本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种新型的玉米蛋白源促乙醇代谢多肽的制备方法。
背景技术：
酒作为一种世界性饮料一直以来被全世界人民广泛消费，我国有着悠久的制备、饮用酒精饮料的历史。中医主张适度饮酒有疏通筋络、活血化瘀之益处，重度饮酒“则胃胀，气上逆，满于胸中，肝浮胆横”。尤其对于现代人而言，在生活环境、生活方式的改变下，饮酒机会大大增加，饮酒造成的损失和伤害也是数不胜数。大量饮酒会导致人记忆减退、恶心呕吐、甚至严重危及生命安全和社会财产安全。早在古代我国中医就注重谋求组方减轻酒精带给人的伤害，《千金方》、《药性论》中葛根，《普济方》中酒积丸、七香丸，《太平圣惠方》中白术丸等等，但这些传统中医的偏方正如中医本身一样，受到诸多的限制和本身的复杂性影响，难以广受于众。于近代，最早起源于日本学者Yamaguchi的在1997年关于玉米肽促进乙醇代谢的报道，掀起了全世界研究肽对乙醇脱氢酶活性促进作用研究的热潮；国内虽已有相关文献报道，但发展较缓慢，暂未有相关产品进入市场。我国每年玉米湿法制备淀粉后残留大量的玉米黄粉副产物，蛋白质含量高达60％～68％，但是由于其自身氨基酸组成缺乏组氨酸，氨基酸评分低，对人体利用价值不大；蛋白组成中70％-75％为水溶性极差的醇溶蛋白，一般的生物酶解效果差，生物利用不足导致长期以来仅作为饲料或下脚料廉价出售，造成极大的物质浪费。现有对玉米黄粉的研究均为直接以玉米黄粉为酶解原料，并未具体研究醇溶蛋白与谷蛋白不同比例的搭配增效作用。本发明的创新在于通过改变醇溶蛋白与谷蛋白的比例搭配，利用有效生物酶解技术生产生物活性分子，显著提高玉米黄粉源肽类物质的醒酒功效的同时，大大提高了其经济利用空间。目前国内制备具有促乙醇代谢产品的专利简述如下：[1].公开号CN101411494A发明专利“玉米醒酒肽饮料及其制备方法”研究了一种复合配方的玉米肽醒酒饮料的制备方法，以玉米黄粉直接作为反应底物生物酶解，加入多种复合剂例如甜味剂、酸味剂等制备功能性醒酒饮料，并未针对其中两种主要不同源蛋白质进行相应酶解研究；[2].公开号CN101455835A发明专利“一种解酒的蛋白肽复合营养液微球及其制备方法”并未指明何种植物蛋白肽，且同样加入多味中医解酒方子中的成分如橘皮水提物等，成分复杂；[3].申请公开号CN101837116A发明专利“一种以酿酒酵母为主要原料的护肝解酒产品”主要研究了酵母发酵产生的多种维生素和还原性谷胱甘肽对于肝脏保护的作用，也并未涉及到植物蛋白源多肽的相关内容；[4].申请公开号CN102028093A发明专利“玉米醒酒肽的制备方法”中，采用玉米黄粉为直接原料，碱性蛋白酶酶解联合复合蛋白酶酶解，超滤、浓缩、喷雾获取肽粉，肽粉中含大量玉米黄色素等，成分复杂，功效成分不突出；[5].申请公开号CN102174625A发明专利“一种玉米肽的制备方法”中，将玉米黄粉直接加入醇溶体系中酶解，借助体系中醇溶蛋白表现出的良好溶解性，获得高水解度肽段，但酶在醇溶体系中酶活表现不佳，耗能高。对比以上所公开的专利内容，本发明侧重于通过改变玉米醇溶蛋白与谷蛋白的比例搭配后再进行有效分段酶解，所得粗肽产品醒酒效果显著，产品得率极高，且生产过程条件温和，环境友好。
技术实现要素：
本发明提供了一种新型的玉米蛋白源促乙醇代谢多肽的制备方法。一种新型的玉米蛋白源促乙醇代谢多肽的制备方法，包括下列步骤：(1)玉米黄粉原料预处理去除淀粉：取玉米黄粉中加水，于pH7.5-8.5下加入α-淀粉酶，在温度为50～55℃，水浴40～60min离心除去残余淀粉；所述玉米黄粉与水的体积比为1：6～1：9；(2)醇溶蛋白及谷蛋白的提取：将除去残渣淀粉的玉米黄粉经水洗，以1：12～1：16g/ml料液比加入体积浓度为77％～85％乙醇溶液，搅拌3.0～4.0h后离心，得到上清液及残渣，分开处理：a.上清液使用乙醇稀释至体积浓度为42％～48％后于8,000～10,000rpm离心得醇溶蛋白；b.残渣水洗2～3次后按料液体积比1：7～1：9加入质量百分比浓度为0.5～0.8％的NaOH溶液，于温度38～48℃搅拌1.5～3.0h，离心得上清液调整pH至4.0-4.8析出沉淀，8,000～10,000rpm离心得谷蛋白；(3)醇溶蛋白与谷蛋白混合酶解产物的制备：将提取后的醇溶蛋白与谷蛋白按质量比为1：0～1：1混合后分两步酶解；两步酶解过程中酶解温度均为55±0.5℃，第一步加酶量占总底物蛋白质量的1.0～2.0％、酶解时间为2.0～3.0h，酶解过程利用稀酸或稀碱稳定酶解体系的pH值在8.0-9.0范围内，沸水浴灭活8min～12min；第二步加酶量占总底物蛋白质量的1.5～2.5％、酶解时间为4.0～6.0h，酶解过程利用稀酸或稀碱稳定酶解体系的pH值在9.5-10.5范围内，沸水浴灭活8min～12min，冷却至室温后8,000～10,000rpm离心分离，抽滤得到上清酶解液；(4)上清酶解液冷冻干燥得玉米蛋白源促乙醇代谢多肽。通过乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒测定体外醒酒活性；试食人群服用多肽后饮酒通过警用血液酒精测定仪测定体内醒酒活性。所得粗多肽具备显著的促乙醇代谢活性。经凝胶色谱分析测定目标活性肽分子量普遍低于1kDa。上述方法中，步骤(1)中所述α-淀粉酶用量为10～40mg/g，处理时间为40～60min。上述方法中，步骤(3)中，第一步选用木瓜蛋白酶、胰酶及风味蛋白酶中任一种；第二步选用复合蛋白酶或碱性蛋白酶中任一种；第一步酶解料液体积比为1：5～1：7，第二步酶解料液体积比为1：6～1：8。上述方法中，步骤(4)所述冷冻干燥得到的玉米肽粉具备醒酒活性，是通过乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒测定体外醒酒活性；试食人群服用多肽后饮酒通过警用血液酒精测定仪测定体内醒酒活性。上述方法中，步骤(2)或步骤(3)中所述8,000～10,000rpm离心的条件均为：于4℃下离心15min。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明初步得到醒酒肽的作用机制，发现醇溶蛋白与谷蛋白不同比例搭配所得多肽的醒酒活性不同，且谷蛋白的贡献更大，该发现有利于进一步解释肽的醒酒机理，对于开发高效的醒酒健康产品提供重要的思路。2、本发明采用交通警察执法工具——警用血液酒精测定仪对玉米醒酒肽效果进行测定，数据可靠、说服力强。3、本发明公开的一种玉米蛋白源促乙醇代谢粗肽的生产、制备方法，产品功效显著，安全性高，可规模化生产。具体实施方式为了更好的理解本发明、研究活性粗肽对酒精代谢的促进作用，进行了如下验证，验证手段如下：(1)凝胶色谱法测定分子量分布。采用岛津LC-20A液相处理系统【岛津(中国)有限公司】；色谱柱：TSK-GELG2000SWXL7.8mm×300mm【东曹(上海)生物科技有限公司】。分子量标准品：细胞色素C，纯度95％以上；抑肽酶，纯度99％以上；氧化型谷胱甘肽，纯度99％以上；甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸，纯度99％以上，以上标准品均购于美国西格玛奥德里奇公司。采用以上设备及条件测定活性多肽分子量范围。(2)体外ADH激活率测定。采用ADH试剂盒联用ADH酶液测定各活性多肽对ADH酶活的激发作用。具体方法如下：ADH试剂盒缓冲液试剂一0.65ml(1：1超纯水稀释)，加入0.75ml辅酶试剂三(粉剂，临用前10ml超纯水稀释)，之后空白组加0.05ml乙醇现液；测定组加0.03ml配置的ADH溶液和0.02ml超纯水；实验组加0.03ml配置的ADH溶液和0.02ml、3mg/ml肽溶液，37℃温育，从加入样品混匀开始计时，测定A340nm，十秒记录一次到第10min截止。以时间为横坐标，A340nm为纵坐标作图，斜率即可作为ADH相对酶活。ADH活力激活率计算公式：ADH激活率(％)＝[(K实验组-K空白组)-(K测定组-K空白组)]/(K测定组-K空白组)*100％(3)体内ADH激活率测定。募集15名健康成年男性志愿者(年龄区间25-45岁)，空腹进行测定。按照如下程序测定活性多肽在人体内对酒精代谢促进作用：首先，饮酒前20min服用所得玉米肽；然后30s内饮用白酒60ml；再次每隔15min，测定呼气酒精含量；最后记录到2.0h截止，计算激活率。记录显示酒精含量随时间变化快慢即反映了体内ADH乙醇脱氢酶活性高低；对比饮酒前无服用活性肽组别，计算活性肽在体内对ADH激活率。每隔两周测定一次，共测定三次。实例对本发明进行进一步的解释和说明，但任何基于如下实例采用的变形手段及方式，本发明要求都属于保护范围内。实施例1(1)玉米黄粉原料预处理去除淀粉：玉米黄粉(质量100g)1：6(v/v)加水，pH7.5下加入α-淀粉酶(10mg/g)，温度50℃，水浴40min离心除去残余淀粉。(2)醇溶蛋白及谷蛋白的提取：将除去残余淀粉的玉米黄粉水洗3次，以1：12(m/v,单位：g/ml)加入乙醇溶液(77％，v/v)，搅拌3.0h后离心所得上清液及残渣分开处理：a.上清液稀释乙醇浓度至45％(v/v)后于8,000rpm(4℃，15min)离心得醇溶蛋白；b.残渣水洗3次后按料液比1：7(v/v)加入NaOH溶液(0.5％，m/m)，于温度38℃搅拌1.5h，离心得上清液调整pH至4.0析出沉淀，8,000rpm(4℃，15min)离心得谷蛋白。(3)醇溶蛋白酶解产物的制备：将提取后的醇溶蛋白分两段进行酶解。第一段酶解选用木瓜蛋白酶(广州华琪生物技术有限公司)(加酶量1.0％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间2.0h；酶解pH8.0)；第二段酶解选用复合蛋白酶(广西庞博生物工程有限公司)(加酶量为1.5％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间4.0h；酶解pH9.5)。第一段、第二段酶解结束时均采用沸水浴灭活(100℃，10min)，第二段灭活后冷却至室温，8,000rpm(4℃，15min)离心分离，抽滤得到上清酶解液。(4)冷冻干燥得玉米促乙醇代谢多肽；通过乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒测定体外醒酒活性；15名试食人群服用多肽后饮酒通过警用血液酒精测定仪测定体内醒酒活性，每隔两周测定一次，测定三次结果取平均值。实施例2(1)玉米黄粉原料预处理去除淀粉：玉米黄粉(质量100g)1：9(v/v)加水，pH7.5下加入α-淀粉酶(40mg/g)，温度55℃，水浴60min离心除去残余淀粉。(2)醇溶蛋白及谷蛋白的提取：将除去残余淀粉的玉米黄粉水洗3次，以1：16(m/v,单位：g/ml)加入乙醇溶液(80％，v/v)，搅拌3.0h后离心所得上清液及残渣分开处理：a.上清液稀释乙醇浓度至45％(v/v)后于8,000rpm(4℃，15min)离心得醇溶蛋白；b.残渣水洗3次后按料液比1：9(v/v)加入NaOH溶液(0.8％，m/m)，于温度48℃搅拌3.0h，离心得上清液调整pH至4.8析出沉淀，8,000rpm(4℃，15min)离心得谷蛋白。(3)醇溶蛋白及其与谷蛋白混合物酶解产物的制备：将提取后的醇溶蛋白与谷蛋白按质量比为7：2混合后的混合物分两段进行酶解。第一段酶解选用胰酶(广西庞博生物工程有限公司)(加酶量占总底物蛋白质量的2.0％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间2.0h；酶解pH9.0)；第二段酶解选用碱性蛋白酶(广西庞博生物工程有限公司)(加酶量占总底物蛋白质量的2.5％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间为6.0h；酶解pH10.5)。第一段、第二段酶解结束后均采用沸水浴灭活(100℃，10min)，第二段灭酶后冷却至室温，8,000rpm(4℃，15min)离心分离，抽滤得到上清酶解液。(4)冷冻干燥得玉米促乙醇代谢多肽；通过乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒测定体外醒酒活性；15名试食人群服用多肽后饮酒通过警用血液酒精测定仪测定体内醒酒活性，每隔两周测定一次，测定三次结果取平均值。实施例3(1)玉米黄粉原料预处理去除淀粉：玉米黄粉(质量100g)1：8(v/v)加水，pH7.5下加入α-淀粉酶(25mg/g)，温度52℃，水浴50min离心除去残余淀粉。(2)醇溶蛋白及谷蛋白的提取：将除去残余淀粉的玉米黄粉水洗3次，以1：13(m/v,单位：g/ml)加入乙醇溶液(78％，v/v)，搅拌3.0h后离心所得上清液及残渣分开处理：a.上清液稀释乙醇浓度至45％(v/v)后于8,000rpm(4℃，15min)离心得醇溶蛋白；b.残渣水洗3次后按料液比1：8(v/v)加入NaOH溶液(0.7％，m/m)，于温度45℃搅拌2.0h，离心得上清液调整pH至4.5析出沉淀，8,000r(4℃，15min)离心得谷蛋白。(3)醇溶蛋白及其与谷蛋白混合物酶解产物的制备：将提取后的醇溶蛋白与谷蛋白按1：1混合后的混合物分两段进行酶解。第一段酶解选用风味蛋白酶(广西庞博生物工程有限公司)(加酶量2.0％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间2.0h；酶解pH8.5)；第二段酶解选用碱性蛋白酶(广西庞博生物工程有限公司)(加酶量2.0％；酶解温度55±0.5℃；酶解时间6.0h；酶解pH10.0)。第一段、第二段酶解结束后均采用沸水浴灭活(100℃，10min)，第二段灭活后冷却至室温，8,000rpm(4℃，15min)离心分离，抽滤得到上清酶解液。(4)冷冻干燥得玉米促乙醇代谢多肽；通过乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒测定体外醒酒活性；15名试食人群服用多肽后饮酒通过警用血液酒精测定仪测定体内醒酒活性，每隔两周测定一次，测定三次结果取平均值。实例结果分析：表1.玉米肽分子量分布及比例：各占比均以百分比(％)表示实施例1、2、3所制备活性肽分子量测定结果如表1中数据所示，采用本发明所要求酶解方案酶解，所得多肽分子量绝大部分均在1kDa以下，其中实施例1单一的醇溶蛋白酶解中，其酶解产物多肽96.7％分子量小于1kDa，占比最高且无大于10kDa的产物；实施例2、3中观察到随着酶解原料中谷蛋白比例增高，酶解产物平均分子量上升，分子量小于1kDa的比例减小，大于10kDa的比例略有增加。总体而言，实施例1、2、3所得多肽分子量均1kDa左右，有具备良好生物活性的基础。(二)酶解多肽体内外活性检测：实施例1、2、3所制备的醒酒多肽活性的测定结果如图1所示.单一醇溶蛋白酶解得肽在体内和体外的醒酒活性均较低，约在30％；改变酶解蛋白质原料比例特别是提高谷蛋白比例，醇溶蛋白与谷蛋白比例由7：2变为1：1时，酶解得肽活性显著升高。且随着谷蛋白比例的增大，所得多肽的体内、体外促乙醇代谢活性均有不同程度的增大，这说明谷蛋白酶解产物同样对醒酒活性有较大贡献。最后实施例3表明，当醇溶蛋白与谷蛋白比例为1：1时，体内、外解酒效果最佳，能充分提升乙醇在人体内的代谢速率，减轻对乙醇对人体伤害。