异性结合，另一方面可以高密度接枝赖氨酸分子进而提高结 合纤溶酶原的效率，最终达到高效溶解初生血栓的目的。本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的具有高效溶解初生血栓功能 的聚氨酯材料，所述聚氨酯材料由基层和设置在基层表面的修饰层构成，其中基层由聚氨 酯材料构成，修饰层是在该基层表面通过化学修饰方法而形成，修饰层中含有通过表面自 由基共聚合接枝在基层表面的的PHEMA以及在PHEMA侧链末端共价结合的ε -赖氨酸。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点由于本发明以普通医用聚氨酯材料为基层，然后通过表面自由基共聚合接枝 ΡΗΕΜΑ，并且在PHEMA侧链末端共价结合ε -赖氨酸；一方面，由于PHEMA具有良好的生物惰 性，因此能够有效排斥非特异性蛋白质吸附，在lmg/mL纤维蛋白原溶液中的蛋白质吸附量 为0. 27μ g/cm2，在血浆中能够在有效排斥非特异性蛋白质吸附的同时大量结合纤溶酶原； 另一方面，由于PHEMA具有丰富的侧链末端羟基，因此，可以实现赖氨酸分子在表面的高密 度接枝，本发明中，表面赖氨酸密度能够达到2. 81nmol/cm2,同时因为ε -赖氨酸具有特异 性结合血纤溶酶原及其激活物t-PA并溶解表面引起的初生血栓的能力，所以本发明所得 具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料浸泡于血浆中并复钙化后，能够在20分钟内将表面 形成的血栓全部溶解。
图1是实施例二中表面修饰前后的聚氨酯材料在lmg/mL纤维蛋白原溶液中的吸 附图谱；图2是实施例三中表面修饰前后的聚氨酯材料在血浆中吸附纤维蛋白原和纤溶 酶原的蛋白质印迹结果；图3是实施例四中表面修饰前后的聚氨酯材料的溶解血栓性能测试图谱。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述本发明提供的高效溶解初生血栓的聚氨酯表面的制备方法，是以在聚氨酯材料表 面通过化学方法引入可聚合的碳碳双键为化学接枝开端，在引发剂和HEMA的存在下，进行 HEMA在表面的自由基接枝共聚合。再利用双官能度的化学活性小分子DSC使PHEMA侧链末 端的羟基激活，然后将赖氨酸分子通过α-氨基共价结合在该活性点上，具体实施方式
如 下实施例一(1)聚氨酯材料表面接枝共聚合PHEMA将0. 98g硫氰酸钾、40mL无水乙腈置于IOOmL反应瓶中，搅拌溶解。将0. 82mL丙 烯酰氯缓慢滴入反应瓶中，室温下搅拌反应12小时。过滤除去沉淀，滤液直接用于下一步 反应。将60片直径约为7mm聚氨酯膜片(厚度0. 5mm)置于含有30mL上述滤液的反应瓶 中，在反应瓶中加入0. 75g三乙胺，65°C下搅拌反应2-12小时后，将聚氨酯膜片取出，经乙腈洗涤、干燥得到表面接有碳碳双键的聚氨酯膜片。将0.082g偶氮二异丁腈、6.5g HEMA、 40mL甲醇和60片表面接有碳碳双键的聚氨酯膜片置于50mL反应瓶中，在氮气保护下，将 反应混合液搅拌加热至65°C并反应6小时。反应完成后，将聚氨酯膜片取出，经甲醇、水洗 涤、干燥得到PHEMA接枝改性的聚氨酯膜片。(2) PHEMA修饰聚氨酯表面接枝ε -赖氨酸将0. 256gDSC和0. 14mL三乙胺溶于20mL无水乙腈中，然后将40片干燥的PHEMA 修饰的聚氨酯膜片加入到该溶液中，在氮气保护下，室温搅拌6小时，将膜片取出，用干燥 乙腈充分清洗并用氮气吹干后，迅速放入到IOmL浓度为5mg/mL的H-Lys (t-BOC) -OH的PBS 缓冲溶液(pH = 8.3)中，反应24小时后用蒸馏水洗涤。将洗好的膜片浸入25%的三氟乙 酸水溶液中搅拌1. 5小时，用水充分清洗以确保将残余的酸洗掉。(3)本材料在人体植入材料方面具有应用前景，例如血管植入物和血管支架涂层寸。实施例二 按照实施例一的方法所制备的赖氨酸表面，通过同位素标记纤维蛋白原吸附测试 来反映其排斥非特异性蛋白质吸附的能力。通过ICI法将同位素125I标记在纤维蛋白原的 酪氨酸残基上，将标记与未标记的纤维蛋白原溶液按照1 19的纤维蛋白原质量比混合并 将改性与未改性的聚氨酯膜片静置于该溶液中3h，以pH为7. 4的PBS或TBS缓冲液洗三 次，最后通过Y计数器读取膜片上的放射量并换算为蛋白质的质量，最终得到图1。实施例三按照实施例一的方法所制备的赖氨酸表面，通过蛋白质印迹技术来测试其在血浆 中排斥非特异性蛋白质吸附及选择性结合纤溶酶原的能力。首先，将改性与未改性的聚氨 酯膜片在血浆中浸泡3h，pH为7. 4的PBS或TBS缓冲液清洗三次后用2% (w/v)的十二 烷基硫酸钠(SDS)溶液将吸附于膜片表面的蛋白质洗脱下来。然后，将该蛋白质洗脱液在 12% SDS-PAGE凝胶上进行电泳，再将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，以5%的脱脂奶粉 对PVDF膜进行封闭，再依次结合所研究的目标蛋白质的一抗和碱性磷酸酶标记的二抗(该 实施例中研究的是纤维蛋白原和纤溶酶原)，最终通过作用于底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸和氮兰四唑而显色，见图2。显示出条带说明膜片表面吸附了相应的蛋白质。实施例四按照实施例一的方法所制备的赖氨酸表面，通过血浆复钙化实验检测其溶解初生 血栓的性能。首先，将改性与未改性的聚氨酯膜片在血浆中浸泡3h，用pH为7. 4的PBS或 TBS缓冲液清洗三次，再浸泡于0. lmg/mL组织型纤溶酶原激活剂(t_PA)中30min并用pH 为7. 4的PBS或TBS缓冲液清洗三次。将洗后的聚氨酯膜片置于新的96孔板中，依次加入 0. ImL血浆和0. ImLCaCl2溶液中(0. 025M)。最后在酶标仪上读取405nm处的吸光值变化 并获得图3，曲线上升说明形成了血栓，上升后又下降说明形成的血栓被溶解。
权利要求
一种具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料的制备方法，首先，以聚氨酯材料为基层，在聚氨酯基层表面修饰亲水性高分子作为惰性间隔臂；然后，活化惰性间隔臂的侧链末端，然后结合生物活性分子ε 赖氨酸，得到所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其特征在于，其中，所述亲水性高分子为聚甲基丙烯酸羟乙酯并且，在聚氨酯基层表面修饰亲水性高分子的方法为(1)丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液和甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液的制备将甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯缓慢滴入硫氰酸钾溶液中，搅拌反应，反应温度为0～35℃，反应时间为1～24小时，得到甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液；(2)聚氨酯材料表面接碳碳双键将聚氨酯材料置于甲基丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧异硫氰酸酯溶液中，在三乙胺存在下进行反应，反应温度为45～80℃，反应时间为2～12小时，得到表面接有碳碳双键的聚氨酯材料；(3)聚氨酯材料表面共聚合接枝聚甲基丙烯酸羟乙酯将表面接有碳碳双键的聚氨酯材料置于含有引发剂和甲基丙烯酸 2 羟基乙酯的甲醇溶液中进行表面自由基聚合反应，反应温度为60～80℃，反应时间为2～12小时，得到聚甲基丙烯酸羟乙酯修饰的聚氨酯；其中，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、过氧化二苯甲酰、过氧化二碳酸二乙基己酯、异丙苯过氧化氢、过硫酸钾 亚硫酸盐体系或过氧化氢 亚铁酸盐体系。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，活化惰性间隔臂的侧链末端，然后 结合生物活性分子￡ _赖氨酸的方法具体包括以下步骤将聚甲基丙烯酸羟乙酯修饰的聚 氨酯置于琥珀亚胺碳酸二酯溶液中，在三乙胺存在下进行室温反应，反应时间为4 12小 时；将反应后的聚氨酯清洗后置于￡ _氨基被叔丁氧羰基保护的赖氨酸溶液中，室温反应 12 24小时；反应结束后用水清洗改性的聚氨酯，再置于三氟乙酸溶液中进行保护基团的 脱除，最后用水充分清洗，得到￡ -赖氨酸修饰的聚氨酯材料；所述的三氟乙酸溶液为25 30%水溶液，脱保护温度为15 25°C，脱保护时间为1 2小时。
3.采用权利要求1所述制备方法制得的具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料。
4.一种具有高效溶解初生血栓功能的聚氨酯材料，所述聚氨酯材料由基层和设置在基 层表面的修饰层构成，其中基层由聚氨酯材料构成，修饰层是在该基层表面通过化学修饰 方法而形成，其特征在于，修饰层中含有通过表面自由基共聚合接枝在基层表面的聚甲基 丙烯酸羟乙酯以及在聚甲基丙烯酸羟乙酯侧链末端共价结合的￡ _赖氨酸。
全文摘要
本发明涉及生物医用功能高分子材料领域，具体涉及一种具有高效溶解初生血栓功能的聚氨酯材料的制备方法。首先，以聚氨酯材料为基层，在聚氨酯基层表面修饰亲水性高分子作为惰性间隔臂；然后，活化惰性间隔臂的侧链末端，然后结合生物活性分子ε-赖氨酸，得到所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其中，所述亲水性高分子为聚甲基丙烯酸羟乙酯。通过利用PHEMA的生物惰性和梳状结构，一方面可以在排斥非特异性蛋白质吸附的同时提高对纤溶酶原的特异性结合，另一方面可以高密度接枝赖氨酸分子进而提高结合纤溶酶原的效率，最终达到高效溶解初生血栓的目的。
文档编号C08J7/16GK101942105SQ201010270930
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者李丹, 王莎莎, 陈红 申请人:苏州大学