一种多环芳烃降解微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一种多环芳烃高效降解菌剂的制备及其在废水生物处理和污染土壤修复中的应用。

背景技术：
石油是一种含有多种烃类(正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃)及少量其他有机物(硫化物、氮化物、环烷酸类等)的复杂混合物。随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及其加工品进入环境，在其开采、运输、炼制和使用过程中不可避免的对环境造成了污染。石油及石油产品中普遍含有多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbons,简称PAHs)和酚类等有毒物质，PAHs是环境中普遍存在的一类有机污染物，它通常是指一类含有两个或两个以上苯环，以线状、角状或簇状排列的稠环型化合物，具有熔点和沸点较高、疏水性强、蒸汽压小、正辛醇-水分配系数高等特性。PAHs具有生物积累性和环境持久性，并且有致癌、致畸、致突变(三致)作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁。目前，美国环保局(USEPA)已将16种未带分支的PAHs列入了环境优先污染物的黑名单。环境中PAHs绝大多数积累于土壤中，在适宜的情况下它们可能迁移到其他环境介质中，扩大污染范围并改变暴露途径。农田中的PAHs多由污灌所致，它可以通过农作物以生物链的形式传递，将其积累于人体内，造成人体的损伤。多环芳烃农田污染土壤修复，尤其是强化长期污染土壤的修复显得十分重要和迫切。在污染环境中比较常见，难以降解的多环芳烃中，芘由于它的酮类代谢物比母体毒性更大且有致突变性，所以芘常被作为监测多环芳烃污染的指示物和其它多环芳烃生物降解的模型分子，成为多环芳烃中的代表物。利用微生物处理法解决环境中的PAHs污染问题已被广泛接受，其优点在于效果好、费用低、二次污染少等，是一类低耗高效和环境安全的生物修复技术。目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离得到很多能降解或转化某种多环芳烃的微生物。然而，这些游离微生物加入到修复现场中时可能由于土著菌的恶性竞争或难以适应环境而导致往往不能很好地应用于原位污染土壤的修复，故研制出一种可以克服这些弊端的多环芳烃高效降解菌剂已经成为目前污染环境治理和修复研究的热点问题之一。

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种多环芳烃降解微生物菌剂及其制备方法和应用。为了实现本发明的目的，本发明的多环芳烃降解微生物菌剂，其有效成分包括：微黄分支杆菌(Mycobacteriumgilvum)CP13；真菌绿色木霉；生物表面活性剂；所述生物表面活性剂为鼠李糖脂。本发明的微黄分支杆菌(Mycobacteriumgilvum)CP13，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.7963。该菌株已经在公开号为CN102824897A的专利中公开，属于现有技术。微黄分支杆菌的培养基成分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，琼脂20g/L，pΗ为7.0-7.2；绿色木霉的培养基成分为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pΗ7.0-7.2。一种多环芳烃降解微生物菌剂的制备方法，将微黄分支杆菌(Mycobacteriumgilvum)CP13和绿色木霉分别培养得到的菌液混合，同时添加硅藻土与改性花生壳的复合载体以及鼠李糖脂，进行微生物固定化，即制微生物菌剂。以复合载体质量计，混合后的菌液中还加入1％的苯甲酸，1％的玉米淀粉，1％的羧甲基纤维素钠和2％的甘油。所述鼠李糖脂与复合载体的重量比为1:200。固定化后的载体上微黄分支杆菌的数量至少为6×108个/g，绿色木霉的数量至少为6×108个/g，两菌株数量比为0.5～1。所述改性花生壳是用氢氧化钠和双氧水改性的花生壳，硅藻土与改性花生壳的质量比为1:1。本发明的多环芳烃降解微生物菌剂在降解水及土壤中多环芳烃中应用，所述的多环芳烃主要为芘。在降解污水时，菌剂的培养液为含多环芳烃的MSM培养液，菌剂的接种量以复合载体计算占污水重量的2％，降解时间为5天以上；在降解土壤时，菌剂的接种量以复合载体计算占污染土壤重量的2％，降解时间为36天以上。所述菌剂降解多环芳烃的温度为30℃，pH值为4.0～9.0。所述MSM培养液的配方为：100mg/L(NH4)2SO4，20mg/LMgSO4·7H2O，10mg/LCaCl2·2H2O；微量元素：1.2mg/LFeSO4·7H2O，0.3mg/LMnSO4·H2O，0.3mg/LZnSO4·7H2O，0.1mg/LCoSO4·7H2O，0.1mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O；磷酸盐缓冲溶液：2.5g/LK2HPO3，0.77g/LKH2PO4，pH值为7.2～7.4。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)采用农业废弃物作为载体，菌剂制备的成本得到降低，成本低至0.24元/kg，花生壳作为载体可以为微生物的生长提供大量碳源，可实现花生壳的“变废为宝”。此外，花生壳经过改性后表面形成多孔结构，便于微生物吸附，二次增殖，具有很高的生物活性。菌剂中加入的真菌可在土中繁殖菌丝，可蓬松土壤，为细菌的生长及繁殖提供有利的环境。(2)本发明菌剂适应的PH值范围很广，对多环芳烃污染具有超强去除能力，可用于石油污染水体和土壤的生物修复及含多环芳烃工业废水的生物处理。(3)本菌剂成本低至0.24元/kg，且易于储存运输，有效保藏的时间很长，常温下货架期可达半年之久。(4)由本发明的微生物菌剂由降解多种三环PAHs和四环PAHs的安全的微黄分枝杆菌CP13和绿色木霉等2个菌种组成。具有去除水及土壤中多种多环芳烃的能力，适合南方水稻土、菜园土、红壤等土壤类型，具有修复多环芳烃污染土壤的显著效果。附图说明图1室温保藏时间对本发明菌剂降解芘的影响图。图2不同pH值对本发明菌剂降解芘的影响图。图3本发明生物菌剂对芘污染土壤的修复过程中，土壤中芘残留量变化图。图4本发明生物菌剂对含芘污水中的芘的降解率图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。实施例1本发明的微黄分枝杆菌CP13菌株的培养方法：将CP13菌株分别划线接种于营养肉汁培养基上，28-30℃培养48h，然后分别接入500mL三角瓶，在30℃，150r/min下，培养12h。然后按5％接种量接入到5L种子罐中，在180r/min，pH7.5，通气量5L/min下，培养24h。营养肉汁培养基，成分及用量(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaC15，琼脂20，调整pΗ7.0-7.2。本发明的绿色木霉的培养方法：将菌株(绿色木霉GIM3.141，购自广东省微生物菌种保藏中心)接种到PDA培养基，30℃静置培养5d。PDA培养基成分及用量(g/L)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，调整pΗ7.0-7.2。复合载体的制备：量取去离子水485ml和30％H2O215ml，倒入1000ml烧杯中配置成1％H2O2溶液。在1％H2O2溶液中加片状NaOH，将溶液pH调至11～12，称取11份10g烘干的花生壳粉末，加入溶液中，用恒温磁力搅拌器搅拌14h。搅拌后，用6mol/LHCl调节溶液pH至6～7，用尼龙网过滤。最后用去离子水洗涤，放入电热恒温鼓风干燥箱60℃下烘干至恒重，即制得改性花生壳。硅藻土与此得到的改性花生壳按质量比为1:1混合即得复合载体。多环芳烃降解微生物菌剂的制备：发酵完成后，将CP13菌液、绿色木霉菌液、鼠李糖脂5g和复合载体1000g混匀，使得载体上的微生物数量每种各为6×108个/g，以复合载体质量计，混合后的菌液中还加入1％的苯甲酸，1％的玉米淀粉，1％的羧甲基纤维素钠和2％的甘油。无菌装袋封口，常温保藏。实施例2将实施例1制得的菌剂在经过一定时间的室温保藏后，按10％(V/V)的比例将该菌剂接种至芘浓度10mg/L的MSM培养液中，以不含有菌剂的含芘MSM培养液为空白，置于30℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养2天后测定培养液中芘的剩余量。由图1可知，本菌剂在室温保藏170d内对各芘初始浓度的降解率维持在60％-66％。本实施例说明该菌剂可在室温情况下较好地有效保藏，有效保藏时间在170d以上，为多环芳烃污染环境的生物修复提供了保证。实施例3将实施例1制得的菌剂按10％(V/V)的比例接种至芘浓度10mg/L的MSM培养液中，以不含该菌剂的含芘MSM培养液为空白，置于30℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养2天后测定培养液中芘的剩余量。由图2可知，本发明菌剂在pH4～9条件下均可有效降解多环芳烃芘，与游离菌相比具有更广的pH适应范围。本实施例说明本发明多环芳烃降解微生物菌剂在酸性，中性和碱性的较宽pH范围内均能较好的降解芘，为其在不同pH环境中的应用提供了保证。实施例4本发明生物菌剂对芘污染土壤的修复实验在500ml烧杯中装有350g已经加入芘50mg/kg土的不灭菌土壤，土壤中加入实施例1的菌剂(CP13与绿色木霉的组合)20g/kg土壤，使得初始接种量为107个/g土。游离CP13作为对照，使用量同样为107个/g土，在30度恒温箱中培养。培养6d、12d、18d、36d后，取样测定土壤中芘的残留量。图3的结果表明：使用本发明菌剂对含有芘50mg/kg的土壤修复6d、12d、18d、36d后，土壤中芘的残留量分别达到42.31，38.03，22.18，4.95mg/kg干土，而对应的游离菌对照的土壤中芘的残留量分别达到43.69，41.00，37.50，28.56mg/kg干土。由此可见，本发明菌剂比游离菌对照可大幅提高土壤中的芘的降解量，提高量最高可达25mg/kg干土左右。实施例5将实施例1制得的菌剂按10％(V/V)的比例接种至芘浓度10mg/L的MSM培养液中，以不含该菌剂的含芘MSM培养液为空白，置于30℃的摇床中，在150r/min条件下避光振荡培养，每天测定培养液中芘的剩余量。由图4可知，降解至第4d时，游离菌与本菌剂对芘的去除率分别达到70.84％和91.72％，本菌剂比游离菌的去除率提高21％。第5d时二者分别为80.00％和94.72％，本菌剂比游离菌的去除率提高14％。