本发明属于食（药）用菌菌种选育领域，具体涉及一种大别山区野生茯苓菌种的筛选和分离培养技术。
背景技术：
：茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，具有利水渗湿，健脾和胃，宁心安神等功效。茯苓为安徽道地特色菌类药材，习称“安苓”，作为国家卫生部批准的“药食同源”中药材之一，常被用作保健食品，已成为餐桌上常用的中药，在大健康产业中具有广阔的应用前景，安苓产量占全国三分之一，主产区为大别山区金寨县、岳西县等地，安苓不仅销往亳州、安国等全国各大中药材交易市场，还会远销香港、韩国、日本以及东南亚等地。现代研究表明，茯苓中的主要的活性成分为茯苓多糖以及茯苓酸，以往的茯苓栽培往往忽略了有效成分含量这一重要的质控指标，本发明采用现代仪器分析手段，对于野生茯苓的有效成分含量进行测定，从而筛选出有效成分含量较高的大别山区野生茯苓菌种并进行进一步的菌种分离及培养，从源头上保证了茯苓菌种优良的遗传特性，保证了茯苓药材的质量。技术实现要素：本发明提供了一种大别山区野生茯苓菌种的筛选和分离技术，选用野生采集的茯苓作为菌种筛选和分离培养对象，具体通过以下步骤实现：茯苓样品预处理→茯苓多糖测定→茯苓酸测定→综合评分→菌种分离培养。所述的茯苓样品预处理的方法具体为：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于40~70℃烘箱中干燥2~8h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过60~100目筛，取过筛后样品备用。所述的茯苓多糖测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30~80mL纯水，超声10~50min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min。取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入10~50mL甲醇，浸泡10~60min，超声50~150min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量。所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150~200g（去皮）、蔗糖1~30g、琼脂1~20g、尿素1~5g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入20~30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。进一步优化的：一种大别山区野生茯苓菌种的筛选和分离技术，选用野生采集的茯苓作为菌种筛选和分离培养对象，具体通过以下步骤实现：茯苓样品预处理→茯苓多糖测定→茯苓酸测定→综合评分→菌种分离培养。所述的茯苓样品预处理的方法具体为：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于50~65℃烘箱中干燥4~6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过60~80目筛，取过筛后样品备用。所述的茯苓多糖测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入40~60mL纯水，超声20~40min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入20~40mL甲醇，浸泡20~40min，超声80~100min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析。色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm。记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量。所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种。具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150~180g（去皮）、蔗糖1~20g、琼脂1~15g、尿素1~3g、水1000mL；将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入25~30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。最优的：一种大别山区野生茯苓菌种的筛选和分离技术，选用野生采集的茯苓作为菌种筛选和分离培养对象，具体通过以下步骤实现：茯苓样品预处理→茯苓多糖测定→茯苓酸测定→综合评分→菌种分离培养。所述的茯苓样品预处理的方法具体为：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用。所述的茯苓多糖测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量。所述的茯苓酸测定的具体方法为：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm。记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量。所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6。所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000m，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面。移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。本发明的优点在于：1）本发明采用先进的仪器设备检测和分析野生茯苓中有效成分的含量，定量准确，数据真实可靠；2）本发明采用组织培养的方式对于优选出的野生菌种进行培养和扩繁，保证了野生菌种的遗传特性。具体实施方式一下通过具体实施方式来进一步说明本发明，不以任何形式构成对本发明的限制。实施例1A产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表1-1；表1-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.25922.16932.39242.83054.18660.709（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表1-2。表1-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.69720.59830.78140.81850.77760.441（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表1-3。表1-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分10.92221.22631.42641.62352.14160.548（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品5在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基。并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例2B产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表2-1。表2-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.91821.52431.40342.38852.00762.089（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表2-2。表2-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.57320.67230.89240.58850.97360.790（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表2-3。表2-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.11121.01331.09741.30851.38761.310（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品5在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种。具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基。并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例3C产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表3-1。表3-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）12.71621.46831.77842.57352.34461.592（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表3-2。表3-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.65320.74330.82040.91750.63260.550（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表3-3。表3-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.47821.03331.20341.57951.31760.967（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品4在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例4D产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表4-1。表4-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.21722.28131.51742.78352.52161.810（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表4-2。表4-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.98720.99030.90640.62150.56660.895（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表4-3。表4-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.07921.50731.15041.48651.34861.261（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品2在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种。具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基。并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例5E产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表5-1。表5-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.84221.92832.14341.10852.60762.336（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液。分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表5-2。表5-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.82520.68730.74940.52750.78560.713（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表5-3。表5-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.23221.18331.30740.75951.51461.362（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品5在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基。并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例6F产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用。（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表6-1。表6-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）12.54322.36831.68941.86751.86062.408（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析。色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表6-2。表6-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.68720.60230.85840.96050.82960.793（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表6-3。表6-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.42921.30831.19041.32351.24161.439（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品6在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例7G产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表7-1。表7-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）12.43122.03632.45542.52051.18862.088（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表7-2。表7-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.82020.71530.99340.56150.83060.637（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表7-3。表7-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.46521.24331.57841.34550.97361.217（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品3在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种。具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例8H产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表8-1。表8-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.62621.96632.35041.55552.72861.373（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析。色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表8-2。表8-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.88520.95930.61940.83650.63060.570（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表8-3。表8-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.18221.36231.31241.12451.46960.891（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品5在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例9I产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表9-1。表9-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.33822.66332.91441.23151.08662.434（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析。色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表9-2。表9-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.92320.87730.63140.72850.85260.514（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表9-3。表9-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.08921.59231.54440.92950.94661.282（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品2在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL。将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基。并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。实施例10J产地不同大别山区野生茯苓菌种筛选及分离培养（1）茯苓样品预处理：将野生茯苓样品去皮后，切块，置于65℃烘箱中干燥6h，干燥后取出，用粉碎机粉碎为粗粉，过80目筛，取过筛后样品备用；（2）茯苓多糖测定：首先建立茯苓中茯苓多糖的紫外分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入50mL纯水，超声30min后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液10mL定容至50mL容量瓶，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，加纯水至1mL加入5%苯酚溶液1mL，浓硫酸4mL，沸水浴25min，冰水浴15min，取出后在490nm处测定其吸光度（A），根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓多糖的百分含量，结果见表10-1。表10-1不同野生茯苓样品中茯苓多糖的含量编号茯苓多糖含量（%）11.34222.08732.00441.49051.08662.017（3）茯苓酸测定：首先建立茯苓中茯苓酸的高效液相色谱分析方法，包括：标准曲线的绘制、精密度试验、稳定性试验、重复性试验以及加样回收率试验，样品测定方法为：精密称取过筛后的野生茯苓样品粉末1.0g于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，浸泡30min，超声90min，过滤，并用甲醇洗涤滤渣，合并滤液和洗涤液，水浴蒸干后，用甲醇复溶并定容至10mL容量瓶中，即得供试品溶液，分别精密移取各供试品溶液0.5mL，稀释至1.5mL，用0.45μm过滤后，进样分析，色谱条件为：色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈∶0.4%乙酸（80∶20）；柱温：30℃；进样量20μL；流速：1.0mL/min；检测波长：360nm，记录峰面积，根据标准曲线计算不同野生茯苓样品中茯苓酸的百分含量，结果见表10-2。表10-2不同野生茯苓样品中茯苓酸的含量编号茯苓酸含量（%）10.97820.63130.75740.71250.84860.717（4）所述的综合评分具体为：综合评分=茯苓多糖百分含量×0.4+茯苓酸百分含量×0.6，结果见表10-3。表10-3不同野生茯苓样品中有效成分含量综合评分编号综合评分11.12321.21331.25641.02350.94361.237（5）所述的菌种分离培养方法为：选取野生茯苓样品综合评分较高的样品3在PDA斜面培养基上分离菌种，作为一级母种，具体制作方法为：培养基配方：马铃薯150g（去皮）、蔗糖10g、琼脂10g、尿素1g、水1000mL，将上述配方按常规方法制成试管斜面培养基，并在无菌条件下，采用组织分离法，将茯苓菌核内一块白色茯苓肉接入培养基斜面，移入30℃的室内培养5~7天待菌丝布满斜面，即成。当前第1页1 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