一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法与流程

本发明涉及微生物分离提取技术领域，尤其涉及一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法。

背景技术：

近年来，由于抗生素的滥用导致肠道菌群失调普遍增多，肠道等疾病的治愈难度增加，新抗生素的研发成本及其新的耐药菌株增加等副作用，研究人员再次把目光投向了用提取健康人的肠道菌群来重建因肠道菌群失调引起的肠道等疾病。目前，研究者们都将重心放在了肠道菌群临床治疗疾病的种类和疗效上，而对于肠道菌群的制备，却往往采用简陋的方法，例如，先采用普通的塑料盒、塑料袋采样，后用普通均质机均质粪便，然后再离心或者筛网过滤等等。采用这些简陋的方法而制备的肠道菌群液杂质和色素多、感官差；其制备过程中使用的开放性器皿容易受污染和交叉污染，其制备操作也给工作人员带来了感官及心理的强烈负面冲击而引起不适。因此，采用简陋的方法来分离提取制备肠道菌群液，无论是其操作过程，还是制作产品的品质方面，都严重地影响了医务工作者的应用和病人对该项目的接受度，阻碍和延缓了肠道菌群液在临床上的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，该方法能减少肠道菌群液制备过程中的污染问题，避免工作人员在制备过程中的不适感，也能保证产品具有更优异的品质。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，其特征在于，它依次包括有以下步骤：1）采样；2）均质过滤；3）离心分离洗涤；所述步骤3），先采用稀释液洗涤，后于转速为7000～15000rpm条件下离心，每次离心5～25分钟，洗涤离心1～5次。

进一步优选地，上述离心分离洗涤的次数为4次。

为除去分离液中可能存在的寄生虫卵，上述从健康人体粪便中分离肠道菌群的方法，还包括有过滤操作，且过滤操作在离心分离洗涤的操作前后或过程中进行。所述过滤操作选用分级过滤器进行；所述分级过滤器中过滤网的孔径从大到小在0.2mm～0.04mm范围内设置。

作为进一步明确，上述均质过滤步骤，采用均质过滤袋和拍打式均质器；所述均质过滤袋的内部有滤膜夹层。为实现更有效除去粪便中的色素、杂质和异味，该滤膜夹层上的滤膜孔孔径大小为0.1mm～0.45mm。进一步优选地，所述滤膜夹层上的滤膜孔孔径大小为0.1～0.25mm。

为进一步避免采用过程中样品的污染和损失，简化采样操作，避免环境污染，减少操作人员处理样品的不适感，上述步骤1），采用专用的双层采样袋；所述双层采样袋为内、外两层，其袋体上部设有撕口；所述内层的下部向上折叠，且底端固定在内层的一侧外壁上；所述内层的下部上设有一撕口。

作为进一步优化，上述从人体粪便中分离肠道菌群的方法，依次包括有以下步骤：

1）无菌采样

采用双层采样袋取样；所述双层采样袋为内、外两层，其袋体上部设有撕口；所述内层的下部向上折叠，且底端固定在内层的一侧外壁上；所述内层的下部上设有一撕口。

2）拍打均质过滤

将上述双层采样袋上的撕口撕开，弃去外层，将内层放入无菌均质过滤袋中，撕开内层下部上的撕口，粪便样品直接从撕口形成的通道中进入均质过滤袋；所述均质过滤袋的内部有滤膜夹层，袋口处设置有封口条；该滤膜夹层上的滤膜孔孔径大小为0.1mm～0.45mm；之后加入稀释液，稀释液为无菌水或生理盐水，或者其它灭菌液体，最后再采用拍打式均质器均质，样品粉碎均质过滤后，制得均质过滤液；

3）离心分离洗涤

将上述均质过滤液用稀释液，于3～8℃下低温离心分离洗涤1～5次，以获取中间菌液层，即可得到不同感官需求的肠道菌群液；其离心转速7000～15000rpm，每次5～20分钟；

4）过滤

该步骤4）可在离心分离洗涤的操作前后或过程中进行，采用分级过滤器进行，滤除肠道菌群液中可能存在的寄生虫卵；所述分级过滤器中过滤网的孔径从大到小在0.2mm～0.04mm范围内设置。

更具体来说，上述从人体粪便中分离肠道菌群的方法，依次包括有以下步骤：

1）无菌采样

采用上述双层采样袋取样，取样后封口，在冷藏环境下2小时内送往实验室；

2）无菌加样

将上述双层采样袋上的撕口撕开，弃去外层，将内层放入无菌均质过滤袋中，撕开内层下部上的撕口，粪便样品直接从撕口形成的通道中进入均质过滤袋，避免了样品的飞溅；所述均质过滤袋的内部有滤膜夹层，袋口处设置有封口条；该滤膜夹层上的滤膜孔孔径大小为0.1mm～0.25mm；

3）加稀释液

加入无菌稀释液，稀释液可为无菌水或灭菌的0.9%生理盐水，或者其它灭菌液体，其加液量为样品重量的2～10倍；

4）拍打均质过滤

采用拍打式均质器均质10秒～600秒，样品粉碎均质过滤后，制得均质过滤液；

5）离心分离洗涤

将上述均质过滤液用无菌稀释液，于3～8℃下低温离心分离洗涤3～4次，以获取中间菌液层，即可制得不同感官需求的肠道菌群液；其离心转速7000～15000rpm，每次5～20分钟；

6）过滤

该步骤6）在离心分离洗涤的操作前后或过程中进行，采用分级过滤器进行，滤除分离液中可能存在的寄生虫卵，所述分级过滤器中过滤网的孔径从大到小在0.2mm～0.04mm范围内设置，制得更纯化的肠道菌群液；

7）无菌分装

根据需要量，将肠道菌群液分装至包装瓶中。

为保证产品质量，上述的各个步骤都在生物安全柜里进行，所有的操作步骤都是无菌操作，所有的分装或者吸取的工具都是无菌的。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明方法采用专用的双层采样袋取样，从源头上减少了污染几率和样品损失，减少了操作中的不适感，避免了对环境的污染。

2、其在无菌均质过滤袋中一次性完成了均质和过滤过程，既有效避免了在开放的均质机中均质、在开放的筛网中过滤所造成的污染，以及使用共同容器所造成的样品间的交叉污染，又简化了操作流程，缩短了提取时间，保证了提取过程中微生物菌群的生态与活性。

3、其离心分离洗涤步骤中，同时弃去了离心管中清澈透明，且在显微镜下观察每视野极少细菌的上清液（主要为水溶性杂质）和下层固体杂质，而将呈白色且稀释10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数的中间层菌层保留，既高效地分离提取了肠道菌群，还有效除去了粪便中的色素、杂质、异味，降低了肠道菌群液的粘度和粒度，减少了肠道菌群液因为粪便的色素、杂质和臭味而引起的不适感，其分离提取效果好；其过滤步骤则有效地除去了肠道菌群液中的寄生虫卵。

4、采用本发明方法制得的肠道菌群液半透明且均匀，无异味，无杂质颗粒，不堵塞粪菌移取管道。适用于从粪便中分离肠道菌群液、粪便微生物的分离提取、粪便微生物的分析检测等标准化和批量化的制备过程。

附图说明

图1为实施例1中所述双层采样袋的结构示意图。

图2为图1中所述双层采样袋撕去外层并经展开后的结构示意图。

图3为实施例1中所述均质过滤袋的结构示意图。

图4为图3中所述均质过滤袋的俯视图。

图5为实施例2中所述双层采样袋的结构示意图。

图6为图5中所述双层采样袋除去外层并经展开后的结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例 1

一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，它具体按照以下步骤进行：

1）无菌采样

采用经灭菌的双层采样袋取样，如图1和2所示，该双层采样袋1为内、外两层2、3，且袋体上部设有一撕口4；其内层2设置为上端面面积大于下端面面积的圆台体，该内层2的下部向上折叠，且底端9固定在内层2的一侧外壁上；其内层2的下部上也设有一撕口4；该双层采样袋1的袋体上部设有封口条5和撕拉口6，且撕拉口6位于封口条5的上部；采样操作为：撕开采样袋的撕拉口6，取样后经封口条5实现封口，在冷藏环境下2小时内送往实验室；

2）无菌加样

将双层采样袋上的撕口4撕开，弃去外层3，将内层2放入无菌均质过滤袋7中，撕开内层2下部上的撕口4，粪便样品直接从撕口4形成的通道中进入均质过滤袋7，避免了样品的飞溅；如图3和4所示，该均质过滤袋7内部有一滤膜夹层8，袋口处设置有封口条5；该滤膜夹层8的两端和低端均固定于均质过滤袋7的袋体上，且滤膜夹层8上的滤膜孔孔径大小为0.40mm；

3）称量

称量均质过滤袋的总重，经扣除预先称量的均质过滤袋的自重，即为所采粪便样品的重量，得到粪便100克；

4）加稀释液

加入无菌的生理盐水300ml，将均质过滤袋封口；

5）拍打均质过滤

采用拍打式均质器拍打均质120秒，从均质过滤袋的过滤膜层吸出滤液并分装到4个灭菌离心管，每管100ml；

6）离心分离洗涤和过滤

将步骤5）所得的装有滤液的灭菌离心管，于5℃下低温条件下分别离心10分钟，转速7000rmp；经离心分离后，离心管中的上清液清澈透明，显微镜下观察每视野极少细菌，主要为水溶性杂质，弃去；中间层呈白色，为菌层，稀释10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数，保留；下层为固体杂质，弃去；离心后将中间细菌层取出放入下另一离心管，该离心管口放置一个孔径为0.15mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；再次离心这4个灭菌离心管，每管100ml，离心10分钟，转速8000rmp，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，该离心管口放置一个孔径为0.1mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；再一次离心这4个灭菌离心管，每管100ml，离心10分钟，转速8000rmp，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，该离心管口放置一个孔径0.075mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；

7）包装成品

将经步骤6）所得的4个离心管中的菌群合并入一个容量为500ml的包装瓶，即得到100g粪便的肠道菌群稀释液400ml。

实施例 2

一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，它具体按照以下步骤进行：

1）无菌采样

采用经灭菌的双层采样袋取样，如图5和6所示，该双层采样袋1为内、外两层2、3，且袋体上部设有一撕口4；其内层2设置为倒锥体，该内层2的下部向上折叠，且底端9固定在内层2的一侧外壁上；其内层2的下部上也设有一撕口4；采样操作为：采用该双层采样袋1直接取样；

2）无菌加样

将双层采样袋袋体上部的撕口4撕开，弃去外层3，将内层2放入无菌均质过滤袋7中，撕开内层2下部上的撕口4，粪便样品直接从撕口4形成的通道中进入均质过滤袋；该均质过滤袋的结构与实施例1中所述的均质过滤袋7的结构相近，其不同之处仅在于，本例中的滤膜夹层8的中部沿着袋口至袋底方向固定在均质过滤袋7的一侧袋体上，即分隔出了两个并排分布的过滤区域，且滤膜夹层8上的滤膜孔孔径大小为0.40mm；

3）称量

称量均质过滤袋的总重，经扣除预先称量的均质过滤袋的自重，即为所采粪便样品的重量，得到粪便100克；

4）加稀释液

加入无菌的生理盐水400ml，将均质过滤袋封口；

5）拍打均质过滤

采用拍打式均质器拍打均质240秒，从均质过滤袋的过滤膜层吸出滤液并分装到5个灭菌离心管，每管100ml；另取1个100ml离心管,加稀释液100,作为平衡；

6）离心分离洗涤和过滤

将步骤5）所得的装有滤液的灭菌离心管，于3℃下条件下分别离心20分钟，转速10000rmp；经离心分离后，离心管中的上清液清澈透明，显微镜下观察每视野极少细菌，主要为水溶性杂质，弃去；中间层呈白色，为菌层，稀释10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数，保留；下层为固体杂质，弃去；离心后将中间细菌层取出放入下另一离心管，该离心管口放置一个孔径为0.20mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；再次离心这5个灭菌离心管，每管100ml，离心15分钟，转速11000rmp，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，该离心管口放置一个孔径为0.08mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；再一次离心这5个灭菌离心管，每管100ml，离心10分钟，转速15000rmp，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，该离心管口放置一个孔径0.05mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；

7）包装成品

将经步骤6）所得的5个离心管中的菌群合并入一个容量为500ml的包装瓶，即得到100g粪便的肠道菌群稀释液500ml。

实施例 3

一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，它具体按照以下步骤进行：

1）无菌采样

采用灭菌塑料袋或塑料盒直接采集粪便；

2）无菌加样

将塑料袋或塑料盒的出料口用消毒液灭菌后，打开均质过滤袋，将粪便倒入均质过滤袋中；该均质过滤袋的结构与实施例1中的均质过滤袋7相近，其差别仅在于本例中其滤膜夹层8上的滤膜孔径大小则为0.20mm；

3）称量

称量均质过滤袋的总重，经扣除预先称量的均质过滤袋的自重，即为所采粪便样品的重量，得到粪便100克；

4）加稀释液

加入无菌水300ml，将均质过滤袋封口；

5）拍打均质过滤

采用拍打式均质器拍打均质240秒，从均质过滤袋的过滤膜层吸出滤液并分装到4个灭菌离心管，每管100ml；

6）离心分离洗涤和过滤

将步骤5）所得的装有滤液的灭菌离心管，于5℃下条件下分别离心15分钟，转速15000rmp；经离心分离后，离心管中的上清液清澈透明，显微镜下观察每视野极少细菌，主要为水溶性杂质，弃去；中间层呈白色，为菌层，稀释10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数，保留；下层为固体杂质，弃去；离心后吸弃上清液；加灭菌0.9%生理盐水95ml，分3次将中间菌层洗涤溶解；再次离心15分钟，转速15000rmp，分3次加灭菌0.9%生理盐水95ml将中间菌层洗涤溶解后，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，该离心管口放置一个孔径为0.10mm的滤网，加灭菌生理盐水95ml，使中间菌层洗涤溶解过滤进入离心管内；再次离心离心15分钟，转速11000rmp，离心后将中间细菌层取出放入下一个离心管，在合并前用滤网0.75mm过滤后,再倒入保存瓶。

7）分装成品

分别将每2管的上述离心管加入1个保存瓶，再向每个保存瓶中补充100ml灭菌0.9%生理盐水，即得每个保存瓶中肠道菌群液总量为300ml，含50克粪便中的肠道菌液。