口腔生物膜模型及其用途的制作方法

生物膜被定义为嵌入细胞外聚合物的基质中的固着群落，其特征在于不可逆地附着至表面或彼此的细胞。生物膜群落可由单一种类的微生物形成，但在自然界中，生物膜几乎总是由许多细菌种类的混合物组成。例如，在典型的牙菌斑生物膜中已鉴定了超过500种细菌物种。

体内牙菌斑的起始和生长以及生物膜一般而言由几个阶段组成，并且是由生物和物理化学来源的许多因素决定的复杂过程。流体动力学也在细菌附着和生物膜形成中起作用。在哺乳动物中的生物膜形成的早期阶段，例如，表面形貌也可能是决定细菌对表面的粘附的主要因素。由于粗糙表面的表面积增加，粗糙表面在给定时间段内可能趋于积累比平滑表面更多的细菌。

然而，可用于评估生物膜形成的体外口腔生物膜模型并未考虑唾液流动和剪切条件。相应地，这种模型更适于研究牙周病原体，而不是研究菌斑相关病原体和菌斑形成。此外，使用常规体外生物膜模型的研究已证明增加的表面粗糙度和增加的生物膜积累之间无关联。因此，仍然需要允许对牙齿或植入物表面上的生物膜形成的更真实分析的口腔生物膜模型，以及用于评估抛光制剂的方法。

技术实现要素：

本公开内容涉及包括下述的口腔生物膜模型：包括第一表面、第二表面和固定地附着至第一表面的多个样本的基底，其中口腔生物膜能够在样本上形成，并且其中多个样本中的至少一个的表面粗糙度小于或大于多个中的至少第二样本的表面粗糙度；以及具有限定容器的侧面和底部的本体，本体适于接纳基底和多个样本，并且还适于接纳流体。

在另一个方面，本公开内容涉及用于生长口腔生物膜的方法，所述方法包括：在基底上提供至少第一样本和第二样本，其中第一样本包括的表面粗糙度小于或大于第二样本的表面粗糙度，其中口腔生物膜能够在样本上形成；提供包括液体生长培养基的容器，其中所述液体生长培养基包括能够进行口腔生物膜生产的微生物；搅动液体生长培养基；将包括至少第一样本和第二样本的基底悬浮在容器中；并且使至少第一样本和第二样本与包括微生物的液体生长培养基一起温育，由此在至少第一样本和第二样本上形成生物膜。

在另外一个方面，本公开内容涉及用于鉴定用于降低或抑制生物膜形成的试剂的方法，所述方法包括：在基底上提供至少第一样本和第二样本，其中第一样本包括的表面粗糙度小于或大于第二样本的表面粗糙度，其中口腔生物膜能够在样本上形成；提供包括液体生长培养基的容器，其中所述液体生长培养基包括能够进行牙齿生物膜生产的微生物；使至少第一样本与测试试剂接触；搅动液体生长培养基；使与测试试剂接触后的至少第一样本和第二样本悬浮于容器中；使与测试试剂接触后的至少第一样本和第二样本与包括微生物的液体生长培养基一起温育；并且比较在至少第一样本和第二样本上形成的生物膜的量，其中与至少第二样本上的生物膜形成量相比较，至少第一样本上的生物膜形成的量减少指示测试试剂降低或抑制生物膜形成。

本公开内容的进一步适用范围根据下文提供的详细描述将变得显而易见。应当理解详细描述和具体实例虽然指示本公开内容的优选实施例，但预期仅用于举例说明性目的，并且不预期限制本公开内容的范围。

附图说明

本公开内容根据详细描述和附图将得到更充分地理解，其中：

图1描绘了容器的实施例。

图2描绘了容器和基底的实施例。

图3描绘了嵌入样本的基底的实施例。

图4a描绘了三格研究的分层：用美白牙膏刷过的牙釉质相对于粗糙牙釉质相对于抛光牙釉质。图4b描绘了两格研究的分层：用敏感牙膏刷过的牙釉质相对于粗糙牙釉质。

图5显示了在100X放大率下的牙釉质表面的代表性共焦图像。图5a：酸蚀刻的牙釉质，图5b：抛光的牙釉质，图5c：用测试美白牙膏刷过的酸蚀刻的牙釉质，图5d：用测试敏感牙膏刷过的酸蚀刻的牙釉质。

图6显示了在牙釉质块上经过6小时对表面积标准化的总细菌积累。

图7显示了在牙釉质块上经过6小时对表面积标准化的总细菌积累。

具体实施方式

下述描述本质上仅是示例性的，并且决不预期限制本公开内容、其应用或用途。

如自始至终使用的，范围用作描述在范围内的每个和每一个值的简写。可选择范围内的任何值作为范围的终点。另外，本文引用的所有参考文献均以引用的方式在此全文并入。在本公开内容中的定义和引用的参考文献的定义冲突的情况下，以本公开内容为准。

除非另有说明，否则本文和说明书其他地方所表示的所有百分比和数量应当理解为指按重量计的百分比。给出的量基于材料的有效重量。

口腔生物膜模型

本公开内容涉及固定体积的动态口腔生物膜模型，用于评价具有不同表面粗糙度的样本上的口腔生物膜形成的方法，以及使用口腔生物膜模型测试试剂例如口腔产品组合物的方法。

如本文使用的，口腔生物膜指嵌入细胞外多糖基质中并附着至固体表面的三维结构化细菌群落，所述固体表面例如牙釉质、根部或牙植入物的表面。

本公开内容的口腔生物膜模型包括粘附至基底的样本。如本文使用的，术语“样本”指可在其上形成口腔生物膜的天然或合成材料。天然样本的例子包括拔出的哺乳动物牙齿、哺乳动物牙釉质和哺乳动物牙本质。天然样本可得自任何哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、骆驼、猫、黑猩猩、灰鼠、牛、犬、山羊、大猩猩、马、美洲驼、小鼠、猪、鼠、大鼠和绵羊。拔出的哺乳动物牙齿例如牛和/或人牙齿是商购可得的。拔出的人牙齿也可得自牙科诊所。在一些实施例中，天然样本是牛牙釉质。

用于样本的有用合成材料包括用于形成牙植入物的合成材料，例如钛、陶瓷。允许生物膜形成的其他合成材料包括但不限于合成羟基磷灰石、玻璃、硅、氨基甲酸酯或类似材料。

合成材料样本可为任何形状，包括以几何形状的形式，例如正方形或圆柱体。样本还可包括例如玻璃或塑料珠或盘。在一些实施例中，合成材料被建模以形成哺乳动物的牙齿。

使用本领域已知的任何方法将样本固定地附着至基底，包括使用粘合剂例如生物相容性粘合剂，例如牙科粘合剂。在一些实施例中，使用模型粘土将样本粘附至基底。在另一个实施例中，可使用硅酮建模腻子(puddy)或其他铸模树脂。

在一些实施例中，超过一个样本，例如至少2、4、6、12、24、36、50、60或更多个样本粘附至基底。相应地，基底可含有与之附着的多个样本。

在一些实施例中，多个样本中的至少第一样本的至少表面粗糙度小于或大于多个样本中的至少第二样本的表面粗糙度。即，所有的样本均可共享相同的表面粗糙度，而样本之一具有比基底上的多个样本的剩余部分更大或更小的表面粗糙度。可替代地，粘附至基底的1、2、3、4、5、10、20、50、100个或更多个样本可共享相同的表面粗糙度，而在基底上的多个样本的剩余部分共享不同的表面粗糙度。在其他实施例中，多个样本各自具有不同的表面粗糙度。在另外其他实施例中，基底将具有其中存在至少1、2、3、4、5、6、10、20、50、80或100个或更多个表面粗糙度值的样本，所述表面粗糙度值不同于多个样本的剩余部分中的表面粗糙度值。

如本文使用的，“表面粗糙度”指样本表面的微观结构纹理。表面粗糙度可根据本领域已知的许多参数进行测量，包括但不限于平均表面粗糙度Ra；Rq(也称RMS；均方根粗糙度)；Rt(样品表面上的最大粗糙度深度)；Rz(平均最大峰到谷高度)；和Rmax(最大表面粗糙度)。表面粗糙度可根据平均表面粗糙度Ra进行测量。Ra是距离在采样长度内测量的平均线的粗糙度分量不规则的算术平均高度。较小的Ra值指示更平滑的表面。表面粗糙度可通过本领域已知的用于测量Ra的任何方法进行测量，所述方法例如表面轮廓测量法、表面扫描法、共焦显微镜检查、原子力显微镜检查和扫描电子显微镜检查。表面粗糙度可在至少一个治疗期之前或之后以及在任何后续的基本暴露于其他试剂(例如再矿化溶液(包括唾液))或测试试剂之前进行测量。

在一些实施例中，平均Ra值范围为约2500nm至约5nm、2000nm至约10nm、约1000nm至约40nm、约750nm至约40nm、约250nm至约20nm、约200nm至约60nm、约50nm、约40nm或约30nm。在其他实施例中，平均Ra大于约250nm。

样本的表面粗糙度可通过酸蚀刻赋予。例如，可将样本浸入含有37重量％磷酸的溶液中一分钟。在其他实施例中，可将样本浸入含有5％柠檬酸混合物的溶液中30秒。

在另外其他实施例中，通过用试剂刷洗酸蚀刻后的样本可降低样本的表面粗糙度，所述试剂将表面粗糙度减少至所需的表面粗糙度。该试剂可含有例如水合二氧化硅、水合氧化铝、碳酸钙或磷酸二钙。在一些实施例中，该试剂采取牙膏、凝胶、液体或乳膏的形式。

基底可为玻璃基底、金属基底、聚苯乙烯基底、聚乙烯基底、乙酸乙烯酯基底、聚丙烯基底、聚甲基丙烯酸酯基底、聚丙烯酸酯基底、聚乙烯基底、聚环氧乙烷基底、聚硅酸酯基底、聚碳酸酯基底、聚四氟乙烯基底、碳氟化合物基底、尼龙基底、硅基底、橡胶基底、聚酐基底、聚乙醇酸基底、聚羟基酸基底、聚酯基底、聚己内酯基底、聚羟基丁酸酯、聚磷腈、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、硅铸模树脂或其他铸模树脂、及其组合。

在实施例中，在本公开内容的口腔生物膜模型中使用的基底具有在约100mm²和3000mm²之间，通常在约100mm²和2500mm²之间，更通常在2200mm²和500mm²之间，且再更通常在2000mm²和500mm²之间的表面积。在一些实施例中，基底是显微镜载玻片，例如玻璃显微镜载玻片的尺寸和形状，通常为25mm×75mm。

在将样本固定至基底之后，将样本悬浮在含有液体生长培养基的容器内。本公开内容的容器可被设计成容纳例如1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个分开的基底。在一些实施例中，本公开内容的口腔生物膜模型的每个基底包括具有相同面积的表面，而在其他实施例中，本公开内容的口腔生物膜模型中的至少一个基底包括的表面积不同于口腔生物膜模型中的另一种基底的表面积。

容器适于接纳以流体密封连通的支撑基底和附着样本，所述流体密封连通能够在其中保留液体生长培养基。适当的容器包括例如商购可得的4-、6-、8-、12-、24-、96-或384-孔塑料组织板或培养皿，例如100x15mm方形培养皿。用于容器的有用材料包括但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、共聚物(例如乙烯乙酸乙烯酯共聚物)等等。

现在参考图1，显示了含有两个基底支撑物(110)的容器(100)的视图。基底支撑物沿容器(100)的两侧平行对齐。在该实施例中，基底支撑物是3.5英寸移液管片(pipette piece)。然而，可使用悬浮基底和样本的任何其他合适的方法，例如，基底支撑物可在制造过程期间与容器(100)整体形成。在图1中所示的实施例中，将搅动棒(120)放置在容器中，以搅动液体生长培养基，促使生长培养基移动穿过样本。

现在参考图2，显示了含有两个基底(130)的容器(100)的视图。基底含有样本固定至其的第一表面(未示出)和第二表面(140)。每个基底(130)的每个远端(150)被放置在每个基底支撑物(110)上。样本固定至其的基底的第一表面悬浮于液体生长培养基中。

图3描绘了在第一表面(160)上具有建模粘土(170)的基底的第一表面(160)。样本(180)嵌入建模粘土(170)中。在一些实施例中，仅将一个基底置于容器中。在其他实施例中，可将各自含有样本(180)的两个、三个、四个、十个或二十个基底放置在容器中。

本文描述的口腔生物膜模型允许在含有液体生长培养基的容器(100)中同时测试具有不同表面粗糙度值的样本(180)。本公开内容的基底(130)允许通过从容器(100)中取出整个基底(130)来仔细监测和控制生物膜的暴露时间/生长时间，其中所有样本(180)被附着至基底(130)。因此，取出基底(130)的过程可与从液体生长培养基同时取出所有样本(180)关联。因此，基底(130)促进在每个样本(180)上均匀的生物膜形成，因为所有样本(180)均可在单个动作中从容器(100)中取出。均匀生物膜的生产可确保测试结果是统一和准确的。再进一步地，本公开内容的口腔生物膜模型允许生物膜形成的高流通量，因为可一次制备大量样本(180)。

充当含有生物膜形成生物的液体生长培养基的储库的容器(100)可生成跨越样本的剪切力。生成的剪切力允许在样本上的最佳生物膜形成。在容器中发展的剪切力可通过如图1和2中所示的搅动棒生成，或者例如可通过摇摆台或旋转振荡器生成。本文描述的固定体积的动态口腔生物膜模型的容器允许在类似于口中发生的流动、好氧条件下，对样本上生长的生物膜的更真实分析；而本领域已知的静态口腔生物膜模型并未考虑唾液流动、剪切和氧合条件。

使用口腔生物膜模型的方法

本公开内容的固定体积的动态口腔生物膜模型可用于生长生物膜，并且评价生物膜的特征。例如，可评价表面粗糙度对特定样本例如如本文所述的牙釉质样本的作用。将样本例如在37℃下在好氧条件下在含有液体生长培养基的容器中温育一段时间，以允许在样本上形成生物膜。允许生物膜形成的时间段范围为约2小时至约24小时、约3小时至约24小时、约3小时至约10小时、约4小时至约8小时，或可为约6小时。在温育期间，可通过提供液体生长培养基的搅动来促进生物膜形成，允许培养基流过样本。例如，可在容器中包括如上所述的搅动棒、摇摆台或旋转振荡器以促进搅动。在生物膜形成之后，生物膜可通过例如超声处理从样本中去除，以评价例如菌落形成单位(CFU)的量。

可与本文所述的模型和方法一起使用的液体生长培养基可为本领域已知的用于生长生物膜的任何液体生长培养基。例如，可使用补充有人血清(Sigma-Aldrich)的脑心浸液培养基(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、(4∶1)唾液样培养基(SLM、0.1％Lab Lemco Powder、0.2％酵母提取物、0.5％蛋白胨、0.25％来自猪胃的粘液蛋白III型(Sigma-Aldrich)、6mM NaCl、2.7mM KCl、3.5mM KH₂PO₄、1.5mM K₂HPO₄、0.05％尿素，pH 6.7)(1∶3)。可替代地，可使用不含任何葡萄糖或补充人血清(4∶1)、50mM葡萄糖或50mM蔗糖的化学成分确定的培养基(CDM)，参见以引用的方式并入本文的Rijn和Kessler，Infect Immun.，1984，27(2)：444-448。在一些实施例中，使用补充有蔗糖、氯高铁血红素、维生素K和新鲜或冷冻唾液的McBain培养基，参见以引用的方式并入本文的McBain等人，2005，“Development and characterization of a simple perfused oral microcosm”，J.Appl.Microbiol，98，624-634。在一些实施例中，液体生长培养基包含葡萄糖或蔗糖。

本公开内容的口腔生物膜模型适合于形成通过菌斑产生微生物引起的生物膜和/或形成通过负责牙周病的微生物引起的生物膜。在一些实施例中，该模型可用于形成通过菌斑产生微生物引起的生物膜。

在一些实施例中，液体生长培养基含有一种或多种生物膜形成生物。在一些实施例中，生物膜形成微生物是属于与牙周病相关的属的微生物，所述属包括但不限于密螺旋体属(Treponema)、拟杆菌属(Bacteroides)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线杆菌属(Actinobacillus)和艾肯菌属(Eikenella)。在其他实施例中，液体生长培养基含有一种或多种牙周相关物种，例如齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus，)、中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)亚种、纠缠真杆菌(Eubacterium nodatum)或星座链球菌(Streptococcus constellatus)。

在其他实施例中，液体生长培养基含有选自下述属的与牙菌斑形成相关的至少一种微生物：链球菌属(Streptococcus)、韦荣球菌属(Veillonella)、放线菌属(Actinomyces)、颗粒链菌属(Granulicatella)、纤毛菌属(Leptotrichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫单胞菌属(Thiomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)或奇异菌属(Atopobium)。在其他实施例中，液体生长培养基含有与牙菌斑形成相关的一个或多个物种，包括但不限于变形链球菌(Streptococcus mutans)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)和内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)。在其他实施例中，液体生长培养基至少含有变形链球菌。

在一些实施例中，液体生长培养基可含有来自哺乳动物供体的唾液，哺乳动物供体例如人、非人灵长类动物、骆驼、猫、黑猩猩、灰鼠、牛、犬、山羊、大猩猩、马、美洲驼、小鼠、猪、鼠、大鼠和绵羊。在一些实施例中，使用人唾液。

使用本公开内容的口腔生物膜模型，可评价表面粗糙度对生物膜形成的作用。可通过例如使用共焦激光扫描显微镜观察生物膜形态和/或对样本表面的粘附来测定生物膜形成的评价。也可测定每个形成的生物膜中的菌落形成单位的数目。存在于生物膜中的细菌的计数也可通过使用分子方法例如定量聚合酶链反应(qPCR或实时PCR)来实现。

另外，本公开内容的口腔生物膜模型可用于测试测试试剂例如以牙膏、凝胶、漱口剂、粉末或乳膏形式的口腔护理产品例如对样本的表面粗糙度的功效，以评价其对生物膜形成的作用。例如，在酸蚀刻之后，可将测试试剂例如口腔护理产品刷到样本上。在刷洗后，可将样本悬浮于液体生长培养基中并温育。在温育后，可通过共焦扫描显微镜检查、通过测定集落形成单位(CFU)的数目、或通过qPCR来评价生物膜，以测定测试试剂用于降低或抑制口腔生物膜的功效。

本公开内容的口腔生物膜模型并不限于用于测试表面粗糙度对生物膜形成的变化或测试与具有不同表面粗糙度值的样本组合的试剂。本公开内容的口腔生物膜模型可容易地用于比较例如不同微生物、不同样本和/或不同液体生长培养基和/或测试试剂和/或改变样本的表面粗糙度对生物膜形成的作用。例如，当本公开内容的口腔生物膜模型的容器是多孔板时，可在每个孔内掺入含有不同微生物的液体生长培养基。然后可使用本文所述的口腔生物膜模型，来评价单独或与表面粗糙度组合的不同微生物的效应。

实例

实例1.牙釉质样本的制备

预切割的牛牙釉质样本得自Bennet Amaechi、DDS、MS、PhD、FDI、在San Antonio，7703 Floyd Curl Drive，MC 7917，San Antonio，TX 78229-3900的Cariology，Department of Comprehensive Dentistry，University of Texas Health Science Center的教授和主管。使用丙烯酸铸模树脂将样本浇铸到38mm直径的盘内，以允许使用Buehler抛光机将样本抛光至镜面光洁度。

目视检查样本以确保牙釉质完全暴露且无缺陷。每个盘具有大约18至20个样本。将样本分为三组：抛光的、酸蚀刻的、酸蚀刻加用测试牙膏刷洗的。通过将样本浸入5％柠檬酸中30秒来完成酸蚀刻。使用测试牙膏的1∶3浆料，在Kal-Tech线性刷洗机上，对酸蚀刻样本的亚集进行刷洗。普通的平直修整牙刷用于刷洗样本。将刷毛张力调节至280g向下压力，并且将样本刷洗4500次。

使用Leica DCM3D共焦显微镜，使用蓝光和100x(NA 0.9)EP1-L镜头，测量各个样本的表面粗糙度。通过使用Leica Map软件分析形貌图像来获得Ra值。使用在明视野模式下操作的Olympus BX60显微镜，测量各个牙釉质样本的表面积测量。用Olympus MPlanAPO 1.25X/0.04镜头观察样本。使用Hitachi KP-M1U CCD相机和Scion Image PCI Frame抓取器捕获样本的图像。使用Scion Image 4.0软件进行面积计算。使用已知直径(5mm)的羟基磷灰石盘来校准面积测量值，并且将像素转换成表面积单位(mm²)。

实例2.根据表面粗糙度(抛光的、酸蚀刻的、和酸蚀刻/用测试牙膏刷洗的)与牙釉质样本的细菌附着

使用固定体积的动态流动口腔生物膜模型进行细菌附着研究。在该模型中，反应容器是100x15mm方形聚苯乙烯培养皿(Electron Microscopy Science)。使用建模粘土将牙釉质样本固定在显微镜载玻片上。小心地确保只有调理的牙釉质表面被暴露，并且具有牙釉质样本的粘土表面尽可能平坦，以使湍流中样本与样本以及载玻片与载玻片之间的变化最小化。对于特定的实验运行，使用三个反应容器。每个容器含有最多24个牙釉质样本(各具有12个样本的两个载玻片)。在实验1中，进行三格研究：粗糙相对于抛光相对于美白牙膏。对于实验2，进行两格研究：粗糙相对于敏感牙膏，以简化实验并增加统计功效。对于三格研究，确定需要两次运行(n＝48)以获得足够的能力来看出治疗之间的显著差异。对于两格研究，单次运行(N＝24)足以看到显著的治疗差异。牙釉质样本的分布在三个反应容器(标记为红色、绿色和蓝色用于三格研究，并且标记为红色、绿色和红色/绿色用于两格研究)中分层，以解释与流动相关的位置效应。图4a中显示了三格研究的分层，并且图4b中显示了两格研究的分层。不同颜色的块代表牙釉质样本中的不同处理。

实例3.用于生长和定量牙釉质块上的多种微生物生物膜的方案

A.半动态系统制备

将聚苯乙烯移液管切成两个3.5英寸片。将移液管片制成紧贴在正方形容器内。将移液管片用1∶10漂白溶液消毒30分钟，用无菌水彻底冲洗，然后使其干燥。如图3中所示，将样本在含有均匀分布的建模粘土层的基底(显微镜载玻片)的顶部上嵌入(12个/载玻片)。将块分层，使得每个载玻片中存在不同处理的样本，以平衡任何可能的位置效应。将显微镜载玻片紫外线灭菌(牙釉质块侧面朝上)30分钟。在无菌条件下，如图1中所示，将两个移液管片放置在含有小型无菌搅动棒的方形皿(容器)内。将显微镜载玻片转移到容器中，使得它如图2中所示被倒置放置在吸液管的顶部上。将容器紫外线灭菌另外30分钟。

B.唾液收集

用于唾液收集的人类供体的牙齿在取样前的晚上和在取样当天没有刷洗。在最后一餐和/或饮料后至少两个小时获取样品。要求唾液供体咀嚼石蜡膜，并且将唾液收集在无菌锥形管中，所述无菌锥形管在收集唾液期间保持在冰上。在无菌条件下，用60％无菌甘油1∶1稀释唾液样品。将唾液样品在无菌微量离心管内稀释成800μl等分样本。将唾液样品标记并贮存于-20℃下的管中直至使用。

C.培养皿接种和温育条件

使用40ml McBain培养基、400μl 20％无菌蔗糖、80μl 0.05％氯高铁血红素、1.6μl 0.5％维生素K和800μl新鲜或1.6ml在甘油中的冷冻唾液准备50ml无菌锥形管。将含有嵌入建模粘土中的样本的容器(方形培养皿)用唾液-McBain混合物接种。使容器在37℃下好氧温育，伴随轻轻搅动6小时。

D.生物膜的收获和菌落形成单位(CFU)的定量

在无菌条件下，将含有样本的载玻片从容器中取出并且浸没在45ml PBS pH 7.4中，以去除浮游细胞。用无菌镊子从载玻片中轻轻取出每个样本；并且将样本转移到预先标记的24孔板中的1ml PBS pH 7.4中。将悬浮液超声处理2分钟(30秒脉冲)。将悬浮液在PBS pH 7.4中连续稀释，并且在具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA II)板上铺平板，以测定CFU。用于计数的通常稀释度为10⁰-10^-3。使板在37℃下好氧温育48小时。通过菌落计数测定菌落形成单位(CFU)，并且结果报告为CFU/ml。

结果和总结

图5显示了抛光的牙釉质、酸蚀刻的牙釉质和在用测试牙膏刷洗之后酸蚀刻的牙釉质的代表性共焦图像。这些代表性图像的Ra值对于粗糙的为237nm，对于抛光的为26nm，对于美白牙膏为55nm，并且对于敏感牙膏为63nm。根据图5和Ra值，酸蚀刻表面清楚地具有最粗糙的表面形貌，随后为用测试牙膏刷洗的酸蚀刻的牙釉质，然后为高度抛光的牙釉质表面。图6和7显示了实验1和2的细菌附着结果。在上文实例1中上述的实验1中，成功测量了164个牙釉质样本中的159个的CFU值，和实验2的48个样本中的43个的CFU值。无法测量CFU值是细菌污染的结果。在实验1中，针对表面积标准化的平均细菌计数对于粗糙的为5054CFU/mm²，对于抛光的为1030CFU/mm²，并且对于美白牙膏为2077CFU/mm²。ANOVA分析显示处理效应是统计学显著的(p＝0.001)。使用Tukey检验在处理中的比较显示，与美白牙膏和抛光的牙釉质表面相比较，统计学显著(p＜0.05)更多的细菌在6小时时间段内粘附至粗糙牙釉质。美白牙膏处理的蚀刻牙釉质与高度抛光的牙釉质表面之间不存在统计学显著的(p＞0.05)差异。对于上述实例1中所述的实验2，将粗糙牙釉质与用敏感牙膏刷洗的酸蚀刻的牙釉质进行比较。在6小时后，与敏感牙膏处理的表面相比较，统计学显著(p＜0.05)更多的细菌在酸蚀刻的表面上积累。针对表面积标准化的平均细菌积累对于酸蚀刻的牙釉质为4299CFU/mm²，并且对于敏感牙膏为1647CFU/mm²。

总之，表面形貌可能是细菌粘附中的关键因素。在本研究中，探究了牙釉质表面粗糙度对6小时时间段内在牙釉质表面上的细菌积累的作用。检查了三种牙釉质表面：高度抛光的(抛光的)、酸蚀刻的(粗糙的)、以及酸蚀刻随后用含有在10％HCS基料(base)中的0.243％NaF(美白牙膏)或在10％HCS基料中的5％硝酸钾、0.243％NaF(敏感牙膏)的牙膏刷洗的。

通过共焦显微镜检查分析三种不同牙釉质样本处理组的表面形貌，指示了酸蚀刻、抛光和刷洗样本的粗糙度中的明确差异。酸蚀刻的牙釉质样本由于柠檬酸使表面粗糙而明显地丧失了显著量的反射率。用美白或敏感牙膏刷洗酸蚀刻的使牙釉质表面平滑，并且帮助恢复表面的反射率。抛光的牙釉质样本是三种表面中最光滑和最反射的，这是预期的，因为使用非常精细的金刚石研磨膏抛光了该表面。在实验1中，酸蚀刻、抛光和美白牙膏刷洗的牙釉质的比较显示，在牙釉质表面上发现的细菌数量与牙釉质的粗糙度呈正相关：酸腐蚀的牙釉质具有最多的细菌，随后为刷洗的牙釉质，然后为抛光的牙釉质。酸蚀刻的牙釉质与抛光的牙釉质相比较具有4.9倍更多的细菌/单位表面积，以及与美白牙膏相比较具有2.4倍更多的细菌/单位表面积。在实验2中，酸蚀刻的牙釉质与用敏感牙膏刷涂的牙釉质相比较具有2.6倍更多的细菌/单位表面积。粗糙和测试牙膏处理之间的差异的相对量级对于实验1和2是相似的。这是预期的，因为美白牙膏和敏感牙膏具有相同的清洁/抛光系统，并且差异主要在于颜色和敏感牙膏中5％KNO₃的存在。

总之，本研究的结果证实了表面粗糙度与牙釉质表面上的细菌粘附之间的正相关。牙釉质对酸的暴露使表面变粗糙，并且允许细菌更容易积累。在两种测试牙膏中使用的清洁/抛光系统能够使牙釉质抛光且平滑，导致与粗糙化的酸蚀刻的牙釉质相比较更少的细菌附着。