本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR(逆转录PCR)检测试剂盒和方法。
背景技术：
腹地病毒(Hearstlands Virus)属于布尼亚病毒科腹地病毒组成员，最近被分到白蛉病毒属中。该病毒于2012年在两名密苏里州的公民因为发烧和头痛而住院就诊时，这种传染病才被第一次记述。人和家畜可被携带有该病毒的蜱虫叮咬而感染，出现中枢神经系统症状，不但造成人类疾病和死亡，更会造成家畜死亡，导致经济损失，引起公共卫生问题。
目前，腹地病毒检测的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、在实际工作中难以推广应用。近年来应用广泛的常规核酸扩增及实时荧光定量PCR在病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，鉴于蜱虫样本中病原载量较低等原因，建立一种快速、灵敏的检测技术，更利于蜱中载量较低的病毒检测。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测腹地病毒的引物对和核酸序列；本发明还提供一种用于检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。本发明利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，建立一种快速、敏感的检测方法，应用于腹地病毒的监测检测。
本发明采用以下技术方案：
一种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示。
一组检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如序列表中序列1和序列表中序列2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述作为阳性对照的扩增产物包含有如序列表中序列4所示的核苷酸序列。
一种检测腹地病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒主要包括该试剂盒包括：2×RT-PCR反应液、25×RT-PCR酶混合液、上游引物、下游引物、探针、阴性对照和阳性对照；具体组成如下：
2×RT-PCR反应液(2×RT-PCR buffer)；
25×RT-PCR酶混合液(25×RT-PCR Enzyme Mix)；
上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；
阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
阳性对照：包含有核苷酸序列如序列表中序列4所示的基因。
如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3中任意一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMARA和BHQ2中任意一种。
一种利用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法检测腹地病毒的非诊断性方法，该方法包括以下步骤：
(1)从样品中提取病毒RNA；
(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增，其中，反应体系按如下配制：1×RT-PCR反应液(1×RT-PCR Buffer)，1×RT-PCR酶混合液(1×RT-PCR Enzyme Mix)，上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示，所述探针5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度为0.01～1μM，样品RNA；同时设置无核酸酶灭菌超纯水为阴性对照；
实时荧光RT-PCR反应程序：
(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明的有益效果：
本发明建立了比较高效、灵敏的腹地病毒的快速检测方法，提供实时荧光RT-PCR检测试剂盒。提供的检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统病毒分离来获得检测结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。本发明的检测试剂盒最低检出限为14.9×10-10ng/μL。
附图说明
图1为腹地病毒普通PCR检测的电泳图。
图2为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增曲线。
图3为腹地病毒荧光定量PCR特异性扩增曲线。
图4为本发明荧光定量PCR试剂盒检测腹地病毒的扩增标准曲线。
图5为利用本发明试剂盒对样品的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1：普通PCR检测腹地病毒
在本发明引物和探针设计中，筛选腹地病毒S基因片段的保守序列，设计一对寡聚核苷酸序列(引物)和探针，利用引物可特异地扩增腹地病毒的S基因片段，引物扩增片段大小为113bp，核苷酸序列如序列表中序列4所示。
序列4：
GTGAGAGCAAATACAATGATGTACTTCACATCATTCCTCCAGTTCTCACCCCCCCTCTCACGAAGCAGCCCAAAGATCACAGCAGGATCCAGGCCCTCATAAGCTATCTCCT。
设计的引物和探针如下：
HRTV-F(序列表中序列1)：5′-GTGAGAGCAAATACAATGA-3′
HRTV-R(序列表中序列2)：5′-AGGAGATAGCTTATGAGG-3′
HRTV-FAM(序列表中序列3)：5′-TCACATCATTCCTCCAGTTCTCACC-3′
应用设计的引物对腹地病毒进行普通PCR扩增，采用25μL反应体系：HRTV-F、HRTV-R引物终浓度各为0.4×103nmol/L；Mg2+终浓度2mmol/L；dNTP终浓度为0.8×106μmol/L；1×RT-PCR反应液(1×RT-PCR Buffer)；Taq聚合酶用量1单位(unit)，模板2μL。
PCR扩增反应条件为：
95℃预变性3分钟，接着进行循环反应：95℃变性30秒，49℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行40个循环；最后72℃延伸10分钟；
对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为携带有如序列表序列4所示序列的质粒DNA，起始浓度为14.9×10-3ng/μL，并按10倍比进行梯度稀释。结果如图1所示，可以看到所设计的引物可有效扩增腹地病毒。
实施例2：腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的制备
腹地病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括以下成分：
2×RT-PCR反应液(2×RT-PCR Buffer)；
25×RT-PCR酶混合液(25×RT-PCR Enzyme Mix)；
上游引物：核苷酸序列如序列表中序列1所示；
下游引物：核苷酸序列如序列表中序列2所示；
探针：核苷酸序列如序列表中序列3所示；
阴性对照：无核酸酶灭菌超纯水；
阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
其中，所述2×RT-PCR反应液和25×RT-PCR酶混合液可选用ABI公司AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit；引物、探针、质粒委托上海英骏生物技术有限公司合成，探针在合成时探针5＇端连接FAM荧光基团和3＇端连接BHQ1淬灭基团。
实施例3：腹地病毒实时荧光RT-PCR检测的方法
本发明检测腹地病毒方法包括以下步骤：
(1)病毒RNA提取
病毒RNA提取可选用QIAamp Viral RNA提取试剂盒进行提取。
(2)RT-PCR扩增
采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表1。
表1反应体系
扩增条件：采用以下扩增条件。
(3)收集荧光信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有腹地病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为FAM-BHQ1，其它荧光淬灭基团组合也同样适用，比如CY3-TAMARA、CY3-BHQ2、FAM-BHQ2、CY3-BHQ1等，检测时选择相应的荧光检测模式。
上述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)等。
实施例4：本发明试剂盒灵敏度的检测
选择含有扩增序列的腹地病毒质粒作为阳性标准品，将提取的DNA从10-1依次稀释到10-11进行检测；腹地病毒质粒由上海生工合成。
1)阳性对照：腹地病毒阴性的蜱RNA；
2)阴性对照(NTC)：无核酸酶水；
3)反应体系按照实施例3中表1进行配制，每个梯度做三个平行样。
检测结果如图2所示。图2中1-5曲线从左往右分别为标准品用无核酸酶水浓度稀释度为10-3-10-11扩增的曲线。结果判定：Ct值低于35为阳性结果，超过38为阴性结果。
从图中可以得出结论，引物和探针检测阳性标准品的检测灵敏度为14.9×10-10ng/μL。
实施例5：本发明试剂盒的特异性检测
1)选择腹地病毒质粒作为阳性对照(PTC)；
2)阴性对照：无核酸酶水；
3)模板：选择发热伴血小板减少综合征病毒、汉滩病毒、汉城病毒进行非特异性测试，上述模板均由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供。
4)反应体系按照实施例3中表1进行配制。
检测结果如图3，结果表明，所建立的腹地病毒通用型实时荧光PCR方法及其试剂盒对于除腹地病毒外的其他病毒没有特异性的扩增，表明引物及探针设计特异性强。
实施例6：腹地病毒实时荧光PCR标准曲线的制作
1)选择腹地病毒阳性质粒作为标准品，将其浓度从14.9×10-3ng/μL依次稀释到14.9×10-11ng/μL，选择10-3-10-11作为模板；
2)阴性对照：灭菌超纯水；
3)反应体系按照实施例3中表1进行配制。
检测结果如图4所示，腹地病毒通用型实时荧光PCR的标准曲线为：R2＝0.9959；其中，X轴表示相应的校正后报告荧光强度的对数，Y轴循环次数。
实施例7：本发明试剂盒检测未知样本
利用本发明试剂盒，对黑山头蜱虫样本88份进行检测，具体实验步骤如下：
(1)病毒RNA提取
病毒RNA提取可选用天跟DNA、RNA共提取试剂盒进行提取。
a.匀浆处理：
在蜱虫样本中加入适量裂解液RLplus，用电动或玻璃匀浆器将样品彻底研磨，涡旋震荡30sec。
b.12,000rpm(13,400×g)离心3-5min，小心吸取上清至吸附柱CB3(吸附柱CB3放在2ml离心管中)，12,000rpm(13,400×g)离心。
总RNA提取
c.向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀。
d.得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
注意：将溶液和沉淀转移至吸附柱CR3时，如果体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
e.向吸附柱CR3中加入700μl去蛋白液RW1，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
f.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
g.重复步骤f。
h.12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
i.将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml RNase-Free离心管中，加入30-100μl RNase-FreeddH2O室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。
(2)实时荧光RT-PCR扩增
采用实施例2制备的试剂盒配置反应体系，其组分及其体积见表2。
表2反应体系
扩增条件：采用以下扩增条件。
(3)收集荧光信号，选择FAM的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；所选定的阈值线具体为17.32。
(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，即样品中含有腹地病毒核酸，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。
本发明的方法中，探针与荧光和淬灭基团相连，所述荧光-淬灭基团为FAM-BHQ1。
在35份蜱虫样本中，无阳性样本检出，检测结果如图5所示，证明本发明试剂盒检测结果准确、可靠。
通过以上具体实施例可以看到，本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测特异性强，灵敏度高，适用于快速检测腹地病毒。