本申请是申请日为2009年4月16日、发明名称为“包括α2,3-和α2,6-唾液酸化的重组FSH”的中国专利申请No.200980121391.X的分案申请。本发明涉及用于治疗不育的促性腺激素。具体地，本发明涉及促卵泡激素(FSH)。所述促性腺激素是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。它们包括促卵泡激素(FSH),黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。FSH由垂体前叶腺自然分泌，并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。FSH包含对于其它糖蛋白激素LH和CG也是常见的92个氨基酸的α-亚基，以及赋予该激素生物学特异性的FSH独有的111个氨基酸的β-亚基(Pierce和Parsons,1981)。每个亚基通过增加复杂的糖残基进行翻译后修饰。两个亚基都携带关于N-连接的聚糖附着的2个位点，α亚基在氨基酸52和78处，β-亚基在氨基酸残基7和24处(Rathnam和Saxena,1975,Saxena和Rathnam,1976)。因此，FSH糖基化到约30质量％(Dias和VanRoey.2001.Fox等2001)。从更年期后人尿中纯化的FSH已经在不育治疗中使用了许多年；其在自然生殖中促进排卵并且提供卵母细胞用于辅助生殖技术。FSH的两种重组形式，Gonal-F(Serono)和Puregon(Organon)在20世纪90年代中期是可获得的。这些都在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达(Howles,1996)。存在与FSH制剂相关的相当大的异质性，其涉及在存在的不同的同分异构体的量上的不同。单独的FSH同工型显示相同的氨基酸序列，但是在它们翻译后修饰的程度上不同；具体的同工型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同，这两者都显示影响具体的同工型生物活性。自然FSH的糖基化是高度复杂的。在自然来源的垂体FSH中的聚糖可以包含广泛范围的结构，其可以包括二触角聚糖、三触角聚糖和四触角聚糖的组合(Pierce和Parsons,1981.Ryan等.,1987。Baenziger和Green,1988)。所述聚糖可以具有其它的修饰:核心岩藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙酰基乳糖胺延伸的链、部分或完全唾液酸化(sialylation),具有α2,3和α2,6连接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺(Dalpathado等，2006)。此外，在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。在来自个体的血清以及来自绝经期后妇女尿液的FSH中已经发现相当水平的聚糖复杂性(Wide等.,2007)。重组FSH产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。现存的rFSH产品来自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在CHO来源的rFSH中的聚糖修饰范围比在来自垂体提取物或尿液的天然产物中发现的那些更有限。在CHO来源的rFSH中发现的减少的聚糖异质性的实例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺延伸(Hard等,1990)。此外，CHO细胞仅能够使用α2,3连接加入唾液酸(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。这不同于天然产生的FSH，其包含具有α2,3和α2,6-连接的唾液酸混合物的聚糖。已经证实当与垂体、血清或绝经期后尿液FSH比较时，重组FSH制剂(Organon)在具有低于4的等电点(pI)的FSH(考虑酸性同工型)的量上不同(Ulloa-Aguirre等.1995)。与重组产物Gonal-f(Serono)和Puregon(Organon)比较，在尿制备物中的酸性同工型的量高得多(Andersen等.2004)。这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸，因为用硫酸盐修饰的带负电荷的聚糖的含量在FSH中很低。与天然FSH比较，更低的唾液酸含量是两种商购FSH产品的特征，并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和Driebergen,2005)。存在大量的科学工作，其分析并尝试解释在不同个体之间的FSH糖基化变化以及在排卵周期过程中的变化。一项重要讨论涉及这样的观察，即FSH浓度和唾液酸含量在所述周期的排卵前期过程中都减少。减少的唾液酸含量导致更具碱性的FSH，其都清除地更快，并且在体外至少在靶受体处更有效(Zambrano等1996)。关于这些变化的生物相关性以及它们可以怎样涉及选择优势卵泡的问题仍旧未得到解决(由Ulloa-Aguirre综述,2003)。已经关于来自多种来源的物质记载了FSH的循环寿命。这些物质中的一些已经基于总分子电荷进行分离，如通过它们的pI表征，其中更多的酸等同于更高的负电荷。如以前所指出的，对于总分子电荷的主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。例如，rFSH(Organon)具有约8mol/mol的唾液酸含量，而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量(deLeeuw等.1996)。在大鼠中的相应血浆清除率是0.34和0.14ml/min(Ulloa-Aguirre等.2003)。在另一个实例中，其中将重组FSH样品分为高和低pI级分，高pI(更低唾液酸含量)级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D’Antonio等.1999)。已经报道在排卵周期的后期阶段循环的更具碱性的FSH是由于α2,3唾液酸-转移酶在垂体前叶中的下调，其由增加水平的雌二醇所导致(Damian-Matsumara等.1999.Ulloa-Aguirre等.2001)。尚未报道关于α2,6唾液酸-转移酶的结果。FSH和rFSH的总唾液酸含量不是直接可比较的，因为唾液酸一般通过两种方式连接。垂体/血清/尿FSH都包括α2,3和α2,6-连接的唾液酸，其中主要为前者。然而，CHO细胞来源的重组体仅包括α2,3(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。除了后者更低的唾液酸总含量以外，在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异。CHO细胞普遍用于生产药用人重组蛋白。结构分析已经鉴定唾液酸专门通过α2,3-连接来连接。(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。许多人糖蛋白包括α2,3-和α2,6-连接的混合物。因此，使用CHO系统表达的重组蛋白在它们的末端唾液酸连接类型上与它们的天然对应物不同。在生产药用的生物制剂上这是一项重要的考虑因素，因为糖部分可以有助于所述分子的药理学性质。具有这样的rFSH产品是理想的，所述rFSH产品更接近地复制或模拟由人尿生产的产品的生理化学和药物代谢动力学性质。具有这样的rFSH产品是理想的，其与已知重组产物比较，具有一种或多种提高的药物代谢动力学性质。根据本发明，提供这样的重组FSH(“rFSH”或“recFSH”)，其包括α2,3唾液酸化和α2,6唾液酸化和,任选地,α2,8唾液酸化。根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的10％以上是α2,3-唾液酸化，例如全部唾液酸化的65-85％可以是α2,3-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的50％以下可以是α2,6-唾液酸化，例如全部唾液酸化的15-35％可以是α2,6-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的5％以下可以是α2,8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0.1-4％可以是α2,8-唾液酸化。根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6mol/mol以上，例如6mol/mol-15mol/mol之间的唾液酸含量(以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示)。申请人已经发现唾液酸连接的类型，α2,3-或α2,6-，可以具有对FSH的生物清除率的巨大影响。与CHO细胞系相比，人细胞系可以表达唾液酸通过α2,3和α2,6连接的重组FSH。在实施例4中，制备这样的重组FSH细胞系，其表达包含具有低水平的α2,3-和α2,6-连接的唾液酸的聚糖的FSH(图6)。这种碱性物质，具有有限的唾液酸含量(图4)，在大鼠中从循环中非常快地清除，如所预期的(图7)。接着，通过加入编码α2,6-唾液酸-转移酶的基因对所述细胞系进行第二个改造步骤(实施例5)。得到的rFSH是高度唾液酸化的，显示可与尿FSH比较的唾液酸含量和pI分布(图5)。然而，所述物质以与具有低唾液酸含量的原始物质相当的速率从大鼠的循环中非常快地清除(图8)。这是意外的观察，因为已知在天然和生物活性FSH上的一定比例的唾液酸是α2,6-连接的。发现α2,6-唾液酸化的rFSH的清除率是通过在肝中发现的脱唾液酸糖蛋白(ASGP)受体介导(实施例9)。这通过使用过量的另一种所述受体的底物来瞬时阻断ASGP受体而得以证实。在受体被脱唾液酸胎球蛋白阻断的情况下，恢复了关于高度唾液酸化的物质的预期清除率(图9)。这维持了数小时，直到阻断被消除，并且α2,6连接的高度唾液酸化的rFSH恢复了其快速清除率。通过改造人细胞系以表达rFSH和α2,3唾液酸转移酶来制备具有α2,3和α2,6-连接的唾液酸的混合物的重组FSH(实施例4和5)。表达的产物是高度酸性的并且携带α2,3-和α2,6-连接的唾液酸的混合物；后者由内源的唾液酸转移酶活性提供(图6)。与在常规CHO细胞中表达的rFSH比较，这具有两个优势：首先，由于这两种唾液酸转移酶的组合活性，所以所述物质是更加高度唾液酸化的；其次，所述物质更接近地类似于天然FSH。与CHO细胞来源的重组产物比较，这可能在生物学上是更加适合的，所述重组产物仅产生α2,3连接的唾液酸(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)并且具有减少的唾液酸含量(Ulloa-Aguirre等.1995.,Andersen等.2004)。申请人令人惊奇地发现与其它重组产物相比，本发明的rFSH可以更接近地复制或模拟天然人尿产物的生理化学和药物代谢动力学性质。换言之，本发明的rFSH可以更接近于“天然”FSH。关于给药等，这可能具有明显的优势。此外，更“天然”或更“人化”的产品对于可能需要治疗的患者可能是更理想的，尽管在某种意义上，人工意味着尽可能的“是天然的”。与其它重组产物比较，在糖(例如聚糖)结构上更接近于天然(例如人尿)FSH的重组产物可能具有其它优势(例如药物代谢动力学优势)。因此，本发明是FSH的重组形式，其携带α2,3和α2,6唾液酸的混合物并且因此更接近地类似于天然FSH。与现存的重组产物比较，预期这种化合物关于控制的卵巢刺激，在IVF技术中的应用，以及排卵诱导的应用将导致卵巢的更天然的刺激。根据本发明，提供包含α2,3唾液酸化和α2,6唾液酸化的重组FSH(“rFSH”或“recFSH”)(和/或重组FSH制剂)。rFSH或rFSH制剂可以任选地进一步包含α2,8唾液酸化。在本文中，术语“重组FSH制剂”包括用于例如药物应用的制剂，其包含重组FSH。在本发明的实施方案中，所述rFSH可以作为单一同工型或作为同工型的混合物存在。根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6mol/mol以上的唾液酸含量[以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示](实施例8)，例如6mol/mol-15mol/mol,例如8mol/mol-14mol/mol,例如10mol/mol-14mol/mol,例如11mol/mol-14mol/mol,例如12mol/mol-14mol/mol,例如12mol/mol-13mol/mol。本发明的rFSH可以在人细胞系中生产或表达。根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的10％以上可以是α2,3-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20,30,40,50,60,70,80或90％以上可以是α2,3-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的65-85％的量，例如全部唾液酸化的70-80％，例如全部唾液酸化的71-79％的量包括α2,3-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的50％以下可以是α2,6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的40,30,20,10,5％以下可以是α2,6-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的15-35％的量，例如全部唾液酸化的20-30％，例如全部唾液酸化的21-29％的量包括α2,6-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的5％以下可以是α2,8-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的2.5％以下可以是α2,8-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制剂)可以以全部唾液酸化的0.1到4％，例如全部唾液酸化的0.5-3％，例如全部唾液酸化的0.5-2.5％的量包括α2,8-唾液酸化。所谓唾液酸化，意味着在FSH糖结构上存在着唾液酸残基的量。α2,3-唾液酸化意味着在2,3位置处的唾液酸化(如本领域中公知的)和α2,6唾液酸化意味着在2,6位置处的唾液酸化(如本领域中公知的)。因此，“％的全部唾液酸化可以是α2,3唾液酸化”指在FSH中存在的唾液酸残基的总数的％在2,3位置处被唾液酸化。术语“％的全部唾液酸化是α2,6-唾液酸化”指在FSH中存在的唾液酸残基的总数的％在2,6位置处被唾液酸化。根据本发明的rFSH(或rFSH制剂)可以具有6质量％以上(例如，6质量％-15质量％,例如，7质量％-13质量％,例如，8质量％-12质量％,例如，11质量％-15质量％,例如，12质量％-14质量％)的唾液酸含量(每个FSH分子唾液酸化的量)(基于蛋白质的质量，而不是蛋白质加上糖的质量)。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的重组FSH专门包含α2,3唾液酸化(Kagawa等,1988,Takeuchi等.1988,Svensson等.1990)。本发明的rFSH可以在人细胞系中生产或表达。其可以简化生产方法(并使其更有效)，因为操作和控制例如细胞生长培养基以维持唾液酸化与已知方法相比可能是较不关键的。所述方法也可以是更有效的，因为与已知rFSH产品的生产比较，只有少量碱性rFSH产生；产生更多的酸性rFSH并且分离/去除碱性FSH是不存在问题的。rFSH可以在Per.C6细胞系，Per.C6来源的细胞系或修饰的Per.C6细胞系中生产或表达。所述细胞系可以使用α2,3-唾液酸转移酶进行修饰。所述细胞系可以使用α2,6-唾液酸转移酶修饰。备选地，或另外地，所述rFSH可以包含由[细胞系]的内源唾液酸转移酶活性提供的α2,6-连接的唾液酸(α2,6唾液酸化)。所述rFSH可以使用α2,3-和/或α2,6-唾液酸转移酶产生。所述rFSH可以使用α2,3-唾液酸转移酶产生。rFSH可以包含由内源唾液酸转移酶活性提供的α2,6-链接的唾液酸(α2,6唾液酸化)。根据本发明，在另一方面，提供产生如本文所述的rFSH和/或rFSH制剂的方法(根据本发明的各方面)，所述方法包含在人细胞系中生产或表达rFSH的步骤，所述人细胞系例如，Per.C6细胞系，Per.C6来源的细胞系，或修饰的Per.C6细胞系，例如已经用α2,3-唾液酸转移酶修饰的细胞系。所述rFSH结构包含聚糖部分。可以发生分支作用，结果是聚糖可以具有1,2,3,4个以上的末端糖残基或“触角”，如本领域中众所周知的。本发明的rFSH可以具有聚糖，其中唾液酸化存在于单-触角和/或二触角和/或三触角和/或四触角的结构上。rFSH可以优选地包含单唾液酸化的，二唾液酸化的，三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖结构，具有如下的相对量：9-15％单唾液酸化；27–30％二唾液酸化；30–36％三唾液酸化和25–29％四唾液酸化(例如，如通过带电荷的聚糖的WAX分析所显示，如在实施例8c中所显示)。根据本发明，在另一方面，提供在人细胞系中产生的(例如表达的)rFSH。所述rFSH可以包括α2,3-和α2,6-唾液酸化。可以在Per.C6细胞系,Per.C6来源的细胞系或修饰的Per.C6细胞系中生产或表达rFSH。可以使用α2,3-唾液酸转移酶修饰所述细胞系。可以使用α2,6-唾液酸转移酶修饰细胞系。备选地或另外地，rFSH可以包含由[细胞系]的内源唾液酸转移酶活性提供的α2,6-连接的唾液酸(α2,6唾液酸化)。rFSH(或rFSH制剂)的全部唾液酸化的10％以上可以是α2,3-唾液酸化，例如全部唾液酸化的65-85％可以是α2,3-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的50％以下的全部唾液酸化可以是α2,6-唾液酸化，例如15-35％的全部唾液酸化可以是α2,6-唾液酸化。本发明的rFSH(或rFSH制剂)的5％以下的全部唾液酸化可以是α2,8-唾液酸化，例如0.5-4％的全部唾液酸化可以是α2,8-唾液酸化。所述rFSH可以具有6mol/mol以上的唾液酸含量，例如6mol/mol-15mol/mol之间的唾液酸含量(以唾液酸的摩尔数与蛋白质的摩尔数的比率表示)。根据本发明，在另一方面，提供包含含有α2,3-唾液酸化和α2,6-唾液酸化(例如，如上提及)的rFSH的药物组合物。所述药物组合物还可以包含hCG和/或LH。可以通过本领域已知的任何方式获得hCG。在本文中使用的hCG包含人来源的和重组hCG。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当来源(例如，尿和胎盘)纯化人来源的hCG。表达和纯化重组hCG的方法是本领域中众所周知的。LH可以通过本领域中已知的任何方法获得。LH,如本文所用，包含人来源的和重组LH。可以通过本领域已知的任何方法从任何适当的来源(例如，尿)纯化人来源的LH。表达和纯化重组LH的方法是本领域中已知的。所述药物组合物可以用于治疗不育，例如，用于在例如辅助生殖技术(ART)，排卵诱导或宫内人工受精(IUI)中。所述药物组合物可以例如用于这样的医学适应证，在所述适应证中使用已知FSH制剂。本发明还提供本文所述的rFSH和/或rFSH制剂(根据本发明的各方面)用于制备治疗不育的药物的应用。可以将本发明的药物组合物配制为用于任何药物施用途径的众所周知的组合物，所述药物施用途径例如口服、直肠、肠胃外、透皮(例如，贴片技术)、静脉内、肌内、皮下、intrasusternal、阴道内、腹膜内、局部(粉末、药膏或滴剂)或作为颊含或鼻喷雾剂。典型的组合物包含药用载体，如水溶液、非毒性赋形剂，包括盐和防腐剂，缓冲剂等，如特别在雷明顿药物科学(Matt出版公司,1975)第15版，在1405-1412和1461–87页中，以及在国家药典(nationalformulary)XIV第十四版(美国药物协会(AmericanPharmaceuticalAssociation),1975)中所述。适合的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油,丙二醇,聚乙二醇,等)，羧甲基纤维素及其适合的混合物，植物油(如橄榄油)，和可注射的有机酯如油酸乙酯。本发明的组合物还可以包含添加剂如，但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物的生长，并且包括，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含等张剂如糖、氯化钠等可能是需要的。在一些情形中，为了实现延长的作用，需要延缓自皮下或肌内注射的FSH(和其它活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬液来实现。FSH吸收的速率于是取决于其溶出速率，其又可以取决于晶体大小和晶体形式。备选地，肠胃外施用的FSH组合形式的延缓吸收通过将所述FSH组合溶解或悬浮在油赋形剂中实现。可注射长效制剂形式可以通过在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成FSH(和其它药剂，如果存在的话)的微胶囊基质来进行制备。取决于FSH与聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性质，可以控制FSH释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等。可注射的长效制剂也通过将FSH包埋在脂质体或微乳中进行制备，所述脂质体或微乳可与体组织相容。可注射制剂可以例如通过经过留住细菌(bacterial-retaining)的滤器进行过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来进行灭菌，所述无菌固体组合物可以溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中，之后立即使用。可以将可注射制剂在任何适合的容器中提供，所述容器例如瓶子、预先填充的注射器、注射药筒等。可注射制剂可以作为这样的产品供应，所述产品具有包含FSH的药物组合物(任选地具有hCG,LH等)。如果存在超过一种活性成分(即FSH，和例如hCG或LH)，这些可以适合于单独或在一起施用。如果单独施用，施用可以是顺序的。所述产品可以在任何适合的包装中供应。例如，产品可以包含许多含有FSH,hCG，或FSH和hCG的组合的预先填充的注射器，在泡眼包装或其它装置里包装注射器以保持无菌。产品可以任选地包含使用所述FSH和hCG制剂的说明书。根据本领域中的常规实践调整药物组合物中各种成分的pH和提取物浓度。见GOODMAN和GILMAN’sTHEPHARMACOLOGICALBASISFORTHERAPEUTICES(治疗剂的药物基础),第7版。在优选的实施方案中，本发明的组合物作为用于肠胃外施用的组合物供应。制备肠胃外制剂的一般方法是本领域中已知的并且在REMINGTON；THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY(雷明顿：药物科学和实践),上文,第780-820页中描述。肠胃外组合物可以以液体制剂或作为固体供应，所述固体与无菌可注射介质混合，之后立即施用。在尤其优选的实施方案中，肠胃外组合物以易于施用和同样剂量的剂量单位形式供应。发明详述现在参照下面的实施例和附图更详细地描述本发明：图1，2和3：pFSHα/β，pST3和pST6表达载体的质粒图谱。CMV＝巨细胞病毒启动子，BGHp(A)＝牛生长激素多腺苷酸化序列，f1ori＝f1复制起点，SV40＝猿猴病毒40启动子，Neo＝新霉素抗性标记，Hyg＝潮霉素抗性标记，SV40p(A)＝猿猴病毒40多腺苷酸化序列，FSHA＝促卵泡激素α多肽，FSHB＝促卵泡激素β多肽，ST3GAL4＝α2，3-唾液酸转移酶，ST6GAL1＝α2，6-唾液酸转移酶，CoIE1＝CoIE1复制起点，Amp＝氨苄青霉素抗性标记。图1显示pFSHα/β表达载体的质粒图谱(FSH表达载体)；图2显示α2，3-唾液酸转移酶(ST3GAL4)表达载体；图3显示α2，6-唾液酸转移酶(ST6GAL1)表达载体；图4显示由稳定表达FSH的Per.C6细胞生产的重组FSH的等电聚焦。细胞培养物上清液在pH3.0-7.0梯度上，在天然条件下分离。克隆005代表用于唾液酸转移酶改造的五个克隆。丢弃包含较少酸性同工型的克隆；图5显示在用α2，3-或α2，6-唾液酸转移酶改造后，通过由稳定表达FSH的Per.C6细胞生产的重组FSH的等电聚焦分析的克隆的实例。细胞培养物上清液在pH3.0-7.0梯度上，在天然条件下分离。克隆005是亲代Per.C6FSH细胞系。放弃显示碱性或混合图谱的克隆(*)。余下的克隆显示用唾液酸转移酶成功改造以增加在FSH上的唾液酸分子的数量；图6显示Per.C6FSH的唾液酸连接的分析。在重复的凝胶上通过SDSPAGE分离纯化的Per.C6FSH，并将其转移到硝基纤维素上，并根据制造商的说明书，使用DIG聚糖区分试剂盒(目录号11210238001，罗氏)显现。与黑接骨木凝集素(SNA)的阳性反应指示末端连接的(2-6)唾液酸(A)。与朝鲜槐凝集素(MAA)的阳性反应：指示末端连接的(2-3)唾液酸(B)。泳道I是仅包括α2，6连接的制造商对照。泳道II是包括α2，6和α2，3连接的制造商对照。样品a，商业CHO来源的重组FSH(Gonal-f，Serono)。样品b，亲代Per.C6rFSH，无唾液酸-转移酶改造。样品c，具有α2，6-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH。样品d，具有α2，3-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH。图7显示Per.C6FSH样品的代谢清除率(MCRs)。在0时间，将rFSH(1-10μg/大鼠)推注到雌性大鼠的尾静脉中(每个克隆3只动物)。通过ELISA测定随时间过去收集的血液样品的FSH含量；图8显示α2，6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。在0时间，将rFSH(1-10μg/大鼠)推注到雌性大鼠的尾静脉中(每个克隆3只动物)。通过ELISA测定随时间过去收集的血液样品的FSH含量；图9显示α2，6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。共施用7500倍摩尔过量的脱唾液酸胎球蛋白以饱和ASGP-R1-2小时的α2，6-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的代谢清除率；图10显示α2，3-唾液酸转移酶改造的Per.C6FSH样品的MCRs。基于它们的IEF图谱，关于它们的唾液酸含量选择样品；图11显示根据Steelman和Pohley(1953)的方法，通过亲代Per.C6rFSH的Per.C6rFSH克隆导致的卵巢重量增加(ovarianweightaugmentation)。根据Steelman和Pohley(1953)的方法的卵巢重量增加。在不同的剂量(3只大鼠/剂量)测试Per.C6rFSH和标准物(Gonal-frFSH)；图12显示通过改造的(α2，6-唾液酸转移酶)Per.C6rFSH导致的Per.C6rFSH克隆的卵巢重量增加。根据Steelman和Pohley(1953)的方法的卵巢重量增加。在不同的剂量(3只大鼠/剂量)测试α2，6-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH和标准物(Gonal-frFSH)；和图13显示通过改造的(α2，3-唾液酸转移酶)Per.C6rFSH导致的Per.C6rFSH克隆的卵巢重量增加。根据Steelman和Pohley(1953)的方法的卵巢重量增加。在五个不同的剂量(3只大鼠/剂量)测试亲代Per.C6rFSH，α2，3-唾液酸转移酶改造的Per.C6rFSH和标准物(Gonal-frFSH)。序列选择人FSH根据Fiddes和Goodman.(1981)使用FSHα多肽的基因编码区。序列登记为AH007338，并且在构建时，不存在该蛋白序列的其它变体。该序列在本文中称为SEQID1。根据Keene等(1989)使用FSHβ多肽的基因编码区。将所述序列登记为NM_000510，并且在构建时，不存在该蛋白序列的其它变体。该序列在本文登记为SEQID2。唾液酸转移酶α2,3-唾液酸转移酶–根据Kitagawa和Paulson(1994)使用β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(α2,3-唾液酸转移酶,ST3GAL4)的基因的编码区。将序列登记为L23767，并且在本文称为SEQID3。α2,6-唾液酸转移酶–根据Grundmann等(1990)使用β-半乳糖酰胺(galactosamide)α-2,6-唾液酸转移酶1(α2,6-唾液酸转移酶,ST6GAL1)的基因编码区。将序列登记为NM_003032并且在本文称为SEQID4。实施例实施例1FSH表达载体的构建分别使用引物组合FSHa-fw和FSHa-rev和FSHb-fw和FSHb-rec，通过PCR扩增FSHα多肽(AH007338,SEQID1)和FSHβ多肽(NM_003032,SEQID2)的编码序列。FSHa-fw5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3’FSHa-rev5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3’FSHb-fw5’-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3’FSHb-rev5’-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3’将得到的扩增FSHβDNA用限制性酶AscI和HpaI消化，并将其插入在携带新霉素选择标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体的AscI和HpaI位点中。类似地，将FSHαDNA用BamHI和NheI消化，并将其插入到在已经包含FSHβ多肽DNA的表达载体上的位点BamHI和NheI中。将载体DNA用于转化大肠杆菌(E.coli)的DH5α菌株。选择60个克隆用于扩增，并且57个包含含有FSHα和β的载体。选择这些中的20个用于测序并且所有的包含正确的根据SEQID1和SEQID2的序列。选择质粒pFSHA+B#17用于转染(图1)。实施例2ST3表达载体的构建使用引物组合2,3STfw和2,3STrev，通过PCR扩增β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3,L23767,SEQID3)的编码序列。2,3STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3’2,3STrev5’-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’将得到的扩增的ST3DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入在携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增，并且测序。克隆pST3#1(图2)包含正确的根据SEQID3的序列，并将其选择用于转染。实施例3ST6表达载体的构建使用引物组合2,6STfw和2,6STrev，将β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶1的编码序列(ST6,NM_003032,SEQID4)通过PCR进行扩增。2,6STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3’2,6STrev5’-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3’将得到的扩增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII进行消化，并将其插入携带潮霉素抗性标记的CMV驱动的哺乳动物表达载体上的BamHI和AflII位点中。将所述载体如前述扩增并且测序。克隆pST6#11(图3)包含正确的根据SEQID4的序列并将其选择用于转染。实施例4pFSHA+B在PER.C6细胞中的稳定表达。转染分离和克隆的筛选。通过在单一质粒中表达FSH的多肽链产生生产FSH的Per.C6克隆(见实施例1)。为了获得稳定的克隆，使用关于pFSHA+B构建体的基于脂质体的转染试剂。在补充了10％FCS并包含G418的VPRO中选择稳定的克隆。在转染后三周，G418抗性克隆生长。选择共250个克隆用于分离。在选择性培养基中培养分离的克隆直到70-80％汇合。使用FSH选择性ELISA测定上清液的FSH蛋白含量，并且使用cAMP积累测定法(CAMPaccumulationassay)，在克隆的细胞系中测定关于FSH受体的药理学活性。表达功能蛋白的克隆(98)进一步培养扩增到24孔、6孔和T80烧瓶。在产生足量的物质的T80烧瓶中开始关于确定来自7个克隆的物质的生产率和质量的研究。在如前述的补充培养基中培养细胞7天，并且收集上清液。使用FSH选择性ELISA测定生产率。确定所述物质的等电图谱(实施例6)。代表性样品显示在图4中。将来自IEF的信息用于关于代谢清除率分析来选择克隆(实施例9)。关于唾液酸转移酶改造，选择具有足够生产率和质量的克隆(005,104,179,223,144)。实施例5唾液酸化水平在过量表达α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶的细胞中增加。pST3或pST6在表达FSH的PER.C6细胞中稳定表达；转染分离和克隆筛选。通过从在Per.C6细胞中的各个质粒(见实施例2和3)表达α2,3唾液酸转移酶或α2,6唾液酸转移酶来产生生产高度唾液酸化FSH的Per.C6克隆，所述Per.C6细胞已经表达了FSH的两条多肽链(见实施例4)。选择在实施例4中提及的由细胞产生的四个克隆它们的性质，所述性质包括生产率，良好生长曲线，功能蛋白的产生，和包含一些唾液酸化的产生的FSH。如前在实施例4中所述产生稳定的克隆。共分离来自α2,3-唾液酸转移酶程序的202个克隆和来自α2,6-唾液酸转移酶程序的210个克隆，将其扩增并测定。关于α2,3-研究的最终克隆数是12个，关于α2,6-研究是30个。α2,3-唾液酸转移酶克隆适应于无血清培养基以及混悬液条件。使用FSH选择性ELISA，在FSH受体细胞系中的功能反应，IEF(实施例6)，代谢清除率(实施例9)和SteelmanPohley分析(实施例10)测定如前的克隆。将结果与商购重组FSH(Gonal-f,Serono)和亲代FSHPer.C6细胞系进行比较。将代表性样品显示在图5中。一些克隆没有显示唾液酸化的增加，但是可以观察到与不表达α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶的FSH比较，由大多数克隆产生的FSH具有显著提高的唾液酸化(即，平均而言更多的FSH同工型，更多数量的唾液酸)。结论即为，在Per.C6细胞中FSH与唾液酸转移酶一起的表达导致与仅表达FSH的细胞比较，增加水平的唾液酸化的FSH。实施例6通过等电聚焦分析Per.C6产生的FSH同工型的pI电泳定义为带电荷的分子通过电场经过溶剂运输带电的分子。生物分子经过电场的移动性将取决于场强、分子上的净电荷、分子的大小和形状、离子强度和分子迁移经过的介质的性质。等电聚焦(IEF)是基于它们的pI分离蛋白质的电泳技术。pI是这样的pH，在所述pH蛋白质不带净电荷并在电场中不会迁移。FSH同工型的唾液酸含量精细地改变每种同工型的pI点，可以使用这种技术研究以显现来自每种克隆的Per.C6FSH同工型。使用等电聚焦分析在细胞培养物上清液中的Per.C6产生的FSH同工型的等电点。如在实施例4和5中所述产生来自Per.C6FSH克隆的细胞培养基。在两性电解质溶液pH3.0–7.0中，在pH3.0-7.0梯度的天然条件下，在包含5％聚丙烯酰胺的IEF凝胶上分离Per.C6FSH样品。将蛋白质转移到支持的硝基纤维素上，并且使用显现条带的一级抗-FSHα单克隆抗体、二级抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合的抗体和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)试剂来显现。如在图4和5中所显示，所述条带代表包含不同数量唾液酸分子的FSH的同工型。使用这种方法，鉴定产生具有更多数量唾液酸分子的FSH同工型的克隆。用α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶进行的改造导致具有更多唾液酸和更低pI的克隆。实施例7Per.C6FSH的唾液酸连接的分析使用基于凝集素的聚糖区分方法分析复合糖。使用这种方法，可以表征与硝基纤维素结合的糖蛋白和复合糖。凝集素选择性识别特定部分，例如α2,3连接的唾液酸。使用的凝集素与类固醇半抗原洋地黄毒苷缀合，这使得能够进行结合的凝集素的免疫学检测。使用标准SDS-PAGE技术分离来自亲代克隆(没有另外的唾液酸转移酶)，α2,3-唾液酸转移酶改造的克隆和α2,6-唾液酸转移酶改造的克隆的纯化的Per.C6FSH。将商购重组FSH(Gonal-f,Serono)用作标准物。根据制造商的说明书，使用DIG聚糖区分试剂盒(目录号11210238001,罗氏)分析唾液酸。与黑接骨木(Sambucusnigra)凝集素(SNA)的阳性反应指示末端连接(2-6)唾液酸。与朝鲜槐(Maackiaamurensis)凝集素II(MAA)的阳性反应：指示末端连接(α2–3)的唾液酸。简言之，亲代克隆005包含低水平的α2,3-和α2,6-唾液酸。用α2,3-唾液酸转移酶改造的克隆包含高水平的α2,3-唾液酸连接和低水平的α2,6-唾液酸连接。用α2,6-唾液酸转移酶改造的克隆包含高水平的α2,6-唾液酸连接和低水平的α2,3-唾液酸连接。标准的对照Gonal-f仅包括α2,3-唾液酸连接。这与关于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的重组蛋白已知的情况是一致的(Kagawa等,1988,Takeuchi等,1988,Svensson等.,1990)。结论为，用α2,3-或α2,6-唾液酸转移酶改造Per.C6FSH细胞成功地增加与样品中FSH缀合的唾液酸分子的数量。实施例8a总唾液酸量化唾液酸是被认为是单糖的蛋白结合的糖并且与其它单糖如半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺和岩藻糖组合存在。根据制造商的手册(Sigma,Sialic-Q)，使用酶促唾液酸量化试剂盒测量在纯化的rFSH上的总唾液酸(实施例11)。简言之，N-乙酰基神经氨酸醛缩酶催化唾液酸为N-乙酰基mannoasine和丙酮酸。可以通过β-NADH和乳酸脱氢酶将丙酮酸还原为乳酸。可以以分光光度计精确测量Β-NADH氧化。使用基于Lowry方法(Lowry等,1951)的商业二喹啉甲酸(bicinchoninicacid)(BCA)测定试剂盒(Sigma,B9643)，在微量滴定板中测量蛋白浓度。测量Per.C6FSH的总唾液酸含量并且发现其大于6mol/mol。实施例8bα2,3,α2,6和α2,8唾液酸的相对量的量化使用已知技术测量α2,3,α2,6和α2,8唾液酸在纯化的rFSH(实施例11)上的相对百分比量。将rFSH的每个样品固定化(凝胶块)，洗涤，还原，烷基化并且用PNGaseF消化过夜。接着，将N-聚糖进行提取和处理。用如在Royle等中详述的荧光团2AB标记用于NP-HPLC和WAX-HPLC分析的N-聚糖。所述N-聚糖在TSK酰胺柱上的正常相(NP)HPLC上运行(如在Royle等中所述)，其停留时间以葡萄糖单位(GU)表示。将提取、合并的聚糖(如上提取)的样品用不同的唾液酸酶消化以确定连接。NAN1(重组唾液酸酶)释放α2,3连接的非还原末端唾液酸(NeuNAc和NeuNGc)，ABS(产脲节杆菌(Arthrobacterureafaciens)唾液酸酶)释放α2,3,α2,6和α2,8连接的非还原末端唾液酸(NeuNAc和NeuNGc)。通过NP-HPLC分析样品，从而允许将未消化的样品与用NAN1消化的样品和用ABS消化的样品进行比较。三个NP-HPLC痕量(未消化的，NAN1消化的，ABS消化的)比较显示用ABS和NAN1进行的消化提供不同的结果。其显示样品具有携带α2,3,α2,6和α2,8连接的唾液酸。从在未消化的聚糖库中存在的结构计算相对百分比，并且发现其关于α2,3唾液酸化是65％-85％的范围(例如，77.75％)；关于α2,6唾液酸化是15-35％的范围(例如，21.46％)；并且关于α2,8唾液酸化是0.1-3％的范围。实施例8c单、二、三和四触角唾液酸化的结构的相对量的量化使用已知技术，测量从纯化的rFSH(实施例11)提取的聚糖上的单、二、三和四唾液酸化的结构的相对百分比量。将rFSH的每个样品固定化(凝胶块)，洗涤，还原，烷基化并用PNGaseF消化过夜。接着，对N-聚糖进行提取和处理。用荧光团2AB标记用于NP-HPLC和WAX-HPLC分析的N-聚糖，如在Royle等中所述。如在Royle等中所述进行弱阴离子交换(WAX)HPLC以通过电荷分离N-聚糖(实施例8b)，其中将胎球蛋白N-聚糖标准物用作参照。根据它们包含的唾液酸的数量洗脱聚糖。所有的样品包括单(1S)，二(2S)，三(3S)和四(4S)唾液酸化结构。发现唾液酸化结构的相对量在下列比率(1S:2S:4S:4S)中：9-15％:27-30％:30-36％:25-29％(例如10.24:28.65:35.49:25.62)。实施例9确定rFSH的代谢清除率为了确定Per.C6FSH样品的代谢清除率(MCR)，将清醒的雌性大鼠(每个克隆3只动物)在0时间点，用rFSH(1-10μg/大鼠,基于样品的ELISA量化，DRGEIA1288)推注到尾静脉中。在测试样品注射后1,2,4,8,12,24和32小时，从尾尖提取血液样品(400μl)。通过离心收集血清，并且通过ELISA(DRGEIA1288)测定FSH含量。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)识别脱唾液酸化(半乳糖-末端)的糖蛋白，如脱唾液酸胎球蛋白(ASF)。(Pricer和Ashwell,1971.VanLenten和Ashwell,1972)。ASGP受体和结合的脱唾液酸化糖蛋白被内在化到细胞中，在所述细胞中受体被再循环并且配体被降解(Regoeczi等,1978,Steer和Ashwell,1980)。为了研究Per.C6FSH物质是否通过该机制清除，将ASGP-R用脱唾液酸胎球蛋白饱和。如关于共同施用最少7500倍摩尔过量的脱唾液酸胎球蛋白以饱和ASGP-R达1-2小时来测定亲代、α2,6或α2,3-唾液酸转移酶改造的物质的代谢清除率。由亲代Per.C6FSH克隆产生的物质包含一些更长的MCR物质，但是高比例的物质被迅速清除(图7)。使用α2,6-或α2,3-唾液酸转移酶改造包含唾液酸化程度最高物质的先导克隆005(实施例5)。尽管用α2,6-唾液酸转移酶改造的克隆显示增加的唾液酸化(图5)，但是在MCR中没有提高(图7)。ASGR的阻断恢复α2,6物质的MCR到标准物的MCR，证实即使具有增加的α2,6连接，所述物质也被迅速清除(图8)。用α2,3-唾液酸转移酶进行的改造导致这样的克隆，其具有与标准物相当的MCR(图9)，并且改变的唾液酸含量与关于FSH的同工型已知的唾液酸含量一致(图10)。实施例10Steelman-Pohley体内测定法为了证实在FSH上增加的唾液酸含量导致增加的生物学作用，检查了由高度唾液酸化的FSH、如在实施例5中产生的FSH导致的大鼠的卵巢重量的增加。根据Steelman和Pohley(1953)的方法分析由于Per.C6rFSH克隆导致的卵巢重量的增加。通过ELISA(DRG,EIA-1288)量化来自过滤的细胞培养基样品的Per.C6rFSH。在5个不同的剂量(3只动物/剂量)测试样品(Per.C6rFSH)和标准物(Gonal-frFSH)。以50,100,200,400,和800ng/大鼠给药Gonal-f。使用它们相对于Gonal-f的AUC值来计算样品剂量，典型地为0.05–10μg/大鼠。结论即为，由亲代Per.C6FSH克隆(图11)产生的唾液酸化不足(undersialylated)的物质在卵巢重量增加测定中并没有商购的rFSH那样有效。进行改造以增加另外的α2,6-连接的唾液酸转移酶增加了唾液酸含量，但是没有提高体内测定法的功效(图12)。然而，另外的α2,3-连接显著提高了功效(图13)并且两种重组FSH制剂(Per.C6和CHO-来源)在该测定法中显示了非常类似的性质。实施例11生产和纯化综述开发了一种在PER.C6细胞中生产FSH的方法，其在无血清培养基中混悬培养。在下面描述所述方法并且将其应用于一些生产FSH的PER.C6细胞系。使用由Lowry等.(1976)所述的方法的改进方法来制备来自亲代克隆005,α2,3-克隆007和α2,6克隆059的FSH(1976)。对于PER.C6-FSH的生产，使所述细胞系适应于无血清培养基，即Excell525(JRHBiosciences(JRH生物科学))。首先将所述细胞在T80培养瓶中培养到形成70％-90％汇合单层。传代后，将细胞重新悬浮在无血清培养基，Excell525+4mML-谷氨酰胺中到0.3x106细胞/ml的细胞密度。将25ml的细胞混悬液置于250ml摇瓶中，并在5％CO2下，在37℃，在100rpm摇动。在达到>1x106细胞/ml的细胞密度后，将细胞继代培养到0.2或0.3x106细胞/ml的细胞密度，并且在摇瓶中，在37℃,5％CO2和100rpm进一步培养。对于FSH的生产，将细胞转移到无血清生产培养基，即VPRO(JRHBiosciences(JRH生物科学))中，其支持PER.C6细胞的生长到非常高的细胞密度(在批次培养物中通常为>107细胞/ml)。首先，将所述细胞在Excell525中培养到>1x106细胞/ml，接着在1000rpm离心5分钟，并随后悬浮在VPRO培养基+6mML-谷氨酰胺中到1x106细胞/ml的密度。接着，将细胞在37℃,5％CO2和100rpm，在摇瓶中培养7-10天。在该阶段过程中，将所述细胞培养到>107细胞/ml的密度。在细胞生命力开始下降后收获培养基。将所述细胞在1000rpm离心5分钟，并将所述上清液用于FSH的量化和纯化。使用ELISA(DRGEIA1288)确定FSH的浓度。随后，使用由Lowry等.(1976)所述方法的改进方法进行FSH的纯化。这通过在DEAE纤维素上的层析法，在SephadexG100上的凝胶过滤，在羟基磷灰石上的吸附层析法，和制备聚丙烯酰胺电泳来实现。在所有的层析方法中，通过RIA(DRGEIA1288)和IEF(实施例6)证实免疫反应性FSH的存在。参考文献AndersenCY,WestergaardLG,和vanWelyM.(2004).FSHisoformcompositionofcommercialgonadotrophinpreparations:aneglectedaspect？(商购促性腺激素的FSH，被忽视的方面？)ReprodBiomedOnline(生殖医学在线).9(2),231-236.AreyBJ,StevisPE,DeecherDC,ShenES,FrailDE,Negro-VilarA,和LopezFJ.(1997)InductionofpromiscuousGproteincouplingofthefollicle-stimulatinghormone(FSH)receptor:anovelmechanismfortransducingpleiotropicactionsofFSHisoforms(促卵泡激素(FSH)受体的非种系选择性的G蛋白偶联：一种FSH同工型的转导多向性作用的新机制).MolEndocrinol.(分子内分泌学)11(5),517-526.BaenzigerJU和GreenED.(1988).Pituitaryglycoproteinhormoneoligosaccharides:structure,synthesisandfunctionoftheasparagine-linkedoligosaccharidesonlutropin,follitropinandthyrotropin(垂体糖蛋白激素寡糖：在促黄体激素、促滤泡素和促甲状腺素上的天冬酰胺-连接的寡糖的结构、合成和功能).BiochimBiophysActa.(生物化学生物物理学报)947(2),287-306.BassettRM,和DriebergenR.(2005).Continuedimprovementsinthequalityandconsistencyoffollitropinalfa,recombinanthumanFSH(在促卵泡激素α重组人FSH的质量和一致性上的持续改善).ReprodBiomedOnline(生殖生物医学在线).10(2),169-177.Damián-MatsumuraP,ZagaV,MaldonadoA,Sánchez-HernándezC,TimossiC,和Ulloa-AguirreA.(1999).Oestrogensregulatepituitaryalpha2,3-sialyltransferasemessengerribonucleicacidlevelsinthefemalerat(在雌性大鼠中雌激素调节垂体α2,3-唾液酸转移酶信使核糖核酸水平).JMolEndocrinol.(内分泌学杂志)23(2),153-165.D’AntonioM.,BorrelliF.,DatolaA.,BucciR.,MasciaM.,PollettaP.,PiscitelliD.,和PapoianR.(1999)Biologicalcharacterizationofrecombinanthumanfolliclestimulatinghormoneisoforms(重组人促卵泡激素同工型的生物学表征).HumanR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