一种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子、制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子的制备方法及应用，该水分散性荧光聚合物纳米粒子是以甲基丙烯酸甲酯、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（AEMH）和4-乙氧基-9-(2-烯丙基)-1,8-萘二甲酰亚胺（EANI）为单体，以异硫氰酸荧光素（FITC）为表面功能化试剂，采用一步细乳液聚合方法与粒子表面修饰技术相结合制备而成。该水分散性荧光聚合物纳米粒子既可以对水中pH值实现比率荧光检测，还可以在确定pH值下对水中汞离子实现比率荧光检测。与现有技术相比，本发明得到的水分散性荧光聚合物纳米粒子在水中可分别对pH值进行高灵敏度检测和对汞离子进行高选择性、高灵敏度定量检测，且合成路线简单，使用方便，适于放大合成和实际生产应用，在生物分析化学、细胞生物学、医学领域和环境检测领域有着巨大的应用前景。
【专利说明】-种具有pH值和采罔子比率检测功能的水分散性焚光聚 合物纳米粒子、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及材料制备及生物化学和环境检测【技术领域】，尤其涉及一种具有pH值 和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子的制备方法。该水分散性荧光聚合 物纳米粒子涉及水环境中pH值的高灵敏度检测和水中汞离子的高选择性、高灵敏度定量 检测。
【背景技术】
[0002] 众所周知，细胞内的pH值在细胞、酶和组织活性上起着重要的作用，包括增殖和 细胞凋亡，离子运输和耐药性等。细胞内pH值的微小变化可能导致细胞功能障碍，并且与 一些常见的疾病如癌症和老年痴呆症等有一定的相关性，因此对细胞内的pH的精确测定 能够为生理和病理过程提供非常重要的信息。在另一方面，大量的研究表明，pH值对水质、 水生生物和鱼类都有重要的影响。当pH值高时，由于氨的比例大，所以毒性很强；而pH值 过低时，水中硫化物会变成硫化氢而极具毒性。此外，pH值过低，大多数藻类、细菌及浮游 动物受到影响，光合作用减弱，硝化过程被抑制，使水体物质循环强度下降，从而影响水体 生物和鱼的生长发育。因此，如何高效、高灵敏度的检测细胞内和各种水环境中的pH值无 疑将具有重要的研究意义和应用价值。
[0003] 相对于其它pH值测量方法而言，基于荧光技术测量pH值通常具有样品无损性，高 灵敏度，以及广泛可用的染料指示剂等优势；同时其在细胞内成像与传感的优势远超过其 他技术。通常，基于荧光技术测量pH值的关键在于制备理想的pH值荧光传感器。在已有 的各种pH值荧光传感器报道中，pH值比率荧光传感器由于利用荧光载体能对pH值变化产 生两个荧光强度（两种荧光物质的发射波长处）的变化，从而消除设备本身条件和外界环 境变化引起的测量误差，而受到了科学家们的广泛关注。然而目前这种具有双波长的、对pH 值敏感的比率荧光传感器相对较少，主要集中在有机小分子领域。这些有机小分子体系通 常在水中的量子效率较低，易于受到环境离子的影响，不利于细胞内和各种复杂水环境中 pH值的高灵敏度准确检测，并且合成路线较复杂，不利于大规模的商业化生产应用。因此， 发展一种能在水中检测pH值的制备简单、灵敏度高、准确性好的新型荧光传感器无疑将具 有广泛的实用价值。
[0004] 聚合物纳米粒子具有合成方法简捷、结构功能多样化等特点，是构建各种荧光传 感器的重要基质。同时细乳液聚合因其合成方法简单，易修饰，易于实际应用和扩大化生产 等优点被广泛应用。然而，在现有的各类荧光聚合物纳米粒子传感器研究中，鲜见将pH比 率荧光传感和细乳液聚合相结合的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有pH值和汞 离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子的制备方法。该方法采用具有合成工艺 简单，可实现实际应用和扩大化生产的细乳液聚合方法，通过各物质的比例优化，制备符合 要求的聚合物纳米粒子，然后通过表面修饰制备一种具有pH值和汞离子比率检测功能的 水分散性荧光聚合物纳米粒子。
[0006] 本发明的目的是通过下述方式实现的：一种具有pH值和汞离子比率检测功能的 水分散性荧光聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤： (1) 将甲基丙烯酸甲酯、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（AEMH)、4-乙氧基-9-(2-烯 丙基）-1，8_萘二甲酰亚胺（EANI)、正十六烷、偶氮二异丁腈（AIBN)按质量比为1 : 0. 08?0. 24 :0. 001?0. 005 :0. 15 :0. 05混合均匀后分散在浓度为0. 005?0. 015g/ml的十六 烷基三甲基溴化铵（CTAB)的水溶液中，超声乳化至形成均匀的细乳液后，75°C反应3小时 后得到表面含氨基的荧光聚合物纳米粒子； (2) 在步骤（1)制得的表面含氨基的荧光聚合物纳米粒子中加入相对于AEMH用量 39Γ8%的异硫氰酸荧光素（FITC)，弱碱性条件下室温反应3天，经3次透析除去未反应的 FITC后，得到具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子。
[0007] -种根据所述的具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒 子的制备方法制备的水分散性荧光聚合物纳米粒子。
[0008] 本发明技术方案实现的有益效果： (1) 制备了一种具有双波长荧光发射，对pH值敏感，且合成方法简单，易修饰，可实现 实际应用和扩大化生产的新型水分散性荧光聚合物纳米粒子； (2) 由于采用双波长发射的比率荧光测定，避免了仪器本身的误差和浓度差异导致的 pH值或汞离子测量误差，可以有效增加测定结果的准确性； (3) 本发明实现了一种传感器的两种用途，既可以高灵敏度检测水环境下的pH值，还 可以高选择性、高灵敏度定量检测水中汞离子浓度。
[0009] 本发明采用将FITC修饰到聚合物纳米粒子表面以形成基于荧光共振能量转移 (FRET)效应的具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子。在水相 中，通过利用EANI和FITC之间形成的FRET效应，既可以在不同pH值下产生两个不同发射 波长处的荧光强度变化，从而消除仪器本身和环境变化引起的测量误差，实现对所处环境 的pH值的高灵敏度检测；并且还可以在确定pH值的条件下，利用FITC对汞离子浓度的响 应性，实现对水中汞离子浓度的高选择性、高灵敏度定量检测。与现有技术相比，本发明中 的水分散性荧光聚合物纳米粒子合成路线简单、后处理方便、可直接对水环境的pH值变化 和水中汞离子进行高灵敏度定量检测、适合放大合成和实际生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1为水分散性荧光聚合物纳米粒子的合成与pH值检测原理示意图。
[0011] 图2为水分散性荧光聚合物纳米粒子随pH值变化的荧光发射光谱图。
[0012] 图3为水分散性荧光聚合物纳米粒子随pH值变化的比率荧光强度值对应的拟合 曲线和该曲线所对应的函数图（I FITyiEANI为加入不同pH缓冲溶液后的水分散性荧光聚合 物纳米粒子在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光发射强度比值，激发波长 为 385nm)。
[0013] 图4为水分散性荧光聚合物纳米粒子随pH值变化的吸收光谱图。
[0014] 图5为水分散性荧光聚合物纳米粒子所测得的娃哈哈饮用纯净水和实验室所得 蒸馏水的pH值与实际用PHS-25型pH计测得的pH值的对比图。
[0015] 图6为各种阴离子对水分散性荧光聚合物纳米粒子检测pH值为7的比率荧光强 度对比图（固含量：0.03 wt%，各阴离子的浓度均为1.0X10_3 mol/1，IFITC/IEANI为加入pH 值为7的水溶液后的水分散性荧光聚合物纳米粒子在530nm (对应FITC)和430nm (对应 EANI)处的荧光发射强度比值，激发波长为385nm)。
[0016] 图7为不同浓度下的水分散性荧光聚合物纳米粒子检测pH值为7时所对应的比 率荧光强度对比图（I FITO/IEANI为加入pH值为7的缓冲溶液后的水分散性荧光聚合物纳米粒 子在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光发射强度比值，激发波长为385nm)。
[0017] 图8为水分散性荧光聚合物纳米粒子随汞离子浓度的增加所对应的荧光强度变 化图（固含量：〇. 03 wt%，激发波长为385nm) 图9为水分散性荧光聚合物纳米粒子随汞离子浓度变化的比率荧光强度变化值对应 的拟合曲线和该曲线所对应的函数图（FACI是未加汞离子时在530nm处的荧光强度，FA是加 入汞离子后在530nm处的荧光强度，F D是与加入汞离子浓度相对应的430nm处的荧光强度， 激发波长为385nm)。
[0018] 图10为在pH值为7时各种金属离子对水分散性荧光聚合物纳米粒子的比率荧光 强度对比图（固含量：〇. 03 wt%，各金属离子的浓度均为5. ΟΧ ΚΓ6 mol/1，IFITC/IEANI为加入 pH值为7的缓冲溶液后的水分散性荧光聚合物纳米粒子在530nm (对应FITC)和430nm (对 应EANI)处的荧光发射强度比值，激发波长为385nm)。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0020] 实施例1 :一种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子 的制备方法，包括以下步骤： (1)细乳液聚合制备含EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0021] 将 0· 5g 甲基丙烯酸甲酯，0· 08g AEMH，0. 025gAIBN，0. 075g 正十六烷和 0· 001g EANI的混合液在普通磁力搅拌器上搅拌5分钟得溶液a ;同时将0. lg十六烷基三甲基溴化 铵加在l〇ml水里，在普通磁力搅拌器上搅拌10分钟得溶液b。将溶液a和b混合后，在常 温下搅拌5分钟后得到预乳液。将预乳液在冰水浴下(保持20°C以下)放入650W功率的超 声波细胞粉碎仪中，超声乳化15分钟便可得到稳定的细乳液。将细乳液转入25 ml圆底烧 瓶中，圆底烧瓶置于75 °C油浴锅中反应3h。反应结束后，冷却至室温，过滤得到所需的含 EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0022] (2)含EANI的荧光聚合物纳米粒子的表面功能化修饰。
[0023] 将步骤（1)中所得的荧光聚合物纳米粒子装入25ml圆底烧瓶，再加入FITC 0. 005g，弱碱性条件下室温反应3天得混合分散液。将混合分散液装入截留分子量为3500 的透析袋，在l〇〇〇ml大烧杯中（含800ml水和8g CTAB)透析12小时，共三次，得到具有pH 值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子，见图1。
[0024] 实施例2 :-种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子 的制备方法，包括以下步骤： (1)细乳液聚合制备含EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0025] 将 0· 5g 甲基丙烯酸甲酯，0· 04g AEMH，0.025gAIBN，(X075g 正十六烷和 0.002g EANI的混合液在普通磁力搅拌器上搅拌5分钟得溶液a ;同时将0. 05g十六烷基三甲基溴 化铵加在l〇ml水里，在普通磁力搅拌器上搅拌10分钟得溶液b。将溶液a和b混合后，在 常温下搅拌5分钟后得到预乳液。将预乳液在冰水浴下(保持20°C以下)放入650W功率的 超声波细胞粉碎仪中，超声乳化15分钟便可得到稳定的细乳液。将细乳液转入25 ml圆底 烧瓶中，圆底烧瓶置于75 °C油浴锅中反应3h。反应结束后，冷却至室温，过滤得到所需的 含EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0026] (2)含EANI的荧光聚合物纳米粒子的表面功能化修饰。
[0027] 将步骤（1)中所得的荧光聚合物纳米粒子装入25ml圆底烧瓶，再加入FITC 0. 0025g，弱碱性条件下室温反应3天得混合分散液。将混合分散液装入截留分子量为3500 的透析袋，在l〇〇〇ml大烧杯中（含800ml水和8g CTAB)透析12小时，共三次，得到具有pH 值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子，见图1。
[0028] 实施例3 :-种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子 的制备方法，包括以下步骤： (1)细乳液聚合制备含EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0029] 将 0· 5g 甲基丙烯酸甲酯，0· 12g AEMH，0. 025gAIBN，0. 075g 正十六烷和 0· 0015g EANI的混合液在普通磁力搅拌器上搅拌5分钟得溶液a ;同时将0. 15g十六烷基三甲基溴 化铵加在l〇ml水里，在普通磁力搅拌器上搅拌10分钟得溶液b。将溶液a和b混合后，在 常温下搅拌5分钟后得到预乳液。将预乳液在冰水浴下(保持20°C以下)放入650W功率的 超声波细胞粉碎仪中，超声乳化15分钟便可得到稳定的细乳液。将细乳液转入25 ml圆底 烧瓶中，圆底烧瓶置于75 °C油浴锅中反应3h。反应结束后，冷却至室温，过滤得到所需的 含EANI的荧光聚合物纳米粒子。
[0030] (2)含EANI的荧光聚合物纳米粒子的表面功能化修饰。
[0031] 将步骤（1)中所得的荧光聚合物纳米粒子装入25ml圆底烧瓶，再加入FITC 0. 005g，弱碱性条件下室温反应3天得混合分散液。将混合分散液装入截留分子量为3500 的透析袋，在l〇〇〇ml大烧杯中（含800ml水和8g CTAB)透析12小时，共三次，得到具有pH 值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子，见图1。
[0032] 实施例4 :pH检测实验。
[0033] 具体测试的仪器为：Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪、Shimadzu UV-2501PC紫 外-可见吸收光谱仪，测试浓度为固含量〇. 〇3wt%，测试温度为25° C。
[0034] (1)取13个5ml样品瓶，分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚合物纳 米粒子，然后分别将pH为2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5、5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8的3ml缓冲溶液加入 13个样品瓶中，常温下搅拌3分钟后，以385nm为激发波长，分别测定这些样品，得13个样 品的荧光发射光谱变化图，见图2。根据荧光发射光谱变化图得到比率荧光变化曲线图，经 过拟合，得到比较理想的函数（y=a/(l+exp(-k*(x_c)))，a=3. 60421，k=l. 09472, c=4. 686， R2=0. 99079)曲线图，见图3。再测这13个样品的吸收光谱，得到吸收光谱变化图，见图4。测 定结果表明：该纳米粒子水分散液的比率荧光强度随着pH的逐渐增加而逐步上升，且pH>3 时纳米粒子水分散液的荧光比率强度明显上升。
[0035] 实施例5 :水中pH值的检测应用。
[0036] 取两个5ml样品瓶，分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚合物纳米粒 子，然后分别加入3ml娃哈哈饮用纯净水和实验室所得蒸馏水，常温下搅拌3分钟后，在 385nm波长激发下，测定这些样品的荧光发射发光谱图，求得在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光强度比率值，然后将此值代入实施例2中得到的函数关系式，求得娃 哈哈饮用纯净水和实验室所得蒸馏水的检测pH值。然后用PHS-25型数显pH计测量娃哈 哈饮用水和实验室所得蒸馏水所对应的实际pH值，最后对比数据，见图5。测定结果表明： 该水分散性荧光聚合物纳米粒子可以较为准确的测量水相中的pH值。
[0037] 实施例6 :阴离子干扰的检测实验。
[0038] 取9个5ml样品瓶，分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚合物纳米粒 子，然后分别加入pH值为7的纯净水3ml，1号作为空白对照，不加任何离子，然后在2-9号 样品瓶中分别加入浓度为〇. lmol/1的F_、Cl-、&_、C032-、HCCV、ΠΡΟ/-、NO 3-、S042-的溶液各 3μ1，常温下搅拌3分钟后，在385nm波长激发，测定这些样品的荧光发射发光谱图，得到与 不同阴离子相对应的在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光强度比率值，见 图6。测定结果表明：除C0广有较小的影响外，其它上述各种阴离子对所制备的水分散性荧 光聚合物纳米粒子检测水中pH值没有明显的干扰作用。
[0039] 实施例7 :不同水分散性荧光聚合物纳米粒子浓度对pH值荧光比率检测的影响。
[0040] 取9个5ml样品瓶，1-9号样品瓶分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚 合物纳米粒子，再向1-9号样品瓶中加 pH值为7的缓冲液分别为2. 5ml、2. 6 ml、2. 7ml、 2. 8ml、2. 9ml、3. 0ml、3. lml、3. 2ml、3. 3ml、3. 4ml 稀释。常温下搅拌 3 分钟后，在 385nm 波长 激发下测定这些样品的荧光发射发光谱图，得到与不同水分散性荧光聚合物纳米粒子浓度 相对应的在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光强度比率值，得不同水分散 性荧光聚合物纳米粒子浓度的比率荧光强度变化图，见图7。测定结果表明：一定范围内的 不同水分散性荧光聚合物纳米粒子浓度对pH值荧光比率检测没有明显影响。
[0041] 实施例8 :汞离子检测实验。
[0042] 取9个5ml样品瓶，分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚合物纳米粒子， 再依次加入pH值为7的缓冲液3ml，1号做为空白对照组，2-9号依次加入3μ1汞离子，使 其在分散液中的含量依次为〇. 5μΜ、?μΜ、3μΜ、5μΜ、7μΜ、1〇μΜ、3〇μΜ、5〇μΜ，常温下搅拌3分钟 后，在385nm波长激发下测定这些样品的荧光发射发光谱图，见图8。根据图8可进一步得到 比率荧光强度变化图，经过曲线拟合，得到比较理想的函数（y=Pl*XAP2+X)，Pl=1.33589， P2=6.61821，R2=0.9953)曲线图，见图9。图中，FAQ是未加汞离子时在530nm处的荧光强度， FA是加入汞离子后在530nm处的荧光强度，FD是与加入汞离子浓度相对应的430nm处的荧 光强度。测定结果表明：当体系中存在较低浓度的汞离子（〇.5μΜ)时，体系在530nm处的荧 光强度出现明显下降，并且随着汞离子浓度的增加，荧光比率强度值有规律地下降，从而可 实现对汞离子的高灵敏度定量检测。
[0043] 实施例9 :其它金属离子影响的对比检测实验。
[0044] 取12个5ml样品瓶，分别加入实施例1中所得3〇μ1水分散性荧光聚合物纳米粒 子，再依次加入pH值为7的缓冲液3ml，1号做为空白对照组，然后在2-12号样品瓶中分别 加入浓度为 5· ΟΧ ΚΓ3 mol/1 的 Cu2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Mn 2+、K+、Ca2+、Fe3+、Ni+、Hg2+ 的溶 液各3μ1，常温下搅拌3分钟后，在385nm波长激发下测定这些样品的荧光发射发光谱图，得 到与不同金属离子相对应的在530nm (对应FITC)和430nm (对应EANI)处的荧光强度比率 值，见图10。测定结果表明：除Hg2+外，其它上述各种金属离子对所制备的水分散性荧光聚 合物纳米粒子在确定pH值下的荧光强度比率值没有明显影响。
[0045] 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明所做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护。
【权利要求】
1. 一种具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将甲基丙烯酸甲酯、2-氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（AEMH)、4-乙氧基-9-(2-烯 丙基）-1，8_萘二甲酰亚胺（EANI)、正十六烷、偶氮二异丁腈（AIBN)按质量比为1 : 0. 08?0. 24 :0. 001?0. 005 :0. 15 :0. 05混合均匀后分散在浓度为0. 005?0. 015g/ml的十六 烷基三甲基溴化铵（CTAB)的水溶液中，超声乳化至形成均匀的细乳液后，75°C反应3小时 后得到表面含氨基的荧光聚合物纳米粒子； (2) 在步骤（1)制得的表面含氨基的荧光聚合物纳米粒子中加入相对于AEMH用量 39Γ8%的异硫氰酸荧光素（FITC)，弱碱性条件下室温反应3天，经3次透析除去未反应的 FITC后，得到具有pH值和汞离子比率检测功能的水分散性荧光聚合物纳米粒子。
2. 根据权利要求1所述的的制备方法制备的具有pH值和汞离子比率检测功能的水分 散性荧光聚合物纳米粒子。
3. 根据权利要求1所述的制备方法制备的水分散性荧光聚合物纳米粒子，其特征在 于，能在2-8的pH范围内，对水相中的pH值实现高灵敏度检测应用。
4. 根据权利要求1所述的制备方法制备的水分散性荧光聚合物纳米粒子，其特征在 于，能够在确定pH值下对水中汞离子实现高选择性、高灵敏度定量检测应用。
【文档编号】C08F2/28GK104151480SQ201410369075
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】陈建, 王宏, 李亚, 侯庆杨, 吕锟, 吉添, 李明莉, 周智华, 易平贵 申请人:湖南科技大学