一种检测苹果轮纹病菌及其相对数量的方法与流程

本发明属于病原菌检测技术领域，涉及PCR及实时荧光定量PCR检测技术，适合检测从空气捕捉孢子样品中或寄主组织内是否含有轮纹病菌，以及轮纹病菌的相对数量。

背景技术：

轮纹病是苹果和梨树的重要病害，主要造成死枝、死树和烂果，在苹果上危害尤为严重。苹果轮纹病菌侵染枝干，造成死枝、死树，并产生大量孢子再侵染。据调查，中国各苹果产区枝干轮纹病的总体发病率达77.6%。其中，4~10年生果树发病率为56.7%；11~17年树龄的果树发病率为78.7%；18~24年树龄的果树发病率为91.5%；25年以上树龄的果树发病率为100.0%。除危害枝干外，轮纹病菌还能侵染果实，造成果实轮纹状腐烂，使果实失去商品价值。在未套袋果实上，轮纹病造成的烂果一般在10%~30%之间，个别年份或个别果园高达70%。

分子生物学检测是监测轮纹病菌孢子释放动态的最简便的方法。轮纹病菌能在雨季产生子囊孢子，子囊孢子能随气流传播，侵染周边的果园、苗圃和幼树园。雨季子囊孢子随气流远距离的传播侵染，是轮纹病菌散播的重途径，系统监测轮纹病菌子囊孢子的释放与传播动态是防治轮纹病的基础，分子生物学定量检测是定量检测从空气中捕捉轮纹病菌子囊孢子的最简便方法。

轮纹病菌的检测是轮纹病研究与防治的重要技术。轮纹病菌具有潜伏侵染的特性。轮纹病菌侵染果实和枝条后，绝大部分病菌并不能立即致病，而是潜伏在寄主的皮孔、伤口等部位，利用死组织所提供的营养长期存活，当条件适宜时，再侵入寄主的活体组织致病。及时检测潜伏在寄主组织内的轮纹病菌，可以了解轮纹病菌的侵染时期、侵染条件和侵染数量，为病害的防治提供技术支持。

检测空气中子囊孢子释放量的传统方法是孢子捕捉与显微镜检法，即用涂有凡士林的玻片捕捉空气中的子囊孢子，然后在显微镜下检查捕捉到子囊孢子的数量。该方法费工、费时，而且结果不可靠，目前只能用于研究，还不能用于病害的防治。

检测寄主组织内是否潜伏有轮纹病菌的传统方法是组织分离法。组织分离是切取待检测枝干组织，经表面消毒后转接至PDA（马铃薯+葡萄糖+琼脂）培养基中培养3~5天。若所分离组织内潜伏有活的轮纹病菌，PDA培养基中就有轮纹病菌的菌落产生。根据培养基中轮纹病菌菌落的有无，就可以推定待检测的组织中是否存在轮纹病菌。然而，传统的组织分离方法污染率高，轮纹病菌的菌落难以辨认，从而影响了轮纹病菌检测的准确率。而且传统的组织分离方法需无菌操作，对仪器设备要求较高，步骤繁琐，周期长。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一套基于普通PCR和实时荧光定量PCR技术，快速检测从空气捕捉孢子样品中和苹果、梨树组织内是否存在轮纹病菌，以及轮纹病菌相对数量的技术与方法，为轮纹病发病规律、流行条件、致病机制、药效评估、田间病菌监测和预测等，提供一套快速的检测技术。

本发明采用的技术原理：在 rDNA 基因中，5.8S rDNA 和 28S rDNA 基因间隔序列称为（ITS），ITS的长度和序列变化较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对微生物分类鉴定和检测。以轮纹病菌的ITS为模板设计用于检测苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）的特异性引物。用该特异性引物扩增待检测样品的DNA，可以确定待检样品是否存在轮纹病菌。

真菌的ITS序列可以作为目标基因，用实时荧光定量PCR技术对病原菌定量分析。实时荧光定量PCR 技术是通过在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测PCR 反应进程，通过标准曲线对目标模板进行定量分析。以特异性引物扩增的轮纹病菌目标基因作为参照，绘制病原菌量的标准曲线。然后用特异引物扩增待检样品的DNA序列中的目标基因，并与标准曲线比较，确定待检样品中轮纹病菌的相对数量。

本发明所采用的技术方案：设计扩增轮纹病菌的特异性引物，以及设计确定用特异引物、普通PCR和实时荧光定量PCR检测轮纹病菌的技术方案是本发明解决的两个技术问题。

特异引物设计：从NCBI获得了苹果轮纹病菌ITS序列并进行比对，以ITS的保守的序列为模板在软件PrimerSelect中设计引物。以苹果组织DNA，苹果轮纹病菌DNA和其他真菌DNA为模板，用设计的引物扩增目标片段，在2%的琼脂糖凝胶电泳上检测PCR扩增产物，检测特异引物的可靠性。最终获得4对扩增苹果轮纹病菌的特异性引物，即ITS1、ITS2、ITS3和ITS4，4对引物的核苷酸序列如核苷酸序列表所示（表1）。

将苹果轮纹病菌ITS序列经PCR扩增后连接到pDMC18载体，构建质粒pMDC18-ITS。以1×10²，1×10³，1×10⁵，1×10⁷，1×10⁹拷贝/μL 重组质粒pMDC18-ITS作为标准品模板，用4对苹果轮纹特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增。分别绘制达到荧光阈值时PCR循环值（Ct）与ITS模板拷贝数对数的标准曲线，建立寄主组织中苹果轮纹菌定量计算公式，最终确认3对能定量检测苹果轮纹病菌引物（ITS1，ITS2，ITS4）。

具体实施方式：

寄主组织基因组DNA的提取：选取待检测样品，如通过孢子捕捉器捕捉到的孢子、苹果果实组织、果树表皮组等，取一定数量的检测样品。将样品放入研钵中，加入液氮研磨，直至研磨成粉末。用CTAB法提取样品的总DNA，-20^oC保存备用。

用普通PCR检测轮纹病菌：用普通PCR检测轮纹病菌可采特异引物ITS1_F/ITS1_R、ITS2_F/ITS2_R、ITS3_F/ITS3_R或ITS4_F/ITS4_R（核苷酸序列表）扩增所检测样品的DNA。每对引物的PCR扩增体系为25µL包括：1×PCR缓冲液，5µM dNTP混合物，10pM的上下游引物，10ng寄主基因组DNA，1U的Taq DNA聚合酶，加灭菌水定容至25µL。PCR反应程序为：95^oC 3min预变性，以95^oC30sec，55^oC30sec，72^oC30sec扩增25个循环，然后72^oC再最终延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR谱带。阳性对照用苹果轮纹病菌DNA代替寄主的DNA。

普通PCR检测轮纹病菌应用实例：用4对特异引物分别对从健康苹果果实、轮纹病菌侵染的苹果果实、青霉菌侵染腐烂苹果果实和褐腐菌侵染的苹果果实中提取的DNA进行扩增。结果表明，4对引物只从轮纹病菌侵染的苹果果实的提取的DNA中扩增出谱带，该 谱带与作为阳性对照的苹果轮纹病菌基因组DNA扩增出的谱带相对应，从其他三个样品提取的DNA中没有扩增出任何谱带，如图1所示。

实时荧光定量PCR定量检测轮纹病菌：苹果轮纹病菌的定量检测PCR扩增采用的三对引物，分别为ITS1_F和ITS1_R，ITS2_F和ITS2_R和ITS4_F和ITS4_R（核苷酸序列表）。每对引物PCR特异扩增体系为10µL包括：SYBRPremix ExTaq II 5µL，10 pM的上下游引物，10ng寄主的基因组DNA，加无菌水定容至10µL。反应的程序为：95^oC预变性3min，以95^oC30sec，55^oC30sec扩增40个循环。根据每个样品的Ct值，通过公式计算寄主组织中苹果轮纹病菌含量。

以上所述，仅为本发明较适宜的实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

附图说明：图1为4对苹果轮纹病菌的特异性引物PCR扩增结果。M为DL2000DNAmarker，样品1为健康苹果，样品2为轮纹病菌侵染苹果，样品3为青霉菌侵染的腐烂苹果，样品4为褐腐病菌侵染的腐烂苹果，样品5以苹果轮纹病菌DNA作为模板的阳性对照；图2为定量检测苹果轮纹病菌的标准曲线。图A为用引物ITS1检测苹果轮纹病菌的标准曲线；图B为用引物ITS2检测苹果轮纹病菌的标准曲线；图C为用引物ITS4检测苹果轮纹病菌的标准曲线。

表1. 检测苹果轮纹病菌的4对特异性引物

引物名称 序列 长度 Tm 产物长度

ITS1_F CCCGCCAGAGGACCATC 17 53.1 121

ITS1_R CATTTCGCTGCGTTCTTCA 19 52.3

ITS2_F CAGCGAAATGCGATAAGTAATG 22 52.2 152

ITS2_R CAAAGGACGGTGCCCAATA 19 53.3

ITS3_F TTGCGCCCTTTGGTATTCC 19 54.9 112

ITS3_R CGCCGAGGTCTTTGAGG 17 51.2

ITS4_F CTGGCATCGATGAAGAACG 19 51.3 171

ITS4_R CAAAGGACGGTGCCCAATA 19 53.3