本发明涉及用于生产l-赖氨酸的棒状杆菌(corynebacterium)属微生物和使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法。
背景技术：
l-赖氨酸是以草酰乙酸作为前体经由赖氨酸生物合成途径合成的，并且草酰乙酸被草酰乙酸脱羧酶(odx)降解为丙酮酸和二氧化碳。
先前，simonklaffl和bernhardj.eikmanns确认当使谷氨酸棒状杆菌中的内源基因cg1458过表达时，提高了草酰乙酸脱羧酶的活性且还降低l-赖氨酸生产，并且当使该基因失活时，草酰乙酸脱羧酶的活性会消失，从而仅仅是证明了基因cg1458编码草酰乙酸脱羧酶。但是他们并没有确认由cg1458的失活引起的l-赖氨酸生产的变化(klaffls、eikmannsbj等，j.bacteriol.(美国细菌学月刊)，2010年5月，192(10)，第2604至2612页)。然而，本发明人预测，当用于生产l-赖氨酸的棒状杆菌菌株中的内源性草酰乙酸脱羧酶的活性受到抑制时，会没有其他途径消耗草酰乙酸且用于l-赖氨酸生物合成途径的草酰乙酸的供应会增加，并且他们发现，在不同种类的生产l-赖氨酸的菌株中使草酰乙酸脱羧酶失活后，产生菌株生产l-赖氨酸的能力被提高的效果，从而完成本发明。
技术实现要素：
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供用于生产l-赖氨酸的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一个目的是提供通过使用棒状杆菌属微生物生产l-赖氨酸的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供用于生产l-赖氨酸的棒状杆菌属微生物，其中草酰乙酸脱羧酶的活性失活。
此外，本发明的另一个方面提供通过培养棒状杆菌属微生物而生产l-赖氨酸的方法。
发明效果
本发明提供通过生产l-赖氨酸的棒状杆菌菌株中的草酰乙酸脱羧酶基因的失活来具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属重组微生物。该棒状杆菌属重组微生物能够以高产率生产l-赖氨酸，从而具有工业上有用的应用。
附图说明
图1示出了用于在棒状杆菌的染色体中使odx基因缺失的pdz-δodx载体。
具体实施方式
在下文中将详细描述本发明。
本发明的一个方面提供通过草酰乙酸脱羧酶活性的失活而具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物。
草酰乙酸脱羧酶(odx)是催化草酰乙酸降解成丙酮酸和二氧化碳的酶，并且只要该酶具有上述活性，可以使用源于任何微生物的酶。具体来说，可以使用源于棒状杆菌类微生物的酶，并且更具体地可以使用源于谷氨酸棒状杆菌的酶，但不限于此。
更具体地，本发明的草酰乙酸脱羧酶可以具有序列号1的氨基酸序列，并且可以由具有序列号2的碱基序列的odx基因编码，但不限于上述氨基酸序列或碱基序列。具体来说，只要是具有草酰乙酸脱羧酶活性的蛋白质，本发明的范围还包含相对于序列号1的氨基酸序列具有80％或更高、具体地90％或更高、95％或更高并且更具体地97％或更高同源性的氨基酸序列。显然，只要具有这样的同源性的氨基酸序列具有与序列号1的蛋白质基本上相同或相应的生物活性，本发明的范围还包含具有删除、修饰、替换或加入部分序列的任何氨基酸序列的情况。基于遗传密码简并性，本发明中还可以包含编码上述氨基酸序列的上述碱基序列的任何变体。
本发明中使用的术语“同源性”指的是与给定的氨基酸序列或碱基序列的相似程度，并且同源性可以表示为百分数。在本发明中，具有与给定氨基酸序列或碱基序列相同或相似的活性的同源性序列被表示为“％同源性”。同源性序列可以通过例如算法blast[参见karlin和altschul，pro.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院学报)，90，5873(1993)]或者pearson的fasta[参见methodsenzymol.(酶学方法)，183，63(1990)]来确定。基于这种blast算法，已经开发出被称为blastn或blastx的程序[参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。同源性序列也可以通过在所限定的严格条件下的southern杂交实验中将序列进行比较而确认，并且限定合适的杂交条件属于本领域的技术范畴(参见例如sambrook等，1989，infra)，并且可以通过本领域技术人员公知的方法来确定。
本发明中使用的术语“失活”是指与在原始微生物的天然状态或未修饰状态中所具有的蛋白质活性相比，活性被进一步减弱或消除，并且失活可以通过本领域中已知的任何失活方法来进行。在本发明中，草酰乙酸脱羧酶的失活指的是生成与亲本菌株或未修饰的菌株相比内源odx基因的表达减少至较低水平或完全不表达的基因以及生成即使会表达也没有其活性或具有减少的活性的基因。
具体地，可以通过向微生物中引入包含对草酰乙酸脱羧酶进行编码的基因的一部分的重组载体以使内源草酰乙酸脱羧酶基因缺失或突变来使草酰乙酸脱羧酶的内源活性失活，或者可以通过对基因的启动子区或5’-utr区的碱基序列进行修饰来减弱蛋白质的表达，或者可以通过向相应基因的orf(开放阅读框)区中引入突变来减弱蛋白质的活性。此外，可以通过本领域中的任何已知方法将上述基因插入到染色体中。
本发明中使用的术语“内源活性”指的是在天然状态或未修饰状态中的原始微生物的蛋白质活性状态。
更具体地，失活可以通过位点特异性基因缺失(sitespecificgenedisruption)来实现，但不限于此。
本发明中使用的术语“重组载体”指的是包含对目标蛋白进行编码的多核苷酸的碱基序列的dna构建体(construct)，其以能够起作用的方式连接到合适的调控序列上，以使目标蛋白质可以在合适的宿主中表达。调控序列可以包含能够引发转录的启动子、用于调控该转录的任何操纵子序列、对合适的mrna核糖体结合位点进行编码的序列以及调控转录和翻译的终止的序列。在被转化到合适的宿主中之后，载体可以被复制或者起作用(与宿主基因组无关)，或者可以被整合到基因组本身中。本发明中所使用的载体只要能够在宿主中被复制，则没有特别的限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。
本发明中使用的术语“转化”是指基因被引入到宿主细胞中，从而在宿主细胞中能够表达该基因。转化的基因只要能够在宿主细胞中表达，就可以位于宿主细胞染色体的内部或外部。只要该基因能够被引入到宿主细胞中并且在其中表达，可以以任何形式引入该基因。
只要能够生产l-赖氨酸，可以不受限制地使用任何微生物作为向其中引入重组载体的亲本菌株。具体地，可以使用棒状杆菌属微生物或短杆菌属微生物，并且更具体地，可以使用谷氨酸棒状杆菌，但不限于此。
在本发明的一个具体实施方式中，可以通过向在谷氨酸棒状杆菌中不能复制的pdz载体(韩国授权专利第0924065号)中插入odx基因的一部分来构建重组载体后，采用本领域公知的任何方法而将重组载体转化到微生物中并进行染色体内同源重组，以制备具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其中草酰乙酸脱羧酶失活，但本发明并不限于此。
与亲本菌株相比，本发明的实施方式中制备的所有谷氨酸棒状杆菌菌株展现出提高的l-赖氨酸生产量，由此确认能够通过使odx基因失活而以高产率生产l-赖氨酸。
本发明的另一个方面提供通过培养棒状杆菌属微生物来生产l-赖氨酸的方法。更详细地，提供一种生产l-赖氨酸的方法，包括：通过培养本发明的微生物而在微生物的培养物或细胞中生产l-赖氨酸；以及从微生物的培养物回收l-赖氨酸。
在本发明的方法中，棒状杆菌属微生物的培养可以通过使用本领域中已知的任意培养条件或方法来进行，但不限于如下的例子。
例如，可采用美国细菌学学会(americansocietyforbacteriology)在通用细菌学方法手册(manualofmethodsforgeneralbacteriology)(washingtond.c.，usa，1981)中公开的培养基作为可用于培养棒状杆菌属微生物的培养基。
要在培养基中使用的碳源可以包括糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂质，例如大豆油、向日葵籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些材料可以单独使用或作为混合物而使用。
要使用的氮源可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可以单独使用或作为混合物而使用。
要使用的磷源可以包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或相应的含钠盐，并且培养基可以包括生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。除了这些材料之外，还可以使用必需的生长材料，例如氨基酸和维生素。此外，可以向培养基中加入适当的前体。这些材料可以在培养期间通过适当的方法以间歇或连续方式被添加到培养物中。
在微生物培养期间，可以用碱性化合物或酸性化合物调节培养物的ph，碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨，酸性化合物例如磷酸或硫酸。可使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制泡沫的生成。为了维持有氧条件，可以向培养物中引入氧气或含氧的气体(例如空气)。培养温度通常可以在20℃和45℃之间，并且具体地在25℃和40℃之间。可以继续培养，直到生产期望量的l-赖氨酸。具体地，培养时间可以为10小时至160小时。
在本发明的方法中，培养可以以连续或间歇模式进行，例如间歇工艺、分批补料工艺和重复的分批补料工艺。培养方法是本领域中公知的，并且可以使用任何方法。
下文中将参考实例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实例仅仅用于说明目的，并且本发明的范围不旨在受这些实例的限制。
[实施例]
实施例1：用于使源于棒状杆菌的odx基因失活的重组载体的构建
为了通过特异性基因缺失来使得对具有序列号1所表示的氨基酸序列的谷氨酸棒状杆菌的草酰乙酸脱羧酶进行编码的odx基因(序列号2)失活，通过如下方法构建质粒载体。首先，基于美国国立卫生研究院的基因银行(nihgenbank)，获得odx基因的碱基序列，并且以该序列为基础，合成用于制备失活的odx基因片段的引物。
以野生型谷氨酸棒状杆菌atcc13032的染色体作为模板，将序列号3和序列号4、序列号5和序列号6用作引物，进行pcr(聚合酶链反应)[sambrook等，molecularcloning(分子克隆)，alaboratorymanual(实验指南)(1989)，冷泉港实验室(coldspringharborlaboratories)]。在95℃下进行变性5分钟后，重复30个循环的在95℃下的长达30秒的变性、在55℃下的长达30秒的退火和在72℃下的长达30秒的聚合，然后在72℃下进行聚合7分钟。结果，获得分别包含odx基因的5’-端和3’-端的534个碱基对(bp)的序列号7和536个碱基对的序列号8。
序列号3：5’-tctagaacgatgaaatcgccgcgggt-3’
序列号4：
5’-gggttgcccagcttgccgatcacgggcggtgaggttagct-3’
序列号5：
5’-agctaacctcaccgcccgtgatcggcaagctgggcaaccc-3’
序列号6：5’-tctagaggttgctgcggattctgatt-3’
以扩增的序列号7和序列号8作为模板，利用序列号3和序列号6，进行pcr。在95℃下进行变性5分钟后，重复30个循环的在95℃下的长达30秒的变性、在55℃下的长达30秒的退火和在72℃下的长达60秒的聚合，然后在72℃下进行聚合7分钟。结果，扩增了1030个碱基对的序列号9(下文中被称为δodx)，其中odx基因的5’-端和3’-端彼此相连。
用限制酶xbai分别处理pdz载体(韩国授权专利第0924065号)和被扩增的dna片段δodx，其中，pdz载体在谷氨酸棒状杆菌中不能被复制，然后使用dna连接酶将二者彼此连接后，进行克隆，以获得质粒。该质粒被命名为pdz-δodx(图1)。
实施例2：在生产l-赖氨酸的棒状杆菌中使odx失活并分析l-赖氨酸生产能力
通过电脉冲法(appl.microbiol.biotechnol.(应用微生物学和生物技术)(1999)52:541-545)，将实施例1中所制备的pdz-δodx分别转化到作为生产l-赖氨酸的菌株的谷氨酸棒状杆菌kccm11016p和kccm11347p中，并且在包含25mg/l卡那霉素的选择培养基上获得经转化的菌株。通过二次重组(交叉)向基因组中插入dna片段δodx来获得经odx基因失活的菌株，并且这些菌株被分别命名为kccm11016p/δodx和kccm11347p/δodx。
为了确认odx基因的失活是否会实际起到提高赖氨酸生产能力的效果，分别通过如下方法培养经odx失活的菌株kccm11016p/δodx和kccm11347p/δodx，并确认它们的生产能力。
将每个菌株接种在包含25ml如下种子培养基的250ml角挡板瓶(corner-baffleflask)中，然后在37℃下以200rpm振荡培养20小时。将1ml的种子培养基接种在包含24ml如下生产培养基的250ml角挡板瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养72小时。
*种子培养基的组成(ph7.0)：
20g葡萄糖、10g蛋白胨、10g酵母提取物、5g尿素、4gkh2po4、8gk2hpo4、0.5gmgso4·7h2o、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素(以1升工艺用水为基准)。
*生产培养基的组成(ph7.0)：
80g葡萄糖、20g糖蜜或经预处理的糖蜜(作为还原糖)、5g玉米浆、40g(nh4)2so4、4g尿素、1gkh2po4、2.5gnacl、1gmgso4·7h2o、10mgfeso4·7h2o、10mgmnso4·7h2o、100μg生物素、200μg盐酸硫胺素、40gcaco3、0.4gl-亮氨酸(需要时)、0.1gl-苏氨酸(需要时)、0.1gl-甲硫氨酸(需要时)(以1升工艺用水为基准)。
培养完成后，通过hplc(高效液相色谱)测量l-赖氨酸生产量。结果，在每个菌株的培养物中的l-赖氨酸含量如下表1中所示。
[表1]
如表1中所示，可确认，与亲本菌株kccm11016p和kccm11347p相比，各自经odx-失活的菌株kccm11016p/δodx和kccm11347p/δodx的l-赖氨酸生产能力提高约4.2％。
其中，菌株kccm11016p/δodx被命名为ca01-2276，并于2013年11月22日保藏于作为国际保藏机构的韩国微生物保藏中心(koreanculturecenterofmicroorganisms)，从而被赋予保藏号kccm11478p，其中该保藏中心附属于位于韩国首尔西大门区(seodaemun-gu)弘济1洞(hongje-1-dong)361-221的韩国培养物保藏联盟(koreanfederationofculturecollections)。
实施例3：在l-赖氨酸生物合成途径被增强的生产l-赖氨酸的棒状杆菌中使odx失活并确认赖氨酸生产能力
采用与实施例2相同的方法将实施例1中所制备的pdz-δodx转化到作为l-赖氨酸生物合成途径被增强的生产l-赖氨酸的菌株的谷氨酸棒状杆菌kccm10770p(韩国授权专利第10-0924065号)中，以制备经转化的菌株，其被命名为kccm10770p/δodx。
为了确认odx基因的失活是否会实际起到提高赖氨酸生产能力的效果，采用与实施例2相同的方法培养经odx失活的菌株kccm10770p/δodx，并确认其生产能力。在每个菌株的培养物中的l-赖氨酸含量如下表2中所示。
[表2]
如表2中所示，可确认，与亲本菌株kccm10770p相比，经odx失活的菌株kccm10770p/δodx的l-赖氨酸生产能力提高约6.4％。
实施例4：在源于野生型的生产l-赖氨酸的棒状杆菌中使odx失活并确认赖氨酸生产能力
采用与实施例2相同的方法将实施例1中所制备的pdz-δodx转化到作为源于野生型的生产l-赖氨酸的菌株的谷氨酸棒状杆菌cj3p(binder等，genomebiology(基因组生物学)2012，13:r40，pyc(p458s)，hom(v59a)，lysc(t311i))中，以制备经转化的菌株，其被命名为cj3p/δodx。
为了确认odx基因的失活是否会实际起到提高赖氨酸生产能力的效果，采用与实施例2相同的方法培养经odx失活的菌株cj3p/δodx，并确认其生产能力。在每个菌株的培养物中的l-赖氨酸含量如下表3中所示。
[表3]
如表3中所示，可确认，当在亲本菌株cj3p(作为源于野生型的生产l-赖氨酸的菌株)中使odx失活时，赖氨酸生产能力同样提高约3.8％。
因此，本申请人通过实施例2-4而确认了，当在不同种类的棒状杆菌属微生物中使odx基因失活时，其赖氨酸生产能力均提高，由此确认了odx基因的失活在l-赖氨酸生产中是一个有效的特性(trait)。
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
保藏号：kccm11478p
保藏日期：2013年11月22日
序列表
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