人类aldh2基因多态性检测特异性引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种人类ALDH2基因多态性检测特异性 引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH)是一种催化乙醛以及其他脂肪 族醛氧化的四联体蛋白酶。目前，已发现有19种ALDH同工酶，研宄较为深入的主要有胞 质同工酶ALDHl和线粒体同工酶ALDH2,其中ALDH2在肝脏和胃中具有很高的表达量，是人 体乙醇代谢途径中关键酶之一。
[0003] 人类ALDH2基因位于人类第12号染色体的12q24. 2,总长约44kb，含有13个外 显子，编码有517个氨基酸残基的多肽，目前发现存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys 等多种突变体，其中主要突变体是Glu504Lys(rs671)，即位于12号外显子的单碱基突变 G1510A。正常的等位基因记为ALDH2*1 (*1510G)，突变的等位基因记为ALDH2*2 (*1510A)。 ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，研宄显示中国人ALDH2*2的频率为16 %，日本人 24%，泰国人5%，韩国人15%，印度人2%，但在白种人与黑人人群中频率很低，甚至完全 缺乏。研宄显示，突变型等位基因 ALDH2*2的乙醛脱氢酶活性及硝酸酯酶活性基本丧失。
[0004] ALDH2*2/*2纯合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的2%，ALDH2*l/*2 杂合突变型乙醛脱氢酶活性约为ALDH2*1野生型的13-14%。突变型基因 ALDH2*2的存在与 酒精性中毒、酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD)、消化道癌症等疾病有关。研宄 显示，携带ALDH2*2突变基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。在饮酒人群中，尤 其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变（食道癌、 口咽癌等）的几率较高。此外，ALDH2*2显性突变与胃癌的易感性也存在一定的联系。研 宄显示，ALDH2*2突变人群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、 12. 95倍、11. 72倍以上。
[0005] ALDH2同时也是硝酸甘油有效代谢物NO形成的关键，ALDH2*2突变会导致硝酸酯 酶活性降低，使得硝酸甘油在体内生物转化过程受阻，有效活性产物NO生成减少，进而导 致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。研宄表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛 的疗效明显优于ALDH2*2患者，野生型ALDH2对硝酸甘油的催化活性（Vmax/Km)大约是突 变型的10倍，且前者迅速起效率也明显高于后者。ALDH2*2/*2纯合突变型硝酸酯酶活性约 为ALDH2*1野生型的6-7%，ALDH2*l/*2杂合突变型硝酸酯酶活性约为ALDH2*1野生型的 8-15%。同时，ALDH2突变基因携带者服用硝酸甘油无效风险也在大幅增加，ALDH2纯合及 杂合突变型使用无效率达到42. 4%，大约为ALDH2野生型的3倍。ALDH2基因多态性如表 1所示。
[0006] 表1 :ALDH2基因多态性
[0007]
[0008] 目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶 解曲线检测法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常 见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备 要求比较特殊，临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但 该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态 性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种 快速有效的检测少量样本的ALDH2基因多态性的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明实施例的目的在于，克服现有技术中的不足，提供一种人类ALDH2基因多 态性检测特异性引物和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多 态性检测效果不理想的问题。
[0010] 本发明提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 本发明还提供了一种人类ALDH2基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明 所述的特异性引物。
[0012] 所述试剂盒还包括一组如SEQ ID NO. 3与SEQ ID NO. 4荧光定量PCR探针序列， 且所述荧光定量PCR探针的5'端有FAM或VIC修饰，3'端有NFQ-MGB修饰。
[0013] 试剂盒采用Taqman探针法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性 的多重荧光定量PCR检测方法，通过能特异性识别野生型和突变型模板的探针序列，有效 区分同一基因的两种多态性，同时引入内标系统和UNG酶防污染系统，能更加准确、稳定地 对样品进行分型检测。本发明的试剂盒具有以下优点：1.可以准确检测单个样品的基因 型；2.可以准确检测Ing基因组DNA的基因型；3.针对ALDH2的基因型设计SNP分型探针， 可以特异性扩增识别对应基因的多态性；4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均 为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统，确保结果真实可信；5.在同一反 应管中检测同一基因两种多态性，操作简便，能在90分钟内完成检测，且结果判读方法简 单客观，便于分析。
【附图说明】
[0014] 图1为ALDH2*1/*1纯合野生样本43例检测结果；
[0015] 图2为ALDH2*l/*2杂合突变样本16例检测结果；
[0016] 图3为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果；
[0017] 图4为ALDH2*1/*1纯合野生样本40例检测结果；
[0018] 图5为ALDH2*l/*2杂合突变样本9例检测结果；
[0019] 图6为ALDH2*2/*2纯合突变样本1例检测结果。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以 解释本发明，并不限定本发明。
[0021] 本发明的一个方面提供了一种人类ALDH2基因多态性检测特异性引物，其中，正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0022] 本发明还提供了一种用于人类ALDH2基因多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括 PCR缓冲液，1组特异性引物，1组荧光定量PCR探针和内标系统，Hot Start Taq酶，UNG酶。
[0023] 所述特异性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示。扩增包含ALDH2*1和ALDH2*2基因多态性的DNA片段。
[0024] ALDH2*1 上游引物 5' -TTGGAGCCCAGTCAC-3' SEQ ID N0:1
[0025] ALDH2*2 下游引物 5' -CCTCAAGCCCCAAC-3' SEQ ID N0:2
[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述PCR缓冲液中含有1. 0~5. OmM的MgCl2,1. 0~ 5. OmM 的 dNTPs，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 L 0 ~5. OmM。
[0027] 所述荧光定量PCR探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有非荧光淬灭基团 NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，该基团本身不产生焚光，因此可以大大降低本底信号的 强度，同时该荧光定量PCR探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10°C 左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具 有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
[0028] 优选地，所述荧光定量PCR探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3与SEQ ID NO. 4所 示，SEQ ID NO. 3特异性检测ALDH2*1的模板DNA ;