本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的制备方法。
背景技术：
雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，简称雄烯二酮、AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，简称雄二烯二酮、ADD)均是重要的甾体类药物中间体，很多甾体激素类药物都是以AD或ADD作为基础原料进行生产的。到目前为止，ADD的制备方法主要是化学合成法和微生物转化法。由于化学合成法耗材多、污染大、成本高，所以微生物降解植物甾醇转化法成为主流。
受限于甾醇类物质在水溶性的培养基中的溶解度，微生物对甾醇的利用率低，因而导致发酵周期较长，且AD和/或ADD的有效转化率不高。根据这些问题，现在产业化的AD和/或ADD的生产方法主要集中在双相发酵系统，即有机相-水相发酵系统，转化完成后的产物集中在有机相中，水相中会悬浮极少量的AD和/或ADD，发酵结束后可以通过萃取等技术把产物提取出来，然后进行纯化随后进行结晶而最后得到结晶。然而，双相发酵系统也会带来新的问题，比如现有技术中，中国专利申请CN1639354A的公开实例中，发酵液中的AD和/或ADD的提取一般均是先采用分批萃取的方法，采用有机溶剂对发酵液有机相进行多次的萃取后，再分别合并每次萃取的萃取液，整体进行减压回收溶剂后即得所需的AD和/或ADD的粗品。这样的处理均需要对产物所在的有机相进行萃取，而在萃取的实际操作过程中，由于对象是发酵液的粗产品，会产生严重的乳化现象。乳化现象的出现会直接导致萃取效率的下降以及部分产物的损失，从而影响最后的收率。因此，双相发酵系统一方面需要处理油回收的问题，另一方面需要在处理发酵液时面 对发酵液含油不易处理的问题，此外还因在萃取过程中使用了大量的有机溶剂可能导致环境污染。综合前述这些问题，本领域亟需对现有的ADD发酵提取工艺进行改进。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中ADD的发酵提取工艺目标产物损失多、收率低且提取工艺中使用有机溶剂较多从而容易造成环境污染的缺陷，而提供一种新的ADD发酵提取方法。
本发明的发明人通过探究实验发现，在发酵工艺中，若运用特定类型的大孔吸附树脂对发酵液进行提取，则有望减少损失，也可以减少有机溶剂的使用量。但是树脂的种类成百上千，并不是任意的大孔树脂均能用于提取ADD，不仅如此，若使用常规的发酵培养基发酵生产ADD，也不能很好地利用大孔吸附树脂进行提取。为了解决上述技术难题，发明人对发酵转化ADD的制备工艺进行了深入的研究和改进，最终发现：特定的培养基配合特定的分离提取方法，使用特定的吸附树脂，同时与其他工艺步骤和条件整体协同，能够解决上述问题。
为了解决上述技术问题，发明人通过大量实验研究，得到了本发明的技术方案，实现了如上所述的技术效果，具体如下。
本发明提供一种雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的制备方法，其包括如下步骤：
(1)向发酵培养基中接种分枝杆菌(Mycobacterium sp.)，发酵获得发酵液，所述的发酵培养基包括如下的组成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有机酸、0.5～3g/L无机氮源、5～20g/L有机碳源、35～50g/L有机氮源、1～3g/L无机盐A、0.1～0.5g/L无机盐B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶剂，所述的有机酸选自乙酸、丙酸、酒石酸和柠檬酸中的一种或多种，所述的无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和硝酸钠中的一种或多种，所述的有机碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一种或多种，所述的有 机氮源选自黄豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一种或多种，所述的无机盐A选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述的无机盐B选自硫酸镁、硫酸钠和硫酸钾中的一种或多种，所述的微量元素选自硫酸亚铁、硫酸锌、氯化锰中的一种或多种，所述的助溶剂选自吐温20、吐温80、乙醇和卵磷脂中的一种或多种；
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入乙醇，破碎处理后，固液分离取上清液，将上清液过强碱阴离子交换树脂的色谱柱，收集流出液，得到流出液I；
(3)将步骤(2)所得的流出液I上样至骨架为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂，使用甲醇溶液洗脱，得洗脱液II，将所述洗脱液II浓缩结晶，再以有机溶剂溶解后重结晶，即得雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮纯品，所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁脂和丙酮中的任一种。
步骤(1)为：向发酵培养基中接种分枝杆菌(Mycobacterium sp.)，发酵获得发酵液，所述的发酵培养基包括如下的组成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有机酸、0.5～3g/L无机氮源、5～20g/L有机碳源、35～50g/L有机氮源、1～3g/L无机盐A、0.1～0.5g/L无机盐B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶剂，所述的有机酸选自乙酸、丙酸、酒石酸和柠檬酸中的一种或多种，所述的无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和硝酸钠中的一种或多种，所述的有机碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一种或多种，所述的有机氮源选自黄豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一种或多种，所述的无机盐A选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述的无机盐B选自硫酸镁、硫酸钠和硫酸钾中的一种或多种，所述的微量元素选自硫酸亚铁、硫酸锌、氯化锰中的一种或多种，所述的助溶剂选自吐温20、吐温80、乙醇和卵磷脂中的一种或多种。其中，较佳地，所述的发酵培养基包括如下的组成成分：30～35g/L植物甾醇、1.5～2.5g/L有机酸、1～2g/L无机氮源、8～15g/L有机碳源、40～45g/L有机氮源、1.5～2.5g/L无机盐A、0.2～0.5g/L无机盐B、0.002～0.003g/L微量元素和2.5～3.5g/L助溶 剂。更佳地，33g/L植物甾醇、2g/L有机酸、1.5g/L无机氮源、10g/L有机碳源、40g/L有机氮源、2g/L无机盐A、0.3g/L无机盐B、0.006g/L微量元素和3g/L助溶剂。较佳地，所述的有机酸为柠檬酸。较佳地，所述的无机氮源为硫酸锌。较佳地，所述的有机碳源为葡萄糖。较佳地，所述的有机氮源为黄豆粉。较佳地，所述的无机盐A为磷酸二氢钠。较佳地，所述的无机盐B为硫酸镁。较佳地，所述的微量元素为氯化锰和硫酸亚铁。较佳地，所述的助溶剂为吐温80。较佳地，所述的发酵培养基还包括0.5～2.5g/L氨基酸，更佳地包括1.0～2.0g/L氨基酸，所述的氨基酸较佳地为选自谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和苏氨酸中的一种或多种，更佳地为谷氨酸。
所述的发酵为本领域常规所述，现有技术中常规发酵生产ADD的条件均可。较佳地，所述发酵的温度为28～32℃，更佳地为30℃。所述发酵的时间较佳地为48～96小时，更佳地为72～96小时。所述发酵的溶氧量较佳地为30～80％，更佳地为50～60％。所述的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)为本领域常规所述，较佳地选为Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856(购自美国模式培养物集存库ATCC)。如本领域常规，分枝杆菌在接种之前，一般先在种子罐中进行复壮培养达到一定种龄之后再进行接种。较佳地，所述分枝杆菌在种龄达40～50小时时进行接种，更佳地为48小时。所述分枝杆菌的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为3～6％，更佳地为5％，所述百分比为接种的种子液占发酵培养基的体积百分比。
步骤(2)为：向步骤(1)获得的发酵液中加入乙醇，破碎处理后，固液分离取上清液，将上清液过强碱阴离子交换树脂的色谱柱，收集流出液，得到流出液I。其中，所述的乙醇为本领域常规的乙醇，较佳地是体积百分数为85～100％的乙醇，更佳地为体积百分数为95％的乙醇。所述乙醇的添加量为本领域常规，较佳地为所述发酵液体积的1～3倍。所述的破碎为本领域常规的破碎，较佳地为超声或浸泡于有机溶液后搅拌，更佳地为超声。所述超声的时间为本领域常规的时间，较佳地为10～60min分钟，更佳地为30min。较佳地，所述的强碱阴离子交换树脂所带的基团为季铵碱基团。最佳地，为 江苏苏青水处理工程集团有限公司生产的牌号为SQD-706的强碱阴离子交换树脂。所述上清液过色谱柱的流速为本领域常规的流速，较佳地为0.5～2mL/min，更佳地为1～1.5mL/min。
步骤(3)为：将步骤(2)所得的流出液I上样至骨架为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂，使用甲醇溶液洗脱，得洗脱液II，将所述洗脱液II浓缩结晶，再以有机溶剂溶解后重结晶，即得雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮纯品，所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁脂和丙酮中的任一种。其中，所述的浓缩为本领域常规的浓缩方式，较佳地是利用旋转蒸发进行浓缩。较佳地，所述的骨架为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂还满足下列要求：孔容1.22～2.36ml/g，比表面积350～850m2/g，含水量58～68％，湿真密度1.00～1.10g/mL，湿视密度0.60～0.75g/mL。最佳地，所述的骨架为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂为上海华震科技有限公司生产的牌号为HZ-20SS的大孔吸附树脂。
本发明提供一种用于发酵分枝杆菌(Mycobacterium sp.)产生雄甾-4-烯-3,17-二酮的发酵培养基，其包括如下的组成成分：20～40g/L植物甾醇、0.5～3g/L有机酸、0.5～3g/L无机氮源、5～20g/L有机碳源、35～50g/L有机氮源、1～3g/L无机盐A、0.1～0.5g/L无机盐B、0.002～0.006g/L微量元素和2～4g/L助溶剂，所述的有机酸选自乙酸、丙酸、酒石酸和柠檬酸中的一种或多种，所述的无机氮源选自硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和硝酸钠中的一种或多种，所述的有机碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油和甘露醇中的一种或多种，所述的有机氮源选自黄豆粉、花生粉、羽毛粉和棉籽粉中的一种或多种，所述的无机盐A选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种，所述的无机盐B选自硫酸镁、硫酸钠和硫酸钾中的一种或多种，所述的微量元素选自硫酸亚铁、硫酸锌、氯化锰中的一种或多种，所述的助溶剂选自吐温20、吐温80、乙醇和卵磷脂中的一种或多种。
较佳地，所述的发酵培养基包括如下的组成成分：30～35g/L植物甾醇、1.5～2.5g/L有机酸、1～2g/L无机氮源、8～15g/L有机碳源、40～45g/L有机氮 源、1.5～2.5g/L无机盐A、0.2～0.5g/L无机盐B、0.002～0.003g/L微量元素和2.5～3.5g/L助溶剂。更佳地，所述的发酵培养基包括如下的组成成分：33g/L植物甾醇、2g/L有机酸、1.5g/L无机氮源、10g/L有机碳源、40g/L有机氮源、2g/L无机盐A、0.3g/L无机盐B、0.006g/L微量元素和3g/L助溶剂。较佳地，所述的有机酸为柠檬酸。较佳地，所述的无机氮源为硫酸铵。较佳地，所述的有机碳源为葡萄糖。较佳地，所述的有机氮源为黄豆粉。较佳地，所述的无机盐A为磷酸二氢钠。较佳地，所述的无机盐B为硫酸镁。较佳地，所述的微量元素为氯化锰和硫酸亚铁。较佳地，所述的助溶剂为吐温80。较佳地，所述的发酵培养基还包括0.5～2.5g/L氨基酸，更佳地包括1.0～2.0g/L氨基酸，所述的氨基酸较佳地为选自谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和苏氨酸中的一种或多种，更佳地为谷氨酸。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明通过改进发酵培养基的配方，同时配合强碱阴离子交换树脂对发酵产物进行提取，全面改进了ADD的发酵提取工艺，从而使得发酵产物损失少，纯度高，且提取过程使用的有机溶剂较少，更加环保。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中部分材料和试剂的来源如下：
大孔吸附树脂SQD-706：购自江苏苏青水处理工程集团有限公司。
大孔吸附树脂HZ-20SS：购自上海华震科技有限公司。
色谱柱：Welchrom-C18，5μm，4.6×250mm，购自Welchrom公司。
分支杆菌(Mycobacterium sp.)菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，购自ATCC。
实施例1
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为60％。所述的发酵培养基包括33g/L植物甾醇、2g/L柠檬酸、1.5g/L硫酸铵、10g/L葡萄糖、40g/L黄豆粉、2g/L磷酸二氢钠、0.0002g/L硫酸锌、0.2g/L硫酸镁、0.0002g/L氯化锰、0.002g/L硫酸亚铁、3g/L吐温80、1g/L谷氨酸和1g/L甘氨酸。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入1倍体积95％(v/v)的乙醇，超声处理30min后，过滤除去菌体和蛋白沉淀，取上清液。室温下，采用直径和柱高比(径高比)为1∶5的大孔吸附色谱，填充预处理过的SQD-706树脂，将所得上清液以1mL/min的流速上样，并收集流出的洗脱液，得到洗脱液I；硅胶GF254薄层(展开剂石油醚∶乙酸乙酯为6∶4，喷20％硫酸溶液后再100℃加热10min后显色，ADD呈红色，Rf在0.3，或与标准品对照)或高效液相(流动相甲醇∶水为75∶25，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长254nm)检测柱下流份，直至无ADD斑点或无对应峰出现时表明已经完全流出，得流出液I。
(3)将步骤(2)所得的流出液I浓缩后湿法上样过大孔吸附树脂HZ-20SS填充的色谱柱，以体积百分数为75％甲醇水溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，1BV后ADD开始流出，收集1BV后的洗脱液，得到洗脱液II将洗脱液II浓缩结晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再结晶，即得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为98.54％，回收率为85.41％。
实施例2
(1)同实施例1。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入1倍体积95％(v/v)的乙醇， 超声处理30min后，过滤除去菌体和蛋白沉淀，取上清液。室温下，采用直径和柱高比(径高比)为1∶5的大孔吸附色谱，填充预处理过的SQD-706树脂，将所得上清液以2mL/min的流速上样，并收集流出的洗脱液，得到洗脱液I；硅胶GF254薄层(展开剂石油醚∶乙酸乙酯为6∶4，喷20％硫酸溶液后再100℃加热10min后显色，ADD呈红色，Rf在0.3，或与标准品对照)或高效液相(流动相甲醇∶水为75∶25，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长254nm)检测柱下流份，直至无ADD斑点或无对应峰出现时表明已经完全流出，得流出液I。
(3)将步骤(2)所得的流出液I浓缩后湿法上样过大孔吸附树脂HZ-20SS填充的色谱柱，以体积百分数为75％甲醇水溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，1BV后ADD开始流出，收集1BV后的洗脱液，得到洗脱液II将洗脱液II浓缩结晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再结晶，即得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为92.15％，回收率为89.12％。
实施例3
(1)同实施例1。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入1倍体积95％(v/v)的乙醇，超声处理30min后，过滤除去菌体和蛋白沉淀，取上清液。室温下，采用直径和柱高比(径高比)为1∶5的大孔吸附色谱，填充预处理过的SQD-706树脂，将所得上清液以1.5mL/min的流速上样，并收集流出的洗脱液，得到洗脱液I；硅胶GF254薄层(展开剂石油醚∶乙酸乙酯为6∶4，喷20％硫酸溶液后再100℃加热10min后显色，ADD呈红色，Rf在0.3，或与标准品对照)或高效液相(流动相甲醇∶水为75∶25，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长254nm)检测柱下流份，直至无ADD斑点或无对应峰出现时表明已经完全流出，得流出液I。
(3)将步骤(2)所得的流出液I浓缩后湿法上样过大孔吸附树脂HZ-20SS填充的色谱柱，以体积百分数为75％甲醇水溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，1BV后ADD开始流出，收集1BV后的洗脱液，得到洗脱液II将洗 脱液II浓缩结晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再结晶，即得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为95.69％，回收率为87.57％。
实施例4
(1)同实施例1。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入1倍体积95％(v/v)的乙醇，超声处理30min后，过滤除去菌体和蛋白沉淀，取上清液。室温下，采用直径和柱高比(径高比)为1∶5的大孔吸附色谱，填充预处理过的SQD-706树脂，将所得上清液以0.5mL/min的流速上样，并收集流出的洗脱液，得到洗脱液I；硅胶GF254薄层(展开剂石油醚∶乙酸乙酯为6∶4，喷20％硫酸溶液后再100℃加热10min后显色，ADD呈红色，Rf在0.3，或与标准品对照)或高效液相(流动相甲醇∶水为75∶25，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长254nm)检测柱下流份，直至无ADD斑点或无对应峰出现时表明已经完全流出，得流出液I。
(3)将步骤(2)所得的流出液I浓缩后湿法上样过大孔吸附树脂HZ-20SS填充的色谱柱，以体积百分数为75％甲醇水溶液洗脱，洗脱速度为2BV/h，1BV后ADD开始流出，收集1BV后的洗脱液，得到洗脱液II将洗脱液II浓缩结晶，再以60℃的乙酸丁酯溶解后再结晶，即得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为98.37％，回收率为75.37％。
实施例5
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为3％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为40小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，32℃条件下发酵72小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。所述的发酵培养基包括30g/L植物甾醇、0.5g/L酒石酸、1g/L乙酸、1g/L硝酸铵、4g/L麦芽糖、4g/L果糖、30g/L黄豆粉、10g/L羽毛粉、0.75g/L磷酸二氢钾、0.75g/L磷酸氢二钾、0.3g/L硫酸镁、0.00025g/L氯化锰、0.0025g/L硫酸亚铁、2.5g/L吐温20、0.25g/L谷氨酸、0.25g/L脯氨酸、0.25g/L甘氨酸和0.25g/L苏氨 酸。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入3倍体积85％(v/v)的乙醇，超声处理60min。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为95.96％，回收率为80.02％。
实施例6
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为6％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为50小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，28℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为80％。所述的发酵培养基包括35g/L植物甾醇、2g/L柠檬酸、0.5g/L丙酸、0.5g/L硫酸铵、0.5g/L硝酸铵、0.5g/L氯化铵、0.5g/L硝酸钠、0.5g/L硫酸镁、5g/L葡萄糖、5g/L甘油糖、5g/L甘露醇、45g/L棉籽粉、1.25g/L磷酸二氢钠、1.25g/L磷酸氢二钠、0.0003g/L氯化锰、0.005g/L硫酸亚铁、3.5g/L卵磷脂、0.25g/L谷氨酸、0.25g/L脯氨酸。
(2)向步骤(1)获得的发酵液中加入2倍体积100％(v/v)的乙醇，超声处理10min。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为94.65％，回收率为72.84％。
实施例7
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。20g/L植物甾醇、0.5g/L柠檬酸、0.5g/L硫酸铵、5g/L葡萄糖、35g/L黄豆粉、0.1g/L硫酸镁、0.0002g/L氯化锰、0.003g/L硫酸亚铁、1g/L磷酸二氢钠、0.0001g/L硫酸锌和3g/L吐温80。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为97.32％，回收率为81.96％。
实施例8
(1)发酵：向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。40g/L植物甾醇、3g/L柠檬酸、3g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖、50g/L黄豆粉、0.3g/L硫酸镁、0.0001g/L氯化锰、0.006g/L硫酸亚铁、3g/L磷酸二氢钠、0.00015g/L硫酸锌和4g/L吐温80。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为96.47％，回收率为83.95％。
实施例9
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。40g/L植物甾醇、3g/L柠檬酸、3g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖、50g/L黄豆粉、0.3g/L硫酸镁、0.0005g/L氯化锰、0.005g/L硫酸亚铁、3g/L磷酸二氢钠、0.00015g/L硫酸锌和4g/L吐温80。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为94.05％，回收率为78.62％。
实施例10
(1)向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。40g/L植物甾 醇、3g/L柠檬酸、3g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖、50g/L黄豆粉、0.15g/L硫酸镁、0.15g/L硫酸钠、0.0005g/L氯化锰、0.005g/L硫酸亚铁、3g/L磷酸二氢钠、0.00015g/L硫酸锌和4g/L吐温80。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为95.21％，回收率为74.63％。
实施例11
(1)发酵：向发酵培养基中接种菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，接种量为5％，所述的百分比为占发酵培养基的体积百分比，接种时种子液的种龄为48小时菌株Mycobaterium fortuituun subsp.ATCC 35856，30℃条件下发酵96小时获得发酵液，发酵过程控制溶氧量为50％。40g/L植物甾醇、3g/L柠檬酸、3g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖、50g/L黄豆粉、0.1g/L硫酸镁、0.1g/L硫酸钠、0.1g/L硫酸钾、0.0005g/L氯化锰、0.005g/L硫酸亚铁、3g/L磷酸二氢钠、0.00015g/L硫酸锌和4g/L吐温80。
其余步骤同实施例1，得无色透明的ADD纯品结晶，纯度为90.24％，回收率为73.97％。
对比例1
本对比例的发酵提取方法基本同实施例1，不同的是在发酵液经过步骤(2)中乙醇粗提过滤得到滤液后，用A850树脂(购自漂莱特中国公司)进行吸附。结果表明，并不能达到很好的进一步纯化效果。最后产品的纯度不到85％。
对比例2
本对比例的发酵提取方法基本同实施例1，不同的是在步骤(3)中使用NM100树脂进行精提，结果表明，并不能达到很好的进一步纯化效果。最后产品的纯度不到85％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护 范围内。