一株产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物学、生物化学和发酵工程技术领域，具体涉及一株产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌及其应用。

背景技术：

假单胞菌是一类好氧（一些假单胞菌亦可利用硝酸盐与其他氮氧化合物进行无氧呼吸）、直或微弯的革兰氏阴性杆菌，并伴有极生鞭毛，不能形成芽孢。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由于逐渐对常见抗生素产生抗性，因此成为院内感染的主要病原菌。有一些假单胞菌可以增加重要食品农作物的收成。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）可用来降解有毒垃圾（如芳香族与氯化化合物）。绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）会侵蚀有用与废弃的塑料，尤其是聚氨酯，该菌亦可用做摧毁飞机上的对抗雷达探测保护涂层的战剂。恶臭假单胞菌中的酶系可用于立体定向有机合成。

7-羟基环庚三烯酚酮类化合物是属于环庚三烯酮型化合物的一类天然产物，在很多个方面表现出多元的生物活性。由于在酮基的邻位多了一个羟基，使得7-羟基环庚三烯酚酮相对于环庚三烯酚酮表现出更强的抑制活性。一些研究显示7-羟基环庚三烯酚酮及其衍生物β-苧侧柏酚（β-thujaplicinol）、3,7-二羟基环庚三烯酚酮、软毛青霉酸（puberulic acid）、软毛青霉酮酸（puberulonic acid）可作为多种疾病的潜在治疗药物。7-羟基环庚三烯酚酮对于革兰氏阳性细菌表现出较强的抑制活性，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）与藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的MIC值为90 μM。7-羟基环庚三烯酚酮对于B16黑色素瘤细胞的IC50值为2.2 μM。7-羟基环庚三烯酚酮具有抗疟疾活性，对于对具有氯喹抗性的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）K1菌株的IC50值为6.4 μM。α-羟基环庚三烯酚酮类化合物对于双原子金属酶有抑制活性，7-羟基环庚三烯酚酮对于双原子金属酶肌醇单磷酸酶（IMPase）、碱性磷酸酶（APase）、多巴胺β-氧化酶（DBM）的IC50值分别为8、60、3 μM。7-羟基环庚三烯酚酮还可以抑制细菌内氨基糖苷2”-O-腺嘌呤转移酶，可作为氨基糖苷类抗生素的增强性共药物。

7-羟基环庚三烯酚酮具有极大药用潜力，目前主要来源是化学合成。美国科学家Allen首次在寝屋川链霉菌（Streptomyces neyagawaensis）的发酵液中分离得到7-羟基环庚三烯酚酮（N. E. Allen, W. E. Alborn, JR., J. N. Hobbs, Jr. 1982. 7-Hydroxytropolone: an Inhibitor of Aminoglycoside-2"-O-Adenylyltransferase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 22: 824-831）。1981年德国科学家H. Korth等人发现了一株产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌，该假单胞菌利用葡萄糖和葡萄糖酸作为碳源，铵盐和硝酸盐作为氮源，不能利用阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、木糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、纤维二糖（H. Korth, G. Pulverer. 1981. 7-Hydroxytropolon aus Pseudomonas sp. [1]. Z. Naturforsch. 36 c: 728-729.）。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌。本发明目的还在于提供所述假单胞菌的应用以及利用该假单胞菌发酵生产7-羟基环庚三烯酚酮的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌为东湖假单胞菌（Pseudomonas donghuensis）HT，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏日期：2015年8月6日，保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学），其分类命名为Pseudomonas donghuensis HT，保藏编号为CCTCC NO：M 2015481。东湖假单胞菌HT能够合成并分泌7-羟基环庚三烯酚酮，可用于生产7-羟基环庚三烯酚酮。

利用东湖假单胞菌HT发酵生产7-羟基环庚三烯酚酮的方法，包括如下步骤：以东湖假单胞菌HT为出发菌株，在液体低铁培养基中培养得到7-羟基环庚三烯酚酮。7-羟基环庚三烯酚酮主要存在于发酵液上清中。所述的液体低铁培养基中铁离子与亚铁离子总含量不高于1 μM。

所述的液体低铁培养基的pH优选为7-7.2。

所述的培养的条件优选为：培养温度28-30 ℃，培养时间8-12 h。

本发明的东湖假单胞菌HT在可以在限铁培养基中分泌7-羟基环庚三烯酚酮。东湖假单胞菌HT能够利用阿拉伯糖与蔗糖，与H. Korth等人发现的假单胞菌有明显差异。东湖假单胞菌HT发酵液上清的产量约为80 mg/L。

本发明具有如下有益效果：利用东湖假单胞菌HT可以通过发酵生产7-羟基环庚三烯酚酮，避免了化学合成方法中易燃、易爆、有害试剂等问题，对人类健康和公共环境不会造成任何危害，对实验条件要求较低。东湖假单胞菌HT可永久保存，为今后的机理研究和更进一步的产业应用打下基础。

附图说明

图1是提纯的7-羟基环庚三烯酚酮的紫外可见光光谱图。

图2是提纯的7-羟基环庚三烯酚酮的高效液相色谱图，A：检测波长为258 nm， B：检测波长为330 nm，C：检测波长为375 nm。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1 产7-羟基环庚三烯酚酮的假单胞菌东湖假单胞菌HT

东湖假单胞菌HT于2015年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学），其分类命名为Pseudomonas donghuensis HT，保藏编号为CCTCC NO：M 2015481。东湖假单胞菌HT能够合成并分泌7-羟基环庚三烯酚酮。

对东湖假单胞菌HT的生理生化反应检测结果表明东湖假单胞菌HT能利用的碳源包括N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡糖胺、琥珀酰胺酸、溴琥珀酸、葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、阿东糖、吐温80、葵二酸、乳酸。与H. Korth等人发现的假单胞菌有明显差异。

实施例2 7-羟基环庚三烯酚酮的提纯与鉴定

（1）7-羟基环庚三烯酚酮的提取与纯化

培养东湖假单胞菌HT与提纯7-羟基环庚三烯酚酮的培养基为MKB液体培养基。每升MKB液体培养基中含有成分：15 mL甘油，3.28 g三水磷酸氢二钾，5 g酸水解酪蛋白，2.5 g七水硫酸镁，pH 7-7.2；MKB液体培养基中铁离子与亚铁离子总含量不高于1 μM。

1）将东湖假单胞菌HT接种在含有5 mL液体MKB培养基的试管中，30 ℃摇床震荡培养过夜活化。

2）将培养过夜后的菌液按1%（V/V）的接种量转接于含有50 mL液体MKB培养基的250mL三角摇瓶中，30 ℃摇床震荡培养12 h。

3）将培养12 h后的菌液用大型冷冻离心机室温10000 rpm离心30 min，收集上清。通过0.22 μm millipore微孔过滤器过滤上清去除剩余菌体与不溶物。

4）将过滤后的上清用上清体积的1/2的乙酸乙酯萃取两次，用以去除疏水性的杂质，保留下层的水相。将水相的pH用浓盐酸调至pH = 2，将pH调至2的水相再次用水相体积的1/2的乙酸乙酯萃取两次，此时7-羟基环庚三烯酚酮进入到乙酸乙酯中，保留上层有机相。将有机相中的乙酸乙酯用旋转蒸发仪在40 ℃水浴中减压蒸干，此时瓶底会出现淡黄色针状晶体。将淡黄色针状晶体溶于无水乙醇中进行色谱纯化。

5）利用Sephadex LH-20进行色谱纯化，流动相为无水乙醇。所用Sephadex LH-20柱柱高13 cm，柱径1 cm。每次上样量为200 μL。利用CAS检测液测定收集组分的螯铁活性，有螯铁活性的组分即为含有7-羟基环庚三烯酚酮的组分，将有螯铁活性的组分收集下来。

6）将收集的有螯铁活性的组分用旋转蒸发仪在40 ℃水浴中减压蒸干，即得到纯化后的7-羟基环庚三烯酚酮。

（2）7-羟基环庚三烯酚酮的鉴定

将分离纯化的7-羟基环庚三烯酚酮进行紫外可见光光谱和高效液相色谱检测，结果显示所分离纯化7-羟基环庚三烯酚酮紫外可见光光谱特性与文献中报道一致，其纯度达90%以上。7-羟基环庚三烯酚酮的检测结果如下：

1）紫外可见光光谱检测，所用的分光光度计型号为shimadzu UV 2550。检测结果如图1所示，纯化样品的紫外可见光光谱在258、330、375、365 nm有吸收峰，258 nm处的吸收峰代表不饱和键的吸收，330、375、365 nm处的吸收峰与共轭结构有关。纯化样品的紫外可见光光谱与化学合成的7-羟基环庚三烯酚酮的紫外可见光光谱和文献（Yoshinaga Oka, Shigeki Matsuo. 1956. Spectrophotometric Studies on Organometallic Complexes Used in Analytical Chemistry on the Germanium Complex with 3-hydroxytropolone. Tohoku University. Ser. A, Physics, chemistry and metallurgy. 8, 532-539.）中报道一致。根据Yoshinaga Oka的研究，1×10^-4 M的7-羟基环庚三烯酚酮在中性环境下在330 nm处的吸收值约为0.9左右，而在东湖假单胞菌HT上述培养12h的上清在330 nm处的最大吸收约为5-6，经过计算得出7-羟基环庚三烯酚酮在东湖假单胞菌HT菌株上清的产量约为80 mg/L。

2）高效液相色谱检测，所用的高效液相色谱仪器型号是Agilent 1100。所用色谱柱是Eclipse plus C18反相色谱柱 4.6×250 mm，流动相为甲醇:水=4:6（V/V），流动相速率设置为1 mL/min，每次上样量为10 μL，检测波长为258、330、375 nm。结果显示有一个明显的洗脱主峰（图2），说明纯化样品中的组成单一，7-羟基环庚三烯酚酮纯度达90%以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。