用于生产3‑羟基丙酸的重组宿主细胞的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月19日提交的美国临时专利申请序列号62/094,328的优先权，将其内容通过引用完全结合在此。

序列表的引用

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背景技术：

3-羟基丙酸(3-hp)是一种由美国能源部鉴定为可以通过发酵制造的排名前12的高潜力结构单元化学品之一的三碳羧酸。作为乳酸(2-羟基丙酸)的异构体的3-hp的替代名称包括乙烯乳酸和3-羟基丙酸化物。3-hp是一种有吸引力的可再生平台化学品，来自葡萄糖的理论产量为100％，具有允许它参与不同种化学反应的多种官能团，以及低的毒性。可以将3-hp用作底物来形成若干日用化学品，例如1,3-丙二醇、丙二酸、丙烯酰胺、以及丙烯酸。丙烯酸是一种用来生产丙烯酸酯和超强吸收能力聚合物的大量化学品(>70亿磅/年)，并且目前来源于丙烯的催化氧化。3-hp的发酵性生产将为作为这些商业上有意义的化学品的原料的石油化学产品提供可持续的替代物，从而减少能量消耗、对外国石油供应的依赖以及温室气体的产生。

3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)是一种将丙二酸半醛转化为3-hp的酶(图1)。某些3-hpdh酶利用辅因子nadp(h)(ec1.1.1.298)。然而，使用一些工程化代谢途径来表达酶(这些酶利用辅因子nad(h)而非nadp(h)(例如，用来改善氧化还原平衡))可能是有利的。

概述

在此描述了具有主动3-hp途径的重组宿主细胞，其中这些重组细胞包含编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸，并且其中这些细胞能够产生3-hp。在一些实施例中，3-hpdh使用nad(h)辅因子。在一些实施例中，与nadp(h)相比，3-hpdh对辅因子nad(h)具有增加的特异性。

在一些实施例中，这些重组细胞包含通过丙二酸半醛中间体进行的主动3-hp途径。

在一些实施例中，该异源多核苷酸：(a)编码与seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201或seqidno:203具有至少60％序列一致性的3-hpdh；(b)包含在至少低严格条件下与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202的全长互补链杂交的编码序列；或(c)包含与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202具有至少60％序列一致性的编码序列。如本领域技术人员可认识到的，在一些情况下，可以按以上所指出的对应选项(a)、(b)和(c)中的多于一个，使这些异源多核苷酸具有资格。

在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与不具有编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸的细胞相比，这些重组细胞产生更大量的3-hp。

在一些方面中，这些重组细胞包括一种或多种(例如，两种、若干种)选自以下各项的异源多核苷酸：编码ppc的异源多核苷酸、编码pyc的异源多核苷酸、编码aat的异源多核苷酸、编码adc的异源多核苷酸、编码baat或gabt的异源多核苷酸以及编码3-hpdh的异源多核苷酸。在一些实施例中，这些重组细胞包括编码天冬氨酸1-脱羧酶(adc)的异源多核苷酸。

在一些实施例中，这些重组细胞包括对编码pdc、adh、gal6、cyb2a、cyb2b、gpd、gpp、ald或pck的一种或多种内源基因的破坏。在一些实施例中，这些重组细胞包括对编码pdc的内源基因和编码gpd的内源基因中的一个或两个的破坏。

在一些实施例中，这些重组细胞是细菌细胞或真菌细胞。在一些实施例中，这些重组细胞是酵母细胞诸如伊萨酵母属、假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、接合酵母属或酵母属酵母细胞。在一些实施例中，这些重组细胞是3-hp耐受酵母细胞。在一些实施例中，这些重组细胞不能发酵戊糖。

还描述了生产3-hp以及相关化合物的方法。在一个方面中，是一种生产3-hp的方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞，以生产3-hp；并且(b)回收3-hp。在另一个方面中，是一种生产丙烯酸或其盐的方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞，以生产3-hp；(b)回收3-hp；(c)在适合的条件下，将3-hp脱水，以生产丙烯酸或其盐；并且(d)回收丙烯酸或其盐。

附图简述

图1示出了从葡萄糖的选择性3-hp途径的概述。

图2示出了pmcts325的质粒图。

图3示出了pmcts326的质粒图。

图4示出了pmcts319的质粒图。

图5示出了pmcts318的质粒图。

定义

缩写：3-hpa，3-羟基丙醛；3-hpdh，3-羟基丙酸脱氢酶；aam，丙氨酸2,3-氨基变位酶；aat，天冬氨酸转氨酶；acc，乙酰辅酶a羧化酶；adc，天冬氨酸1-脱羧酶；akg，α-酮戊二酸ald，醛脱氢酶；baat，β-丙氨酸转氨酶；bcka，支链α-酮酸脱羧酶；bp，碱基对；cyb2，l-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶；cyc，异-2-细胞色素c；ems，乙烷甲基磺化酶；eno，烯醇酶；gabt，4-氨基丁酸转氨酶；gapdh，甘油醛-3-磷酸脱氢酶3；gpd，甘油3-磷酸脱氢酶；gpp，甘油3-磷酸磷酸酶；hibadh，3-羟基异丁酸脱氢酶；ipda，吲哚丙酮酸脱羧酶；kgd，α-酮戊二酸脱羧酶；ldh，乳酸脱氢酶；mae，苹果酸酶；mdhb，苹果酸脱氢酶b；oaa，草酰乙酸pck，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；pdc，丙酮酸脱羧酶；pdh，丙酮酸脱氢酶；pep，磷酸烯醇丙酮酸；pgk，磷酸甘油酸激酶；ppc，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；pyc，丙酮酸羧化酶；rki，核糖5-磷酸酮醇异构酶；tal，转醛醇酶；tef1，翻译延长因子-1；tef2，翻译延长因子-2；tkl，转酮醇酶，xdh，木糖醇脱氢酶；xr，木糖还原酶；yp，酵母提取物/蛋白胨。

主动3-hp途径：如在此使用，具有“主动3-hp途径”的宿主细胞以一种量产生催化代谢途径的每个反应所必需的活性酶，该量足以从可发酵糖产生3-hp，并且因此当在至少一种可发酵糖的存在下在发酵条件下培养时，该宿主细胞能够以可测量的产量产生3-hp。具有主动3-hp途径的宿主细胞包括一个或多个3-hp途径基因。如在此使用，“3-hp途径基因”是指一种编码在主动3-hp途径中涉及的酶的基因。

催化主动3-hp途径中的每个反应所必需的活性酶可以来自内源基因表达的活性、异源基因表达的活性、或来自内源基因和异源基因表达的活性的组合，如在此更加详细地描述。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以atg起始密码子或替代性起始密码子(例如gtg和ttg)开始，并且以终止密码子(例如taa、tag、和tga)结束。编码序列可以是基因组dna、cdna、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。

控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

破坏：术语“破坏”意指参照基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰(例如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸)，从而使得编码的多肽的表达不存在(失活)或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如使用来自在此参照的无细胞提取物测量值检测酶活性的不存在或降低；或通过对应的mrna的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；具有酶活性的对应多肽的量的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)；或具有酶活性的对应多肽的比活性的不存在或降低(例如，至少25％降低、至少50％降低、至少60％降低、至少70％降低、至少80％降低或至少90％降低)。可以通过本领域已知的方法破坏感兴趣的具体基因，例如通过定向同源重组(directedhomologousrecombination)(参见酵母遗传学方法(methodsinyeastgenetics)(1997版)，亚当斯(adams)，戈特斯科林(gottschling)，凯泽(kaiser)及施特姆斯(stems)，冷泉港出版社(coldspringharborpress)(1998))。

内源基因：术语“内源基因”意指对参照宿主细胞而言天然的基因。“内源基因表达”意指内源基因的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。可以对表达进行测量-例如，来检测增加的表达-通过本领域已知的技术，例如测量mrna和/或翻译的多肽的水平。

表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环形的dna分子，该分子包括编码一种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列，其中这些控制序列提供编码该多肽的多核苷酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，以及转录和翻译终止信号序列。

可发酵的培养基：术语“可发酵的培养基”或“发酵培养基”是指包括一种或多种(例如，两种、若干种)糖的培养基，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性低聚糖，其中该培养基能够部分地被宿主细胞转化(发酵)为希望的产物，例如3-hp。在一些情况下，这种发酵培养基来源于天然来源，例如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以来自这种来源的酶水解(糖化作用)的预处理。

异源多核苷酸：在此将术语“异源多核苷酸”定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出结构修饰的天然多核苷酸；由于通过重组dna技术(例如，一种不同的(外源的)启动子)对dna的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸；或具有该多核苷酸的一个或多个额外的拷贝以定量改变表达的宿主细胞中的天然多核苷酸。“异源基因”是包括异源多核苷酸的基因。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2xssc、0.2％sds，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在此将术语“重组细胞”定义为包括一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸的非天然存在的宿主细胞。

3-hp：术语“3-hp”包括“3-羟基丙酸”的盐和酸形式，除非上下文中另有说明。

3-羟基丙酸脱氢酶：术语“3-羟基丙酸脱氢酶”(3-hpdh)意指一种在nad(h)或nadp(h)辅因子的存在下，催化丙二酸半醛互变至3-羟基丙酸化物(3-hp)的酶。具有3-hp脱氢酶活性的酶类被分类为ec1.1.1.59(如果它们利用nad(h)辅因子)，和ec1.1.1.298(如果它们利用nadp(h)辅因子)。被分类为ec1.1.1.298的酶类可替代地被称为丙二酸半醛还原酶。本领域普通技术人员将意识到3-羟基丙酸脱氢酶可能对多于一种底物具有特异性。例如，在一些例子中，3-羟基丙酸脱氢酶可以催化丝氨酸互变至2-氨基丙二酸半醛(即一种“丝氨酸脱氢酶”)和3-hp互变至丙二酸半醛(即，一种3-hpdh)两者。

可以根据在实例中描述的丙二酸半醛还原酶测定来确定3-羟基丙酸脱氢酶活性。在一个方面中，本发明的3-hpdh具有seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201或seqidno:203的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的3-羟基丙酸脱氢酶活性。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2xssc、0.2％sds，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2xssc、0.2％sds，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2xssc、0.2％sds，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指一种包括一个或多个(例如，两个、若干个)控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单-链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、可以被修饰成以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可以是合成的。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于在此所述的目的，两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度使用尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德曼和翁施，《分子生物学杂志》(j.mol.biol.)，1970，48,443-453)测定，如在emboss包的尼德尔(needle)程序(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，莱斯(rice)等人，《遗传学趋势》(trendsgenet.)，2000，16,276-277)，优选地3.0.0版或更高版本中所实施。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基x100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)

出于在此所述的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度，该算法是如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(rice)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(参照序列的长度-比对中的空位总数)

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2xssc、0.2％sds，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2xssc、0.2％sds，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

体积生产力：术语“体积生产力”是指每单位时间使用的每体积系统(例如，培养基和其中的内容物的总体积)产生的参照产物的量(例如，产生的3-hp的量)。

在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约x”的描述包括方面“x”。当与测量值组合使用时，“约”包括涵盖至少与测量该具体数值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范围。

如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的这些方面包括“由……方面组成”和/或“基本由……方面组成”。

除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术语具有如本领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。

详细说明

在此尤其描述了具有主动3-hp途径的重组细胞，这些重组细胞包含编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸。本申请人出乎意料地发现，来自近平滑假丝酵母的seqidno:197的多肽、来自汉逊德巴利酵母(debaryomyceshansenii)的seqidno:199的多肽、来自季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)的seqidno:201的多肽和来自葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)的seqidno:203的多肽具有nad(h)依赖性3-hpdh活性。本申请人进一步发现，这些多肽在具有通过丙二酸半醛进行的主动3-hp途径的重组宿主细胞中的表达产生高水平的经发酵的3-hp。

本申请人发现表达用于3-hp生产的seqidno:197、199、201和203的nad(h)依赖性3-hpdh可以特别适用于将受益于nadh水平降低的宿主细胞(例如，内源性gpd或pdc基因受破坏从而导致nadh积聚的细胞)，以便改善细胞的氧化还原平衡。

因此，在一个方面中是包含编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸的重组细胞，其中这些细胞能产生3-hp。在一些实施例中，3-hpdh使用nad(h)辅因子。在一些实施例中，与nadp(h)相比，该3-hpdh对辅因子nad(h)具有增加的特异性(例如，与nadp(h)相比，针对nad(h)的大于2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍的特异性)。

在一些实施例中，这些重组细胞包含通过丙二醛半醛中间体进行的主动3-hp途径。在一些方面中，这些细胞缺乏内源性3-hpdh基因或具有内源性3-hpdh的破坏。在一个方面中，3-hpdh存在于宿主细胞的胞液中。

3-hpdh可以是与在此所述适用于宿主细胞及其使用方法的序列有关的任何3-hpdh，例如由具体的seqid号描述的3-hpdh或其保留3-hpdh活性的变体(如人工变体或来自其他物种的天然变体)。

在一些方面中，在相同条件下，3-hpdh具有seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201或seqidno:203的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的3-hpdh活性。

在一个实施例中，该异源多核苷酸编码包含seqidno:197的氨基酸序列或由其组成的3-hpdh。在另一个实施例中，3-hpdh包含seqidno:199的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，3-hpdh包括seqidno:201的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，3-hpdh包括seqidno:203的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，3-hpdh缺乏n末端线粒体靶序列(mts)。

在另一个实施例中，异源多核苷酸编码seqidno:197、199、201或203的多肽的片段，其中该片段具有3-hpdh活性。在一个实施例中，在该片段中的氨基酸残基的数目是参照序列的氨基酸残基的数目的至少75％，例如，至少80％、85％、90％、或95％。

3-hpdh也可以是所述3-hpdh的变体。在一个实施例中，3-hpdh与seqidno:197具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个实施例中，3-hpdh序列与seqidno:197相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，3-hpdh包含以下或由以下组成：seqidno:197的氨基酸序列或其具有3-hpdh活性的等位基因变体或片段。在一个实施例中，3-hpdh具有seqidno:197的一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在一个实施例中，3-hpdh与seqidno:199具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个实施例中，3-hpdh序列与seqidno:199相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，3-hpdh包含以下或由以下组成：seqidno:199的氨基酸序列或其具有3-hpdh活性的等位基因变体或片段。在一个实施例中，3-hpdh具有seqidno:199的一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在一个实施例中，3-hpdh与seqidno:201具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个实施例中，3-hpdh序列与seqidno:201相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，3-hpdh包含以下或由以下组成：seqidno:201的氨基酸序列或其具有3-hpdh活性的等位基因变体或片段。在一个实施例中，3-hpdh具有seqidno:201的一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。

在一个实施例中，3-hpdh与seqidno:203具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一个实施例中，3-hpdh序列与seqidno:203相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸。在一个实施例中，3-hpdh包含以下或由以下组成：seqidno:203的氨基酸序列或其具有3-hpdh活性的等位基因变体或片段。在一个实施例中，3-hpdh具有seqidno:203的一个或多个(例如，两个、若干个)氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10，例如不多于9、8、7、6、5、4、3、2或1。

氨基酸改变的性质通常较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.诺伊拉特(neurath)和r.l.希尔(hill)，1979，在蛋白质(theproteins)，学术出版社(academicpress)，纽约中描述。最常发生的交换是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、和asp/gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有如下此种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进3-hpdh的热稳定性、改变底物特异性、改变最适ph等。

可以根据本领域已知的程序来鉴定必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(cunningham)和威尔斯(wells)，1989，科学(science)244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的3-hpdh活性以鉴别对该分子的活性关键的氨基酸残基。还见希尔顿(hilton)等人，1996，生物化学杂志(j.biol.chem.)271:4699-4708。3-hpdh或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contractsite)氨基酸进行突变。参见，例如，德弗斯(devos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(smith)等人，1992，分子生物学杂志(j.mol.biol.)224:899-904；乌乐达维尔(wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(febslett.)309:59-64。还可以从与参照3-hpdh相关的其他3-hpdh的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。

可以使用本领域所熟知的多重序列比对(msa)技术来确定另外的有关在此的3-hpdh的结构-活性关系的指导。基于在此的教导，本领域的技术人员可以与在此描述的或本领域已知的许多3-hpdh做相似的比对。此类比对帮助本领域的技术人员测定潜在相关地结构域(例如，结合域或催化结构域)，并且在不同的3-hpdh序列中测定哪些氨基酸残基是保守的和不是保守的。本领域中应理解的是，改变在所披露的3-hpdh之间的特定位置处是保守的氨基酸将更有可能导致生物活性的改变(鲍伊(bowie)等人，1990，科学(science)247:1306-1310：“直接涉及到蛋白功能如结合或催化的残基将一定是在最保守的残基中(residuesthataredirectlyinvolvedinproteinfunctionssuchasbindingorcatalysiswillcertainlybeamongthemostconserved)”)。相比之下，取代在这些3-hpdh之间不是高度保守的氨基酸将不可能或不明显地改变生物活性。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(reidhaar-olson)和萨奥尔(sauer)，1988，科学(science)241:53-57；博维(bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如，罗曼(lowman)等人，1991，生物化学(biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；内尔(ner)等人，1988，dna7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999，自然生物技术(naturebiotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性3-hpdh的诱变的dna分子，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

在另一个实施例中，编码3-hpdh的异源多核苷酸包含与seqidno:196具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的编码序列。在另一个实施例中，该编码序列与seqidno:198具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在另一个实施例中，该编码序列与seqidno:200具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在另一个实施例中，该编码序列与seqidno:202具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。

在一个实施例中，编码3-hpdh的异源多核苷酸包含seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202的编码序列。在另一个实施例中，编码3-hpdh的异源多核苷酸包含seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202的编码序列的子序列，其中该子序列编码具有3-hpdh活性的多肽。在一个实施例中，该编码子序列中的核苷酸残基的数目是参照编码序列的数目的至少75％，例如至少80％、85％、90％或95％。

在此描述的任何相关方面或实施例的参考编码序列可以是天然编码序列或简并序列，例如为特定宿主细胞设计的密码子优化的编码序列。

可以使用seqidno:196、198、200或202的多核苷酸编码序列或其子序列、以及seqidno:197、199、201或203的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种类的菌株的亲本的dna。具体而言，此类探针可以用于按照标准dna印迹程序与感兴趣的细胞的基因组dna或cdna杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。dna和rna探针两者都可使用。典型地这些探针被标记用于检测相应的基因(例如用³²p、³h、³⁵s、生物素或亲合素)。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的dna来筛选由这类其他菌株制备的基因组dna或cdna文库。来自这类其他菌株的基因组dna或其他dna可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的dna或分离的dna转移至硝化纤维素或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202或其子序列杂交的克隆或dna，将载体材料用于dna印迹中。

在一个方面中，该核酸探针是一种包含seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200或seqidno:202，或其子序列的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是编码seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201或seqidno:203的多肽，或其片段的多核苷酸。

出于上述探针的目的，杂交是指，在非常低至非常高严格条件下，多核苷酸杂交至标记的核酸探针或其全长互补链或前述各项的子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如x-射线胶片而进行检测。严格性和洗涤条件如上述所定义。

在一个实施例中，3-hpdh由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与seqidno:196的全长互补链杂交。(萨拉布鲁克(sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(molecularcloning,alaboratorymanual)，第2版，冷泉港，纽约)。在另一个方面中，3-hpdh由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与seqidno:198的全长互补链杂交。在另一个方面中，3-hpdh由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与seqidno:200的全长互补链杂交。在另一个方面中，3-hpdh由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与seqidno:202的全长互补链杂交。

这些3-hpdh可以获得自任何适合属的微生物，这些微生物包括在uniprotkb数据库(www.uniprot.org)内可容易获得的那些。

该3-hpdh可以是细菌3-hpdh。例如，该3-hpdh可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(bacillus)、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属(oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属3-hpdh；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属(flavobacterium)、梭杆菌属(fusobacterium)、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门菌属或脲原体属3-hpdh。

在一个实施例中，该3-hpdh是嗜碱芽孢杆菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)3-hpdh。

在另一个实施例中，该3-hpdh是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种3-hpdh。

在另一个实施例中，该3-hpdh是不产色链霉菌(streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(streptomyceslividans)3-hpdh。

该3-hpdh可以是真菌3-hpdh。例如，该3-hpdh可以是酵母3-hpdh，如假丝酵母属(candida)、克鲁弗酵母属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(pichia)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母(schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(yarrowia)或伊萨酵母属(issatchenkia)3-hpdh；或丝状真菌3-hpdh，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(lentinula)、小腔球菌属(leptospaeria)、梨孢菌属(magnaporthe)、黑果菌属(melanocarpus)、亚灰树花菌属(meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属3-hpdh。

在另一个实施例中，该3-hpdh是卡尔酵母(saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(saccharomyceskluyveri)、诺地酶母(saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(saccharomycesoviformis)3-hpdh。

在另一个实施例中，该3-hpdh是解纤维枝顶孢霉(acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、烟曲霉(aspergillusfumigatus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(fusariumbactridioides)、谷类镰孢(fusariumcerealis)、库威镰孢(fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(fusariumculmorum)、禾谷镰孢(fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(fusariumgraminum)、异孢镰孢(fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(fusariumnegundi)、尖镰孢(fusariumoxysporum)、多枝镰孢(fusariumreticulatum)、粉红镰孢(fusariumroseum)、接骨木镰孢(fusariumsambucinum)、肤色镰孢(fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(fusariumsulphureum)、圆镰孢(fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(fusariumvenenatum)、灰腐质霉(humicolagrisea)、特异腐质霉(humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(humicolalanuginosa)、白耙齿菌(irpexlacteus)、米黑毛霉(mucormiehei)、嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)、粗糙链孢菌(neurosporacrassa)、绳状青霉菌(penicilliumfuniculosum)、产紫青霉菌(penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳霉(thielaviaachromatica)、阿波梭孢壳菌(thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳霉(thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳霉(thielaviaaustraleinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(thielaviafimeti)、小孢梭孢壳霉(thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳霉(thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳霉(thielaviaperuviana)、毛梭孢壳霉(thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳霉(thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳霉(thielaviaterrestris)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康宁木霉(trichodermakoningii)、长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)、或绿色木霉(trichodermaviride)3-hpdh。

在另一个方面中，该3-hpdh来自德巴利氏酵母属，例如seqidno:199的汉逊德巴利酵母(debaryomyceshansenii)3-hpdh。在另一个方面中，该3-hpdh来自假丝酵母属，例如seqidno:197的近平滑假丝酵母3-hpdh。在另一个方面中，该3-hpdh来自meyerozyma属，例如seqidno:201的季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3-hpdh。在另一个方面中，该3-hpdh来自棒孢酵母属(clavispora)，例如seqidno:203的葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)3-hpdh。

应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfectandimperfectstates)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(nrrl)。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsm)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(nrrl)。

也可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水、青贮等)获得的dna样品鉴定并获得3-hpdh。用于直接地从自然生活环境分离微生物和dna的技术是本领域中熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cdna文库或混合dna样品衍生编码3-hpdh的多核苷酸。

一旦用如在此所述的合适探针检测到编码3-hpdh的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术来分离或克隆该序列(参见例如，萨拉布鲁克(sambrook)等人，1989，见上文)。用来分离或克隆编码3-hpdh的多核苷酸的技术包括从基因组dna分离、从cdna制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(pcr)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆dna片段，实现从这样的基因组dna克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(innis)等人，1990，pcr：方法和应用指南(pcr:aguidetomethodsandapplication)，学术出版社(academicpress)，纽约。还可以使用其他核酸扩增程序，诸如连接酶链式反应(lcr)、连接激活转录(lat)和基于核苷酸序列的扩增(nasba)。

该3-hpdh可以是一种融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽融合在该3-hpdh的n-末端或c-末端处。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与编码3-hpdh的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合蛋白，其中在翻译后产生融合物(库珀(cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)12:2575-2583；道森(dawson)等人，1994，科学(science)266:776-779)。

主动3-hp途径

任何适合的3-hp途径都可以与具有异源3-hpdh的重组细胞一起使用，以产生3-hp。3-hp途径、3-hp途径基因以及用于发酵3-hp的对应的工程转化体在本领域是已知的(例如，美国公开号2012/0135481；美国专利号6,852,517；美国专利号7,309,597；美国公开号2001/0021978；美国公开号2008/0199926；wo02/42418；以及wo10/031083；将其内容以其全文结合在此)。若干已知的3-hp途径的综述示于图1中。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞具有通过丙二酸半醛中间体进行的主动3-hp途径。本领域已知若干种通过丙二酸半醛中间体进行的3-hp途径。例如，这些细胞具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过pep或丙酮酸、oaa、天冬氨酸、β-丙氨酸以及丙二酸半醛中间体而进行(参见，例如，us7,186,541，图55)。在这些实施例中，这些重组细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括丙酮酸羧化酶(pyc)、pep羧化酶(ppc)、天冬氨酸转氨酶(aat)、天冬氨酸1-脱羧酶(adc)、β-丙氨酸转氨酶(baat)、氨基丁酸转氨酶(gabt)、3-hp脱氢酶(3-hpdh)、3-羟基异丁酸脱氢酶(hibadh)以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-hp途径基因还可以包括pep羧激酶(pck)基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa(天然的pck基因通常产生以下多肽，该多肽优选地催化oaa至pep的逆反应)。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过pep或丙酮酸、oaa和丙二酸半醛中间体而进行(参见例如，美国公开号2010/0021978，图1)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括ppc、pyc、2-酮酸脱羧酶、α-酮戊二酸(akg)脱羧酶(kgd)、支链α-酮酸脱羧酶(bcka)、吲哚丙酮酸脱羧酶(ipda)、3-hpdh、hibadh以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-hp途径基因还可以包括一种pck基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa。另外，这些3-hp途径基因包括一种pdc基因和/或苯甲酰甲酸脱羧酶基因，该基因已被修饰为编码以下多肽，该多肽能够催化oaa转化为丙二酸半醛。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过pep或丙酮酸、oaa、丙二酰辅酶a以及丙二酸半醛中间体而进行，其中该丙二酸半醛中间体是任选的(参见例如，美国公开号2010/0021978，图2)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括ppc、pyc、oaa甲酸裂解酶、丙二酰辅酶a还原酶、辅酶a酰化丙二酸半醛脱氢酶、3-hpdh、hibadh以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。这些3-hp途径基因还可以包括一种pck基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa。另外，这些3-hp途径基因可以包括一种oaa脱氢酶基因，该基因是通过将2-酮酸脱氢酶基因修饰以产生一种多肽而得到，该多肽催化oaa转化为丙二酰辅酶a。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过丙酮酸、乙酰辅酶a、丙二酰辅酶a以及丙二酸半醛中间体而进行，其中该丙二酸半醛中间体是任选的(参见例如，us7,186,541；图44)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括丙酮酸脱氢酶(pdh)、乙酰辅酶a羧化酶(acc)、丙二酰辅酶a还原酶、辅酶a酰化丙二酸半醛脱氢酶、3-hpdh、hibadh以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过丙酮酸、丙氨酸、β-丙氨酸、β-丙氨酰辅酶a、丙烯酰辅酶a、3-hp辅酶a以及丙二酸半醛中间体而进行，其中β-丙氨酰辅酶a、丙烯酰辅酶a、3-hp辅酶a以及丙二酸半醛中间体是任选的(可以经由丙二酸半醛中间体或经由β-丙氨酰辅酶a、丙烯酰辅酶a和3-hp辅酶a中间体将β-丙氨酸转化为3-hp)(参见例如，美国专利7,309,597，图1)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括丙氨酸脱氢酶、丙酮酸/丙氨酸转氨酶、丙氨酸2,3氨基变位酶、辅酶a转移酶、辅酶a合成酶、β-丙氨酰辅酶a解氨酶、3-hp辅酶a脱水酶、3-hp辅酶a水解酶、3-羟基异丁酰辅酶a水解酶、baat、3-hpdh、hibadh以及4-羟基丁酸脱氢酶基因中的一种或多种。

其他不利用丙二酸半醛中间体的途径也是本领域已知的。例如，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过pep或丙酮酸、oaa和苹果酸中间体而进行(参见例如，美国公开号2010/0021978；图4)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括ppc、pyc、苹果酸脱氢酶以及苹果酸脱羧酶基因中的一种或多种。这些3-hp途径基因还可以包括一种pck基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过丙酮酸、乳酸、乳酰辅酶a、丙烯酰辅酶a以及3-hp辅酶a中间体而进行(参见例如，wo02/042418，图1)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括ldh、辅酶a转移酶、辅酶a合成酶、乳酰辅酶a脱水酶、3-hp辅酶a脱水酶、3-hp辅酶a水解酶以及3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因中的一种或多种。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过甘油和3-hpa中间体而进行(参见例如，美国专利6,852,517)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括甘油脱水酶和醛脱氢酶基因中的一种或多种。

在另一个实例中，这些重组细胞可以具有以下主动3-hp途径，该主动3-hp途径通过pep或丙酮酸、oaa、天冬氨酸、β-丙氨酸、β-丙氨酰辅酶a、丙烯酰辅酶a、3-hp辅酶a以及丙氨酸中间体而进行，其中oaa、天冬氨酸和丙氨酸中间体是任选的(可以经由oaa和天冬氨酸或经由丙氨酸将pep或丙酮酸转化为β-丙氨酸)(参见wo02/042418，图54；美国专利7,309,597，图1)。在这些实施例中，这些细胞包括一套3-hp途径基因，这些基因包括ppc、pyc、aat、adc、辅酶a转移酶、辅酶a合成酶、β-丙氨酰辅酶a解氨酶、3-hp-辅酶a脱水酶、3-hp-辅酶a水解酶、3-羟基异丁酰辅酶a水解酶、丙氨酸脱氢酶、丙酮酸/丙氨酸转氨酶以及aam基因中的一种或多种。这些3-hp途径基因还可以包括一种pck基因，该基因已被修饰为产生以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞表达一种或多种编码选自下组的酶的3-hp途径基因，该组由以下各项组成：acc(催化乙酰辅酶a转化为丙二酰辅酶a)，丙氨酸2,3氨基变位酶(aam，催化丙氨酸转化为β-丙氨酸)，丙氨酸脱氢酶(催化丙酮酸转化为丙氨酸)，醛脱氢酶(催化3-hpa转化为3-hp)，kgd(催化oaa转化为丙二酸半醛)，aat(催化oaa转化为天冬氨酸)，adc(催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸)，bcka(催化oaa转化为丙二酸半醛)，baat(催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛)，4-氨基丁酸转氨酶(gabt，催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛)，β-丙氨酰辅酶a解氨酶(催化β-丙氨酰辅酶a转化为丙烯酰辅酶a)，辅酶a酰化丙二酸半醛脱氢酶(催化丙二酰辅酶a转化为丙二酸半醛)，辅酶a合成酶(催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶a或将乳酸转化为乳酰辅酶a)，辅酶a转移酶(催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶a和/或将乳酸转化为乳酰辅酶a)，甘油脱水酶(催化甘油转化为3-hpa)，ipda(催化oaa转化为丙二酸半醛)，ldh(催化丙酮酸转化为乳酸)，乳酰辅酶a脱水酶(催化乳酰辅酶a转化为丙烯酰辅酶a)，苹果酸脱羧酶(催化苹果酸转化为3-hp)，苹果酸脱氢酶(催化oaa转化为苹果酸)，丙二酰辅酶a还原酶(催化丙二酰辅酶a转化为丙二酸半醛或3-hp)，oaa甲酸裂解酶(亦称丙酮酸-甲酸裂解酶和酮酸甲酸裂解酶，催化oaa转化为丙二酰辅酶a)，oaa脱氢酶(催化oaa转化为丙二酰辅酶a)；ppc(催化pep转化为oaa)，丙酮酸/丙氨酸转氨酶(催化丙酮酸转化为丙氨酸)，pyc(催化丙酮酸转化为oaa)，pdh(催化丙酮酸转化为乙酰辅酶a)，2-酮酸脱羧酶(催化oaa转化为丙二酸半醛)，3-hp辅酶a脱水酶(亦称丙烯酰辅酶a水合酶，催化丙烯酰辅酶a转化为3-hp辅酶a)，3-hpdh(催化丙二酸半醛转化为3-hp)，3-hp辅酶a水解酶(催化3-hp辅酶a转化为3-hp)，hibadh(催化丙二酸半醛转化为3-hp)，3-羟基异丁酰辅酶a水解酶(催化3-hp辅酶a转化为3-hp)以及4-羟基丁酸脱氢酶(催化丙二酸半醛转化为3-hp)。对于这些酶活性中的每种酶活性而言，感兴趣的反应(括号中)可以是内源或异源活性的结果。

可以使用任何适合的3-hp途径基因(内源的或异源的)并以足以产生在所选的主动3-hp途径中涉及的酶的量表达。伴随现在多于550个物种可获得的全基因组序列(其中多于一半的这些序列可在公共数据库(例如ncbi)中获得)(包括395个微生物基因组以及多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组)，对于所选的宿主而言，编码在此教导的所选3-hp途径的酶活性的基因的鉴定在本领域是常规且熟知的。例如，已知基因的适合的同源物、直向同源物、旁系同源物和非直向同源物基因替代，和在生物之间的遗传改变的互换可以在与选择的宿主相关的或远缘的宿主中来鉴定。

对于没有已知基因组序列的重组细胞而言，可以典型地使用本领域已知的技术获得感兴趣的基因的序列(作为过表达候选物或作为插入位点)。可以利用常规实验设计测试各种基因的表达和各种酶的活性，包括在3-hp途径中起作用的基因和酶。可以进行实验，其中单独地在细胞中和在酶区块(直至并优选包括所有途径酶，针对改善3-hp生产的需要(或希望)而建立)中表达每种酶。一种说明性实验设计测试了每种单独的酶以及每个独特的酶对的表达，并且可以进一步测试所有需要的酶或每个独特的酶组合的表达。如应该领会的，可以采取多种方法。

可以通过引入编码一种或多种参与3-hp途径的酶的异源多核苷酸而产生本发明的重组宿主细胞，如下所述。如本领域的普通技术人员应该领会的，在一些情况下(例如，取决于宿主的选择)，鉴于宿主细胞可以具有来自一个或多个途径基因的内源酶活性，示于3-hp途径中的每个基因的异源表达可能并不为3-hp生产所需要。例如，如果选择的宿主缺乏3-hp途径的一种或多种酶，则将一种或多种缺陷酶的异源多核苷酸引入该宿主中，用于进行随后的表达。可替代地，如果选择的宿主展现出一些途径基因的内源表达，但是缺乏其他基因的内源表达，则需要缺乏的一种或多种酶的编码多核苷酸，以实现生物合成3-hp。因此，可以通过引入异源多核苷酸而产生重组宿主细胞，以获得希望的生物合成途径的酶活性，或可以通过引入一种或多种希望的异源多核苷酸而获得希望的生物合成途径，这些希望的异源多核苷酸与一种或多种内源酶一起产生希望的产物，例如3-hp。

取决于所选重组宿主生物的3-hp途径成分，本发明的宿主细胞将包括至少一种编码3-hpdh的异源多核苷酸以及任选地直到包括3-hp途径的所有编码异源多核苷酸。例如，可以通过异源表达对应的多核苷酸而在缺乏3-hp途径酶的宿主中建立3-hp生物合成。在缺乏3-hp途径的所有酶的宿主中，可以包括异源表达该途径中的所有酶，尽管应该理解的是即使该宿主包括至少一种途径酶，仍可以表达途径的所有酶。

如在此使用，“丙酮酸羧化酶基因”或“pyc基因”是指编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸、co2和atp转化为oaa、adp和磷酸。在某些实施例中，pyc基因可以来自酵母来源。例如，该pyc基因可以来自东方伊萨酵母pyc基因，该基因编码阐述于seqidno:2中的氨基酸序列。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:2的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的pyc基因可以包括阐述于seqidno:1中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:1中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该pyc基因可以来自细菌来源。例如，该pyc基因可以来自仅使用pyc而不使用ppc(参见下文)用于进行回补的几种细菌物种之一(例如球形红假单胞菌)或来自具有pyc和ppc两者的细菌物种(例如依特利红假单胞菌(r.etli))。由球形红假单胞菌和依特利红假单胞菌的pyc基因编码的氨基酸序列分别阐述于seqidno:3和4中。pyc基因可以来自编码seqidno:3或4的氨基酸序列的基因或来自编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与seqidno:3或4的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。可替代地，该pyc基因可以来自编码不依赖乙酰辅酶a进行活化的酶的pyc基因，例如编码阐述于seqidno:5(羧基转移酶亚单位)或seqidno:6(生物素羧化酶亚单位)中的氨基酸序列的荧光假单胞菌pyc基因、编码阐述于seqidno:7中的氨基酸序列的谷氨酸棒状杆菌pyc基因或编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与seqidno:5、6或7的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或至少99％序列一致性。pyc基因还可以来自编码不被天冬氨酸抑制的酶的pyc基因，例如编码阐述于seqidno:8中的氨基酸序列的苜蓿中华根瘤菌pyc基因(萨奥尔(sauer)fems微生物学评论(femsmicrobiolrev)29:765(2005))，或来自编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与seqidno:8的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

如在此使用，“pep羧化酶基因”或“ppc基因”是指编码具有pep羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化pep和co2转化为oaa和磷酸。在某些实施例中，ppc基因可以来自细菌ppc基因。例如，该ppc基因可以来自编码阐述于seqidno:10中的氨基酸序列或以下氨基酸序列的大肠杆菌ppc基因，该氨基酸序列与seqidno:10的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自大肠杆菌的ppc基因可以包括阐述于seqidno:9中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:9中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，ppc基因可以来自“a”型ppc，发现于许多古细菌和数目有限的细菌中，不被乙酰辅酶a激活且较不受天冬氨酸的抑制。例如，ppc基因可以来自编码阐述于seqidno:11中的氨基酸序列的嗜热自养甲烷杆菌ppca基因、编码阐述于seqidno:12中的氨基酸序列的产气荚膜梭菌ppca基因或编码以下氨基酸序列的基因，该氨基酸序列与seqidno:11或12的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在这些实施例的某些实施例中，该基因可以已经经历对天然基因的一个或多个突变，以便产生具有改进的特征的酶。例如，该基因可以被突变为编码以下ppc多肽，该多肽与天然多肽相比对天冬氨酸反馈具有增加的耐受性。在其他实施例中，该ppc基因可以来自植物来源。

如在此使用，“天冬氨酸转氨酶基因”或“aat基因”是指编码具有天冬氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化oaa转化为天冬氨酸。具有天冬氨酸转氨酶活性的酶被分类为ec2.6.1.1。在某些实施例中，aat基因可以来自酵母来源，例如东方伊萨酵母或酿酒酵母。例如，该aat基因可以来自编码阐述于seqidno:14中的氨基酸序列的东方伊萨酵母aat基因或编码阐述于seqidno:15中的氨基酸序列的酿酒酵母aat2基因。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:14或15的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的aat基因可以包括阐述于seqidno:13中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:13中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该aat基因可以来自细菌来源。例如，该aat基因可以来自大肠杆菌aspc基因，该基因编码包括阐述于seqidno:16中的氨基酸序列的多肽。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:16的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

如在此使用，“天冬氨酸脱羧酶基因”或“adc基因”是指编码具有天冬氨酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。具有天冬氨酸脱羧酶活性的酶被分类为ec4.1.1.11。在某些实施例中，adc基因可以来自细菌来源。

在一些实施例中，该adc基因可以来自除虫链霉菌pand基因，该基因编码阐述于seqidno:17中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:17的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自除虫链霉菌的adc基因可以包括阐述于seqidno:130、145、146或147的任一项中的核苷酸序列；或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:130、145、146或147的任一项中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以来自丙酮丁醇梭菌pand基因，该基因编码阐述于seqidno:18中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:18的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自丙酮丁醇梭菌的adc基因可以包括阐述于seqidno:131中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:131中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以来自幽门螺杆菌adc基因，该基因编码阐述于seqidno:133中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:133的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自幽门螺杆菌的adc基因可以包括阐述于seqidno:133中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:133中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以来自芽孢杆菌属ts25adc基因，该基因编码阐述于seqidno:135中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:135的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自芽孢杆菌属ts25的adc基因可以包括阐述于seqidno:134中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:134中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以来自谷氨酸棒状杆菌adc基因，该基因编码阐述于seqidno:137中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:137的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自谷氨酸棒状杆菌的adc基因可以包括阐述于seqidno:136中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:136中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以来自地衣芽孢杆菌adc基因，该基因编码阐述于seqidno:139中的氨基酸序列。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:139的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自地衣芽孢杆菌的adc基因可以包括阐述于seqidno:138、148、149、150或151的任一项中的核苷酸序列；或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:138、148、149、150或151的任一项中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该adc基因可以衍生自昆虫纲(昆虫)adc基因，例如pct/us2014/049286中所述(其内容通过引用并入本文)。因此，在一些实施例中，该adc基因可以编码以下各项的氨基酸序列：seqidno:162的埃及伊蚊adc，seqidno:163的五带淡色库蚊adc、seqidno:164的冈比亚按蚊adc、seqidno:165的赤拟谷盗adc、seqidno:166的斯氏毛皮蠹(attagenussmirnovi)adc、seqidno:167的豌豆蚜(acyrthosiphonpisum)adc、seqidno:168的瑟车利亚果蝇(drosophilasechellia)adc、seqidno:169的黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)adc、seqidno:170的大斑蝶(danausplexippus)adc、seqidno:171的亚库巴果蝇(drosophilayakuba)adc、seqidno:172的埃瑞克塔果蝇(drosophilaerecta)adc、seqidno:173的柑橘凤蝶(papilioxuthus)adc、seqidno:174的黑翅果蝇(drosophilapersimilis)adc、seqidno:175的家蚕adc、seqidno:176的嗜凤梨果蝇(drosophilaananassae)adc、seqidno:177的漠海威果蝇(drosophilamojavensis)adc、seqidno:178的格瑞姆肖果蝇(drosophilagrimshawi)adc、seqidno:179的桦尺蠖(bistonbetularia)adc、seqidno:180的威尔斯托尼果蝇(drosophilawillistoni)adc、seqidno:181的西方蜜蜂adc、seqidno:182的维尔利斯果蝇(drosophilavirilis)adc、seqidno:183的丽蝇蛹集金小蜂(nasoniavitripennis)adc、seqidno:184的偏瞳蔽眼蝶(bicyclusanynana)adc、seqidno:185的印度跳蚁(harpegnathossaltator)adc、seqidno:186的切叶蚁(acromyrmexechinatior)adc、seqidno:187的佛罗里达弓背蚁(camponotusfloridanus)adc、seqidno:188的人虱adc、seqidno:189的大头美切叶蚁(attacephalotes)adc、seqidno:190的油菜花露尾甲(meligethesaeneus)adc、或seqidno:191的红火蚁adc。在另一个方面中，是包含双壳纲、鳃足纲、腹足纲、或头索纲(leptocardii)的天冬氨酸1-脱羧酶(adc)的重组细胞，该天冬氨酸1-脱羧酶(adc)如seqidno:192的蚤状溞(daphniapulex)adc、seqidno:193的霸王莲花青螺(lottiagigantea)adc、seqidno:194的佛罗里达文昌鱼(branchiostomafloridae)adc、或seqidno:195的太平洋牡蛎(crassostreagigas)adc。在一些实施例中，该adc基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:162-195中任一个的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

如在此使用，“β-丙氨酸转氨酶基因”或“baat基因”是指编码具有β-丙氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化β-丙氨酸转化为丙二酸半醛。具有β-丙氨酸转氨酶活性的酶被分类为ec2.6.1.19。在某些实施例中，baat基因可以来自酵母来源。例如，baat基因可以来自pyd4基因的东方伊萨酵母同系物，其编码阐述于seqidno:20中的氨基酸序列。在一些实施例中，该baat基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:20的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母的baat基因可以包括阐述于seqidno:19中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:19中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该baat基因可以来自克鲁弗毕赤酵母pyd4基因，该基因编码阐述于seqidno:21中的氨基酸序列。在一些实施例中，该baat基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:21的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自克鲁弗毕赤酵母的baat基因可以包括阐述于seqidno:142中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:142中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该baat基因可以来自细菌来源。例如，baat基因可以来自除虫链霉菌baat基因，该基因编码阐述于seqidno:22中的氨基酸序列。在一些实施例中，该baat基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:22的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自除虫链霉菌的baat基因可以包括阐述于seqidno:140中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:140中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

baat基因还可以是“4-氨基丁酸转氨酶”或“gabt基因”，意指它对4-氨基丁酸以及β-丙氨酸具有天然活性。可替代地，可以通过随机或定向工程化来自细菌或酵母来源的天然gabt基因而得到baat基因，以编码具有baat活性的多肽。例如，baat基因可以来自除虫链霉菌gabt基因，该gabt基因编码阐述于seqidno:23中的氨基酸序列。在一些实施例中，来自除虫链霉菌的baat基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:23的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，baat基因可以来自酿酒酵母gabt基因uga1，该基因编码阐述于seqidno:24中的氨基酸序列。在一些实施例中，来自酿酒酵母的baat基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:24的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，来自酿酒酵母的baat基因可以包括阐述于seqidno:141中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:141中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

除了用于编码seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201或seqidno:203的多肽的3-hpdh基因之外，该重组细胞可以任选地包含一个或多个(例如，两个，若干个)另外的3-hpdh基因。在某些实施例中，该另外的3-hpdh基因可以来自酵母来源。例如，该另外的3-hpdh基因可以来自ymr226c基因的东方伊萨酵母同系物，其编码阐述于seqidno:26中的氨基酸序列。在一些实施例中，该另外的3-hpdh基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:26的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，该另外的来自东方伊萨酵母的3-hpdh基因可以包括阐述于seqidno:25中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:25中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该另外的3-hpdh基因可以来自酿酒酵母ymr226c基因，该ymr226c基因编码阐述于seqidno:129中的氨基酸序列。在一些实施例中，该另外的3-hpdh基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:129的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，该另外的来自酿酒酵母的3-hpdh基因可以包括阐述于seqidno:144中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:144中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在其他实施例中，该另外的3-hpdh基因可以来自细菌来源。例如，3-hpdh基因可以来自大肠杆菌ydfg基因，该基因编码seqidno:27中的氨基酸序列。在一些实施例中，该另外的3-hpdh基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:27的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，该另外的来自大肠杆菌的3-hpdh基因可以包括阐述于seqidno:143中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:143中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，该另外的3-hpdh基因可以来自勤奋金属球菌(m.sedula)丙二酸半醛还原酶基因，该基因编码阐述于seqidno:29中的氨基酸序列。在一些实施例中，该另外的3-hpdh基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于seqidno:29中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在某些实施例中，该另外的来自勤奋金属球菌的3-hpdh基因可以包括阐述于seqidno:152中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:152中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

在某些实施例中，与nadp(h)相比，该另外的3-hpdh基因可以是具有针对nad(h)的增加的特异性的天然的或工程化基因。具有针对nad(h)的增加的特异性的3-hpda变体描述于wo2013/049073(其内容在此通过引用并入本文)中。

如在此使用，“3-羟基异丁酸脱氢酶基因”或“hibadh基因”是指编码具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化3-羟基异丁酸转化为甲基丙二酸半醛。具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的酶被分类为ec1.1.1.31。一些3-羟基异丁酸脱氢酶还具有3-hpdh活性。在某些实施例中，hibadh基因可以来自细菌来源。例如，hibadh基因可以来自编码阐述于seqidno:28中的氨基酸序列的粪产碱菌(a.faecalis)m3a基因、分别编码阐述于seqidno:30或seqidno:31中的氨基酸序列的恶臭假单胞菌kt2440或e23440mmsb基因或编码阐述于seqidno:32中的氨基酸序列的铜绿假单胞菌pao1mmsb基因。在一些实施例中，hibadh基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于seqidno:28、30、31或32中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

如在此使用，“4-羟基丁酸脱氢酶基因”是指编码具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化4-羟基丁酸转化为丁二酸半醛。具有4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶被分类为ec1.1.1.61。一些4-羟基丁酸脱氢酶还具有3-hpdh活性。在某些实施例中，4-羟基丁酸脱氢酶基因可以来自细菌来源。例如，4-羟基丁酸脱氢酶基因可以来自编码阐述于seqidno:33中的氨基酸序列的真氧产碱杆菌(r.eutropha)h164hbd基因或编码阐述于seqidno:34中的氨基酸序列的克氏梭菌(c.kluyveri)dsm555hbd基因。在其他实施例中，该基因可以编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列与阐述于seqidno:33或34中的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。

如在此使用，“pep羧激酶基因”或“pck基因”是指编码具有pep羧激酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化pep、co2、和adp或gdp转化为oaa和atp或gtp，或反之亦然。具有pep羧激酶活性的酶被分类为ec4.1.1.32(利用gtp/gdp)和ec4.1.1.49(利用atp/adp)。在某些实施例中，pck基因可以来自酵母来源。在其他实施例中，pck基因可以来自细菌来源，并且在这些实例的某些实施例中，该基因可以来自以下细菌，在该细菌体内pck反应有利于oaa的产生而非其中脱羧作用是优势的更常见形式的反应。例如，pck基因可以来自编码阐述于seqidno:35中的氨基酸序列的产琥拍酸曼氏杆菌(m.succiniciproducens)pck基因、编码阐述于seqidno:36中的氨基酸序列的产琥珀酸厌氧螺菌(a.succiniciproducens)pck基因、编码阐述于seqidno:37中的氨基酸序列的产琥珀酸放线杆菌(a.succinogenes)pck基因或编码阐述于seqidno:38中的氨基酸序列的真氧产碱杆菌pck基因。在其他实施例中，pck基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码以下多肽，该多肽优选地催化pep转化为oaa。例如，pck基因可以来自编码阐述于seqidno:39中的氨基酸序列的大肠杆菌k12菌株pck基因，其中该基因已被突变为优选地催化pep转化为oaa。在其他实施例中，通过pep羧基转磷酸酶催化pep至oaa的转化，例如发现于丙酸细菌(例如，谢氏丙酸杆菌(p.shermanii)、伍氏醋酸杆菌(a.woodii))中的，这些丙酸细菌使用无机磷酸和二磷酸而非atp/adp或gtp/gdp。

如在此使用，“苹果酸脱氢酶基因”是指编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化oaa转化为苹果酸。在某些实施例中，苹果酸脱氢酶基因可以来自细菌或酵母来源。

如在此使用，“苹果酸脱羧酶基因”是指编码具有苹果酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化苹果酸转化为3-hp。已知苹果酸脱羧酶活性不天然地发生。因此，可以通过将一个或多个突变掺入天然来源基因中而得到苹果酸脱羧酶基因，该天然来源基因编码具有乙酰乳酸脱羧酶活性的多肽。具有乙酰乳酸脱羧酶活性的多肽催化2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸转化为2-乙偶姻，并被分类为ec4.1.1.5。在某些实施例中，苹果酸脱羧酶基因可以来自细菌来源。例如，苹果酸脱羧酶基因可以来自编码阐述于seqidno:40中的氨基酸序列的乳酸乳球菌aldb基因、编码阐述于seqidno:41中的氨基酸序列的嗜热链球菌aldb基因、编码阐述于seqidno:42中的氨基酸序列的短芽孢杆菌aldb基因或编码阐述于seqidno:43中的氨基酸序列的产气肠杆菌buda基因。

如在此使用，“α-酮戊二酸(akg)脱羧酶基因”或“kgd基因”是指编码具有α-酮戊二酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化α-酮戊二酸(2-氧化戊二酸)转化为丁二酸半醛。具有akg脱羧酶活性的酶被分类为ec4.1.1.71。可以使用kgd基因得到以下基因，该基因编码能够催化oaa转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然kgd基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然kgd基因中而得到该活性。在某些实施例中，kgd基因可以来自细菌来源。例如，kgd基因可以来自编码阐述于seqidno:44中的氨基酸序列的结核分枝杆菌kgd基因、编码阐述于seqidno:45中的氨基酸序列的慢生型大豆根瘤菌kgd基因或编码阐述于seqidno:46中的氨基酸序列的洛蒂分枝杆菌(m.loti)(又称洛蒂根瘤菌(rhizobiumloti))kgd基因。

如在此使用，“支链α-酮酸脱羧酶基因”或“bcka基因”是指编码具有支链α-酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，该活性可用于使一系列长度为三至六个碳的α-酮酸脱羧。具有bcka活性的酶被分类为ec4.1.1.72。可以使用bcka基因得到以下基因，该基因编码能够催化oaa转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然bcka基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然bcka基因中而得到该活性。在某些实施例中，bcka基因可以来自细菌来源。例如，bcka基因可以来自乳酸乳球菌kdca基因，该kdca基因编码阐述于seqidno:47中的氨基酸序列。

如在此使用，“吲哚丙酮酸脱羧酶基因”或“ipda基因”是指编码具有吲哚丙酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化吲哚丙酮酸转化为吲哚乙醛。具有ipda活性的酶被分类为ec4.1.1.74。可以使用ipda基因得到以下基因，该基因编码能够催化oaa转化为丙二酸半醛的多肽。这一活性可以发现于天然ipda基因中，或可以通过将一个或多个突变掺入天然ipda基因中而得到该活性。在某些实施例中，吲哚丙酮酸脱羧酶基因可以来自酵母、细菌或植物来源。

如在此使用，“丙酮酸脱羧酶基因”或“pdc基因”是指编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乙醛。具有pdc活性的酶被分类为ec4.1.1.1。在优选实施例中，被掺入如在此提供的重组细胞中的pdc基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码能够催化oaa转化为丙二酸半醛的多肽。在某些实施例中，pdc基因可以来自酵母来源。例如，pdc基因可以来自编码阐述于seqidno:49中的氨基酸序列的东方伊萨酵母pdc基因、编码阐述于seqidno:50中的氨基酸序列的酿酒酵母pdc1基因或编码阐述于seqidno:51中的氨基酸序列的乳酸克鲁弗酵母pdc基因。在某些实施例中，来自东方伊萨酵母pdc基因的pdc基因可以包括阐述于seqidno:48中的核苷酸序列或以下核苷酸序列，该核苷酸序列与阐述于seqidno:48中的核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列一致性。在其他实施例中，pdc基因可以来自细菌来源。例如，pdc基因可以来自编码阐述于seqidno:52中的氨基酸序列的运动发酵单胞菌pdc基因或编码阐述于seqidno:53中的氨基酸序列的巴氏醋酸杆菌pdc基因。

如在此使用，“苯甲酰甲酸脱羧酶”基因是指编码具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的酶被分类为ec4.1.1.7。在优选实施例中，被掺入如在此提供的重组细胞中的苯甲酰甲酸脱羧酶基因已经经历对它来自其中的天然基因的一个或多个突变，这样使得所得基因编码能够催化oaa转化为丙二酸半醛的多肽。在某些实施例中，苯甲酰甲酸脱羧酶基因可以来自细菌来源。例如，苯甲酰甲酸脱羧酶基因可以来自编码阐述于seqidno:54中的氨基酸序列的恶臭假单胞菌mdlc基因、编码阐述于seqidno:55中的氨基酸序列的铜绿假单胞菌mdlc基因、编码阐述于seqidno:56中的氨基酸序列的施氏假单胞菌dpgb基因或编码阐述于seqidno:57中的氨基酸序列的荧光假单胞菌ilvb-1基因。

如在此使用，“oaa甲酸裂解酶基因”是指编码具有oaa甲酸裂解酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化酰化物酮酸转化为其对应的辅酶a衍生物。由oaa甲酸裂解酶基因编码的多肽对丙酮酸或对另一种酮酸可以具有活性。在某些实施例中，oaa甲酸裂解酶基因编码一种将oaa转化为丙二酰辅酶a的多肽。

如在此使用，“丙二酰辅酶a还原酶基因”是指编码具有丙二酰辅酶a还原酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙二酰辅酶a转化为丙二酸半醛(亦称辅酶a酰化丙二酸半醛脱氢酶活性)。在某些实施例中，丙二酰辅酶a还原酶基因可以来自双功能丙二酰辅酶a还原酶基因，该双功能丙二酰辅酶a还原酶基因还具有催化丙二酸半醛转化为3-hp的能力。在这些实施例的某些实施例中，丙二酰辅酶a还原酶基因可以来自细菌来源。例如，丙二酰辅酶a还原酶基因可以来自编码阐述于seqidno:58中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌(c.aurantiacus)丙二酰辅酶a还原酶基因、编码阐述于seqidno:59中的氨基酸序列的卡氏玫瑰弯菌(r.castenholzii)丙二酰辅酶a还原酶基因或编码阐述于seqidno:60中的氨基酸序列的赤杆菌属nap1丙二酰辅酶a还原酶基因。在其他实施例中，丙二酰辅酶a还原酶基因可以来自以下丙二酰辅酶a还原酶基因，该基因编码仅催化丙二酰辅酶a转化为丙二酸半醛的多肽。例如，丙二酰辅酶a还原酶基因可以来自编码阐述于seqidno:61中的氨基酸序列的勤奋金属球菌msed_0709基因或编码阐述于seqidno:62中的氨基酸序列的嗜热古菌(s.tokodaii)丙二酰辅酶a还原酶基因。

如在此使用，“丙酮酸脱氢酶基因”或“pdh基因”是指编码具有丙酮酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乙酰辅酶a。在某些实施例中，pdh基因可以来自酵母来源。例如，pdh基因可以来自酿酒酵母lat1、pda1、pdb1或lpd基因，这些基因分别编码阐述于seqidno:63-66中的氨基酸序列。在其他实施例中，pdh基因可以来自细菌来源。例如，pdh基因可以来自大肠杆菌菌株k12亚株mg1655acee、acef或lpd基因，这些基因分别编码阐述于seqidno:67-69中的氨基酸序列，或枯草芽孢杆菌pdha、pdhb、pdhc或pdhd基因，这些基因分别编码阐述于seqidno:70-73中的氨基酸序列。

如在此使用，“乙酰辅酶a羧化酶基因”或“acc基因”是指编码具有乙酰辅酶a羧化酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化乙酰辅酶a转化为丙二酰辅酶a。具有乙酰辅酶a羧化酶活性的酶被分类为ec6.4.1.2。在某些实施例中，乙酰辅酶a羧化酶基因可以来自酵母来源。例如，乙酰辅酶a羧化酶基因可以来自酿酒酵母acc1基因，该基因编码阐述于seqidno:74中的氨基酸序列。在其他实施例中，乙酰辅酶a羧化酶基因可以来自细菌来源。例如，乙酰辅酶a羧化酶基因可以来自分别编码阐述于seqidno:75-78中的氨基酸序列的大肠杆菌acca、accb、accc或accd基因或分别编码阐述于seqidno:79-82中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌acca、accb、accc或accd基因。

如在此使用，“丙氨酸脱氢酶基因”是指编码具有丙氨酸脱氢酶基因活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸nad依赖性还原氨化为丙氨酸。具有丙氨酸脱氢酶活性的酶被分类为ec1.4.1.1。在某些实施例中，丙氨酸脱氢酶基因可以来自细菌来源。例如，丙氨酸脱氢酶基因可以来自枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶基因，该枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶基因编码阐述于seqidno:83中的氨基酸序列。

如在此使用，“丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因”是指编码具有丙酮酸/丙氨酸转氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸和l-谷氨酸转化为丙氨酸和2-氧化戊二酸。在某些实施例中，丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因来自酵母来源。例如，丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因可以来自编码阐述于seqidno:84中的氨基酸序列的粟酒裂殖酵母丙酮酸/丙氨酸转氨酶基因或编码阐述于seqidno:85中的氨基酸序列的酿酒酵母alt2基因。

如在此使用，“丙氨酸2,3氨基变位酶基因”或“aam基因”是指编码具有丙氨酸2,3氨基变位酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙氨酸转化为β-丙氨酸。已知丙氨酸2,3氨基变位酶活性不天然地发生。因此，可通过将一个或多个突变掺入天然来源基因中而得到丙氨酸2,3氨基变位酶基因，该天然来源基因编码具有类似活性(例如赖氨酸2,3氨基变位酶活性)的多肽(参见例如，美国专利7,309,597)。在某些实施例中，该天然来源基因可以是编码阐述于seqidno:86中的氨基酸序列的枯草芽孢杆菌赖氨酸2,3氨基变位酶基因、编码阐述于seqidno:87中的氨基酸序列的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2,3氨基变位酶基因或编码阐述于seqidno:88中的氨基酸序列的核梭杆菌(f.nucleatum)(atcc-10953)赖氨酸2,3氨基变位酶基因。

如在此使用，“辅酶a转移酶基因”是指编码具有辅酶a转移酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶a和/或催化乳酸转化为乳酰辅酶a的能力。在某些实施例中，辅酶a转移酶基因可以来自酵母来源。在其他实施例中，辅酶a转移酶基因可以来自细菌来源。例如，辅酶a转移酶基因可以来自埃氏巨球形菌辅酶a转移酶基因，该埃氏巨球形菌辅酶a转移酶基因编码阐述于seqidno:89中的氨基酸序列。

如在此使用，“辅酶a合成酶基因”是指编码具有辅酶a合成酶活性的多肽的任何基因。在一个实例中，这一活性包括催化β-丙氨酸转化为β-丙氨酰辅酶a的能力。在另一个实例中，这一活性包括催化乳酸转化为乳酰辅酶a的能力。在某些实施例中，辅酶a合成酶基因可以来自酵母来源。例如，辅酶a合成酶基因可以来自酿酒酵母辅酶a合成酶基因。在其他实施例中，辅酶a合成酶基因可以来自细菌来源。例如，辅酶a合成酶基因可以来自大肠杆菌辅酶a合成酶、球形红假单胞菌或肠道沙门菌辅酶a合成酶基因。

如在此使用，“β-丙氨酰辅酶a解氨酶基因”是指编码具有β-丙氨酰辅酶a解氨酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化β-丙氨酰辅酶a转化为丙烯酰辅酶a。在某些实施例中，β-丙氨酰辅酶a解氨酶基因可以来自细菌来源，例如丙酸杆菌(c.propionicum)β-丙氨酰辅酶a解氨酶基因，该基因编码阐述于seqidno:90中的氨基酸序列。

如在此使用，“3-hp辅酶a脱水酶基因”或“丙烯酰辅酶a水合酶基因”是指编码具有3-hp辅酶a脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙烯酰辅酶a转化为3-hp辅酶a。具有3-hp辅酶a脱水酶活性的酶被分类为ec4.2.1.116。在某些实施例中，3-hp辅酶a脱水酶基因可以来自酵母或真菌来源，例如大豆疫霉菌(p.sojae)3-hp辅酶a脱水酶基因，该基因编码阐述于seqidno:91中的氨基酸序列。在其他实施例中，3-hp辅酶a脱水酶基因可以来自细菌来源。例如，3-hp辅酶a脱水酶基因可以来自编码阐述于seqidno:92中的氨基酸序列的橙色绿屈挠菌3-hp辅酶a脱水酶基因、编码阐述于seqidno:93中的氨基酸序列的深红红螺菌(r.rubrum)3-hp辅酶a脱水酶基因或编码阐述于seqidno:94中的氨基酸序列的有蒴红螺菌(r.capsulates)3-hp辅酶a脱水酶基因。在仍其他实施例中，3-hp辅酶a脱水酶基因可以来自哺乳动物来源。例如，3-hp辅酶a脱水酶基因可以来自智人-hp辅酶a脱水酶基因，该智人-hp辅酶a脱水酶基因编码阐述于seqidno:95中的氨基酸序列。

如在此使用，“3-hp辅酶a水解酶基因”是指编码具有3-hp辅酶a水解酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化3-hp辅酶a转化为3-hp。在某些实施例中，3-hp辅酶a水解酶基因可以来自酵母或真菌来源。在其他实施例中，3-hp辅酶a水解酶基因可以来自细菌来源。

如在此使用，“3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因”是指编码具有3-羟基异丁酰辅酶a水解酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化3-hp辅酶a转化为3-hp的能力。在某些实施例中，3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因可以来自细菌来源，例如编码阐述于seqidno:96中的氨基酸序列的荧光假单胞菌3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因或编码阐述于seqidno:97中的氨基酸序列的蜡状芽孢杆菌3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因。在其他实施例中，3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因可以来自哺乳动物来源，例如智人3-羟基异丁酰辅酶a水解酶基因，该基因编码阐述于seqidno:98中的氨基酸序列。

如在此使用，“乳酸脱氢酶基因”或“ldh基因”是指编码具有乳酸脱氢酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化丙酮酸转化为乳酸。在某些实施例中，ldh基因可以来自真菌、细菌或哺乳动物来源。

如在此使用，“乳酰辅酶a脱水酶基因”是指编码具有乳酰辅酶a脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化乳酰辅酶a转化为丙烯酰辅酶a。在某些实施例中，乳酰辅酶a脱水酶基因可以来自细菌来源。例如，乳酰辅酶a脱水酶基因可以来自埃氏巨球形菌乳酰辅酶a脱水酶e1、eiia或eiib亚单位基因，这些基因编码阐述于seqidno:99-101中的氨基酸序列。

如在此使用，“醛脱氢酶基因”是指编码具有醛脱氢酶活性的多肽的任何基因，在一个实例中，该活性包括催化3-hpa转化为3-hp的能力(反之亦然)。在某些实施例中，醛脱氢酶基因可以来自酵母来源，例如编码阐述于seqidno:102中的氨基酸序列的酿酒酵母醛脱氢酶基因或编码阐述于seqidno:122、124或126中的氨基酸序列的东方伊萨酵母醛脱氢酶基因。在其他实施例中，醛脱氢酶基因可以来自细菌来源，例如编码阐述于seqidno:103中的氨基酸序列的大肠杆菌aldh基因或编码阐述于seqidno:104中的氨基酸序列的肺炎克雷伯菌醛脱氢酶基因。

如在此使用，“甘油脱水酶基因”是指编码具有甘油脱水酶活性的多肽的任何基因，意味着能够催化甘油转化为3-hpa。在某些实施例中，甘油脱水酶基因可以来自细菌来源，例如肺炎克雷伯菌或弗氏柠檬酸杆菌甘油脱水酶基因。

可以使用本领域已知的方法或如在此描述检测所选主动3-hp途径的酶及其活性。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。参见，例如萨拉布鲁克(sambrook)等人，分子克隆实验指南(molecularcloning:alaboratorymanual)，第三版，冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory)，纽约(2001)；奥苏贝尔(ausubel)等人，《当前分子生物学》(currentprotocolsinmolecularbiology)，约翰威利父子公司(johnwileyandsons)，巴尔的摩，马里兰州(1999)；以及哈奈(hanai)等人，《应用及环境微生物学》(appl.environ.microbiol.)73:7814-7818(2007))。

宿主、表达载体与核酸构建体

在此所述的重组细胞可以选自能够具有主动3-hp途径的任何宿主细胞。本领域的普通技术人员应该理解，遗传改变(包括在此示例的代谢修饰)可以参考适合的宿主生物及其相应的代谢反应或用于希望的遗传材料(例如希望的代谢途径的基因)的适合的来源生物加以描述。然而，考虑到多种多样的生物的全基因组测序以及基因组学领域中的较高水平的技能，本领域的普通技术人员可以将在此提供的教导和指导应用于其他生物中。例如，可以通过掺入相同的或来自不同于参考物种的物种的类似编码核酸而容易地将在此示例的代谢改变应用于其他物种中。

该重组宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将dna引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(chang)和科恩(cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(mol.gen.genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(young)和斯皮宰曾(spizizen)，1961，细菌学杂志(j.bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(davidoff-abelson)，1971，分子生物学杂志(j.mol.biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(shigekawa)和道尔(dower)，1988，生物技术(biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(koehler)和索恩(thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将dna引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(hanahan)，1983，分子生物学杂志(j.mol.biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(dower)等人，1988，核酸研究(nucleicacidsres.)16:6127-6145)。将dna引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(gong)等人，2004，叶线形微生物学(foliamicrobiol.)(布拉格(praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(mazodier)等人，1989，细菌学杂志(j.bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)98:6289-6294)。将dna引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(choi)等人，2006，微生物学方法杂志(j.microbiol.methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(pinedo)和斯梅茨(smets)，2005，应用与环境微生物学(appl.environ.microbiol.)71:51-57)。将dna引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(perry)和藏满(kuramitsu)，1981，感染与免疫(infect.immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(catt)和乔力克(jollick)，1991，微生物学(microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(appl.environ.microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(clewell)，1981，微生物学评论(microbiol.rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将dna引入宿主细胞的任何方法。

该重组宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(hawksworth)等人定义，引自：安斯沃斯(ainsworth)和比斯比(bisby)的真菌大词典(dictionaryofthefungi)，第8版，1995，国际cab，大学出版社(universitypress)，剑桥(cambridge)，英国)。

在一个实施例中，该宿主细胞是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(fungiimperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，出于在此描述的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(biologyandactivitiesofyeast)(斯金纳(skinner)，f.a.，帕斯莫尔(passmore)，s.m.和达文波特(davenport)，r.r.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9)，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如萨纳瑞西斯假丝酵母、甲醇山梨糖假丝酵母、嗜酒假丝酵母、东方伊萨酵母、乳酸克鲁弗酵母、马克斯克鲁弗酵母、发酵毕赤酵母、格雷弗密斯毕赤酵母(pichiagaleiformis)、膜醭毕赤酵母(pichiamembranifaciens)、沙漠毕赤酵母(pichiadeserticola)、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、布拉迪酵母(saccharomycesbulderi)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、解脂耶氏酵母细胞。

在某些实施例中，通过将一个或多个遗传修饰掺入克拉布特里阴性宿主酵母细胞中产生在此提供的修饰的酵母细胞。在这些实施例的某些实施例中，该宿主酵母细胞属于伊萨酵母属、假丝酵母属或酵母属，并且在这些实施例的某些实施例中，该宿主细胞属于东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母或酵母属进化枝。在这些实施例的某些实施例中，该宿主细胞是东方伊萨酵母或郎比可假丝酵母(c.lambica)或布拉迪酵母(s.bulderi)。在某些实施例中，这些酵母细胞是东方伊萨酵母cnb1酵母细胞(如描述于wo2012/074818中，将其内容通过引用结合在此)。cnb1细胞包括描述于wo2012/074818中的cnb1细胞和源自其中所述的cnb1细胞的任何细胞。

该酵母宿主细胞可以来自一个细胞或被工程化，这样使得该细胞已经被遗传修饰为产生较高的乳酸滴度，对酸性ph展现出增加的耐受性，对乙醇或丙醇展现出增加的耐受性和/或展示出发酵戊糖的增加的能力(然而，在一些实施例中，该酵母细胞不能发酵戊糖)。示例性遗传修饰的酵母细胞描述于wo00/71738、wo03/049525、wo03/102201、wo03/102152、wo02/42471、wo2007/032792、wo2007/106524、wo2007/117282中，将其内容相对于所述细胞通过引用结合在此。将描述于前述申请中的任何酵母细胞的修饰与如在此描述的主动3-hp途径一起考虑。

该酵母宿主细胞可以是克拉布特里(crabtree)阳性表型或克拉布特里阴性表型。克拉布特里阴性生物由被诱导为增加的发酵性状态的能力表征。天然存在的生物和重组生物两者都可以被表征为克拉布特里阴性的。将克拉布特里效应定义为当在高浓度的葡萄糖(例如>5mm葡萄糖)的存在下在需氧条件下培养微生物时，该微生物中的耗氧抑制。不论氧利用率如何，克拉布特里阳性生物在葡萄糖的存在下继续发酵(而非呼吸)，而克拉布特里阴性生物未展示出葡萄糖介导的耗氧抑制。这一特征对于有机产品合成而言是有用的，因为它允许细胞在较高的底物浓度下生长，但保留氧化磷酸化的有益的高能作用。在一个方面中，该酵母具有克拉布特里阴性表型。

在某些实施例中，在此提供的酵母细胞是“3-hp耐受酵母细胞”，如描述于us2012/0135481中。在这些实施例的某些实施例中，这些酵母细胞能以其天然形式展现出3-hp耐受性。在其他实施例中，在引入与主动3-hp途径相关的遗传修饰前、中或后，这些细胞可以已经经历突变和/或选择(例如，恒化器选择或重复的系列传代培养)，这样使得这些突变的和/或选择的细胞具有比同一物种的野生型细胞对3-hp的更高程度的耐受性。例如，在一些实施例中，在用一个或多个异源3-hp途径基因遗传修饰之前或之后，这些细胞已经在3-hp或乳酸的存在下经历了突变和/或选择。在某些实施例中，可以在以其天然形式展示出3-hp抗性的细胞上进行突变和/或选择。可以在不同水平的3-hp的存在下，针对糖消耗以及其他特征对经历突变和/或选择的细胞进行测试，以便确定它们作为用于生产3-hp的工业化宿主的可能性。除了3-hp耐受性以外，在此提供的酵母细胞可以经历用于抵抗一种或多种另外的有机酸(例如，乳酸)或抵抗其他发酵产物、副产物或培养基组分的突变和/或选择。可以使用本领域熟知的方法完成选择，例如对3-hp或对其他化合物的耐受性的选择(例如，如在us2012/0135481中描述的)。

在一个实施例中，该宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门(如由霍克斯沃思(hawksworth)等人，1995，同上所定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(coprinuscinereus)、毛革盖菌(coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(phlebiaradiata)、刺芹侧耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(trametesvillosa)、变色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述在ep238023；约尔顿(yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)81:1470-1474；和克里斯滕森(christensen)等人，1988，生物技术(bio/technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法在马拉迪耶(malardier)等人，1989，基因(gene)78:147-156和wo96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(becker)和瓜伦特(guarente)，在阿贝尔森(abelson)，j.n.和西蒙(simon)，m.i.编，酵母遗传学与分子生物学指南(guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology)，酶学方法(guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology,methodsinenzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(academicpress,inc.)，纽约；伊藤(ito)等人，1983，细菌学杂志(j.bacteriol.)153:163；以及亨内恩(hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)75:1920或如在此所述的。

对于3-hp生产而言的理想细胞能够在较低的ph水平下生长。在较低的ph下进行发酵的能力降低了下游的回收成本，从而使得生产更经济。因此，在某些实施例中，该宿主细胞能够在较低的ph水平下(例如，在低于7、6、5、4或3的ph水平下)生长。

除3-hp耐受性和/或较低ph生长能力之外，适合的宿主细胞可以具有一种或多种有利的特征。例如，可以基于糖分解速度、比生长速率、耐热性、对生物质水解产物抑制剂的耐受性、整体流程稳健性等对展现出3-hp耐受性的潜在的宿主细胞进行进一步选择。可以在进行与3-hp途径相关的任何遗传修饰之前评估这些标准，或可以在已经发现一种或多种此类修饰之后对其进行评估。

在一些方面中，该细胞包括在此描述的主动3-hp途径的一种或多种(例如，两种、若干种)异源多核苷酸(例如，一种编码ppc的异源多核苷酸；一种编码pyc的异源多核苷酸；一种编码aat的异源多核苷酸；一种编码adc的异源多核苷酸；一种编码baat或gabt的异源多核苷酸；和/或一种编码3-hpdh的异源多核苷酸)，其中当在相同条件下培养时，与没有主动3-hp途径的这一种或多种异源多核苷酸的宿主细胞相比，该细胞分泌(和/或能够分泌)增加水平的3-hp。在一些方面中，当在相同条件下培养时，与没有主动3-hp途径的这一种或多种异源多核苷酸的宿主细胞相比，该重组细胞分泌和/或能够分泌增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的水平的3-hp。适合的培养条件的实例在下面进行了描述并且基于在此的教导，对本领域的普通技术人员而言将是容易地显而易见的。

在这些方面的任何方面中，该重组细胞产生(和/或能够产生)产量为理论产量的至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的3-hp。

在这些方面的任何方面中，该重组细胞具有大于约0.1g/l/小时的3-hp体积生产力，例如大于约0.2g/l/小时、0.5g/l/小时、0.6g/l/小时、0.7g/l/小时、0.8g/l/小时、0.9g/l/小时、1.0g/l/小时、1.1g/l/小时、1.2g/l/小时、1.3g/l/小时、1.5g/l/小时、1.75g/l/小时、2.0g/l/小时、2.25g/l/小时、2.5g/l/小时、2.75g/l/小时、3.0g/l/小时、3.25g/l/小时、3.5g/l/小时、3.75g/l/小时、或4.0g/l/小时；或在约0.1g/l/小时和约2.0g/l/小时之间，例如在约0.3g/l/小时和约1.7g/l/小时之间、约0.5g/l/小时和约1.5g/l/小时之间、约0.7g/l/小时和约1.3g/l/小时之间、约0.8g/l/小时和约1.2g/l/小时之间、或约0.9g/l/小时和约1.1g/l/小时之间；或在约0.1g/l/小时和约4.0g/l/小时之间，例如在约0.5g/l/小时和约3.75g/l/小时之间、约1.0g/l/小时之和约3.5g/l/小时之间、约2.0g/l/小时和约3.25g/l/小时之间。

在这些方面的任何方面中，当在相同条件下培养时，与没有编码3-hpdh的异源多核苷酸的细胞相比，该重组细胞产生(和/或能够产生)更多量的3-hp。在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与没有编码3-hpdh的异源多核苷酸的细胞相比，该细胞产生(和/或能够产生)多至少10％(例如，多至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％、或至少500％)的3-hp。

在这些方面的任何方面中，当在相同条件下培养时，与第二重组细胞相比，该重组细胞产生(和/或能够产生)更大量(例如多至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、至少200％、至少300％、或至少500％)的3-hp；其中该第二细胞与该重组细胞相同，其条件是该第二细胞编码seqidno:26的3-hpdh以代替该重组细胞3-hpdh。

在一些实施例中，当在相同条件下培养时，与没有编码3-hpdh的异源多核苷酸的宿主细胞相比，这些重组细胞具有增加的3-hpdh活性水平。在其他方面中，当在相同条件下培养时，与不具有编码3-hpdh的异源多核苷酸的宿主细胞相比，这些细胞具有增加至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的3-hpdh活性水平。

可以使用本领域熟知的方法，在适合产生主动3-hp途径的一种或多种多肽的营养培养基中培养这些重组细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离所希望的多肽的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。如在此所述，该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳源和氮源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心目录中)来制备，或可以从可商购的成分制备。

在此描述的重组细胞还可以经受适应进化，以进一步增加3-hp生物合成，包括在接近理论最大生长的条件下。

在此描述的重组细胞可以进一步包含脂肪酶或酯酶活性，例如归因于表达一种编码脂肪酶或酯酶(ec3.1.1.-)的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产3-hp的酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或2-乙基己基3-羟基丙酸酯。这些细胞可以进一步包含酯酶活性，例如归因于表达一种编码酯酶的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产聚合的3-hp。这些细胞可以进一步包含醇脱氢酶(ec1.1.1.1)活性、醛脱氢酶(ec1.2.1.-)活性或两者，例如归因于表达一种编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或两者的异源多核苷酸。可以使用此类细胞生产1,3-丙二醇。

在此描述的重组细胞可以利用以下表达载体，这些表达载体包括一个或多个(例如，两个、若干个)异源3-hp途径基因的编码序列，这些编码序列被连接至一个或多个控制序列，这一个或多个控制序列指导在与这一个或多个控制序列相容的条件下在适合的细胞中的表达。可以在任何于此描述的细胞和方法中使用此类表达载体。在此描述的多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供希望的多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

可以将一个构建体或载体(或多个构建体或载体)引入细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述；该构建体或载体(或这些构建体或载体)包括一个或多个(例如，两个、若干个)异源3-hp途径基因。

各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，两个、若干个)合宜的限制性位点以允许在此类位点插入或取代该多核苷酸。可替代地，可以通过将这种或这些多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达这种或这些多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可便利地经受重组dna程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

在一个方面中，该重组细胞包含独立载体中的异源多核苷酸。在一个方面中，该重组细胞包含多个各自包含在独立载体中的异源多核苷酸。在一个方面中，该重组细胞包含至少两个包含在单个载体中的异源多核苷酸。在一个方面中，该重组细胞包含至少三个包含在单个载体上的异源多核苷酸。在一个方面中，该重组细胞包含至少四个包含在单个载体上的异源多核苷酸。在一个方面中，该重组细胞的所有异源多核苷酸都包含在单个载体上。编码蛋白复合体的异聚亚基的多核苷酸可以被包含在单一载体的单一异源多核苷酸中或可替代地，被包含在分开的载体的分开的异源多核苷酸中。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到细胞的基因组中的总dna)或转座子。

该表达载体可以包含任何适合的启动子序列，该启动子序列可被细胞识别，以表达3-hpdh基因或在此描述的任何3-hp途径基因。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。该启动子可以是在选择的细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

在此描述的每种异源多核苷酸都可以被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。例如，在一个方面中，编码3-hpdh的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。在另一个方面中，编码在此描述的3-hp途径的多肽(例如，ppc、pyc、aat、adc、baat、gabt、或3-hpdh)的异源多核苷酸被可操作地连接至对于该多核苷酸而言外源的启动子上。这些启动子可以与所选的天然启动子相同或与其具有较高水平的序列一致性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(阿盖塞(agaisse)和勒尔克吕(lereclus)，1994，分子微生物学(molecularmicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(egon)等人，1988，基因(gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(daga)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(villa-kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(deboer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(gilbert)等人，1980，科学美国人(scientificamerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在wo99/43835中。

用于指导核酸构建体在酵母细胞中的转录的适合的启动子的实例包括但不限于获得自以下各项的基因的启动子：烯醇酶(例如，酿酒酵母烯醇酶或东方伊萨酵母烯醇酶(eno1))、半乳糖激酶(例如，酿酒酵母半乳糖激酶或东方伊萨酵母半乳糖激酶(gal1))、醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh1、adh2/gap))、磷酸甘油醛异构酶(例如，酿酒酵母磷酸甘油醛异构酶或东方伊萨酵母磷酸甘油醛异构酶(tpi))、金属硫蛋白(例如，酿酒酵母金属硫蛋白或东方伊萨酵母金属硫蛋白(cup1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶(pgk))、pdc1、木糖还原酶(xr)、木糖醇脱氢酶(xdh)、l-(+)-乳酸-细胞色素c氧化还原酶(cyb2)、翻译延长因子-1(tef1)、翻译延长因子-2(tef2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、和乳清酸核苷5'-磷酸脱羧酶(ura3)基因。罗马诺斯(romanos)等人，1992，酵母(yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(fusariumvenenatumdaria)(wo00/56900)、镶片镰孢quinn(fusariumvenenatumquinn)(wo00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。该终止子序列被可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。可以使用在所选的酵母细胞中具有功能的任何终止子。该终止子可以与所选的天然终止子相同或与其具有较高水平的序列一致性(例如，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)。在某些实施例中，3-hp途径基因被连接至一种终止子，该终止子包括对于该宿主细胞而言天然的天然gal10基因的功能部分或与天然gal10终止子具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列一致性的序列。

细菌宿主细胞的合适终止子可以从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)、和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)。

酵母宿主细胞的适合的终止子可以获得自以下各项的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶)、细胞色素c(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母细胞色素(cyc1))、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd))、pdc1、xr、xdh、转醛醇酶(tal)、转酮醇酶(tkl)、核糖5-磷酸-酮醇异构酶(rki)、cyb2、以及半乳糖基因家族(尤其是gal10终止子)。在罗马诺斯(romanos)等人，1992，上文中描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

丝状真菌宿主细胞的合适终止子可以从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mrna稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(化(hue)等人，1995，细菌学杂志(journalofbacteriology)177:3465-3471)。

控制序列也可以是适合的前导子序列，其中转录时，所述前导子序列是对由宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区。该前导子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的酵母细胞中具有功能的任何前导子序列。

酵母宿主细胞的适合的前导子获得自以下各项的基因：烯醇酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母烯醇酶(eno-1))、3-磷酸甘油酸激酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母3-磷酸甘油酸激酶)、α-因子(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母α-因子)、以及醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(例如，酿酒酵母或东方伊萨酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh2/gap))。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mrna的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。有用于酵母细胞的聚腺苷酸化序列由郭(guo)和谢尔曼(sherman)，1995，分子细胞生物学(mol.cellularbiol.)15:5983-5990描述。用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

这些载体可以包含一个或多个(例如，两个、若干个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1、以及ura3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌bar基因。

这些载体可以包含一个或多个(例如，两个、若干个)允许将该载体整合进宿主细胞的基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。潜在整合位点包括本领域所描述的那些(例如，参见us2012/0135481)。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的酵母细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1和cen3的组合、以及ars4和cen6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(格姆斯(gems)等人，1991，基因(gene)98:61-67；卡伦(cullen)等人，1987，核酸研究(nucleicacidsres.)15:9163-9175；wo00/24883)。可以根据wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将在此描述的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到酵母细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建在此描述的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(sambrook)等人，1989，见上文)。

本领域已知的用于制备包括一个或多个3-hp途径基因的重组细胞的另外的程序和技术描述于例如wo2012/074818中，将其内容通过引用结合在此。

基因破坏

该重组细胞还可以包括一个或多个(例如，两个、若干个)基因破坏，以例如将糖代谢从不希望的产物转移至3-hp。在一些方面中，当在相同条件下培养时，与没有这一个或多个破坏的细胞相比，这些重组宿主细胞产生更大量的3-hp。在一些方面中，使这些被破坏的内源基因中的一个或多个失活。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包括编码在乙醇生产中涉及的酶的一个或多个内源基因的破坏，包括例如丙酮酸脱羧酶(pdc，将丙酮酸转化为乙醛)和/或醇脱氢酶(adh，将乙醛转化为乙醇)基因。这些修饰降低了细胞生产乙醇的能力，从而使3-hp生产最大化。然而，在某些实施例中，在此提供的重组细胞可以被工程化为同时生产3-hp和乙醇。在那些实施例中，优选地不破坏编码在乙醇发酵中涉及的酶的内源基因，并且在某些实施例中，这些细胞可以包括一个或多个增加乙醇产生的异源基因。

在一些实施例中，这些重组细胞可以包括对编码pdc的内源基因的破坏，该pdc与seqidno:154具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，该内源基因编码具有以下氨基酸序列的pdc，该氨基酸序列包括seqidno:154或由其组成。在一些实施例中，编码pdc的内源基因的编码序列与seqidno:153具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，编码pdc的内源基因的编码序列包括seqidno:153或由其组成。在一些实施例中，使编码pdc的内源基因失活。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在生产替代发酵产物(例如甘油)或其他副产物(例如乙酸或二醇)中涉及的酶。例如，在此提供的细胞可以包括以下一个或多个的基因中的破坏：甘油3-磷酸脱氢酶(gpd，催化二羟丙酮磷酸反应为甘油3-磷酸)，甘油3-磷酸酶(gpp，催化甘油-3磷酸转化为甘油)，甘油激酶(催化甘油3-磷酸转化为甘油)，二羟丙酮激酶(催化二羟丙酮磷酸转化为二羟丙酮)，甘油脱氢酶(催化二羟丙酮转化为甘油)，醛脱氢酶(ald，例如，将乙醛转化为乙酸或将3-hp转化为3-hpa)、以及丁二醇脱氢酶(催化丁二醇转化为乙偶姻，反之亦然)。

在一些实施例中，这些重组细胞可以包括对编码gpd的内源基因的破坏，该pdc与seqidno:156具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，该内源基因编码具有以下氨基酸序列的gpd，该氨基酸序列包括seqidno:156或由其组成。在一些实施例中，编码gpd的内源基因的编码序列与seqidno:155具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，编码gpd的内源基因的编码序列包括seqidno:155或由其组成。在一些实施例中，使编码gpd的内源基因失活。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码催化3-hp途径中的逆反应的酶，包括例如pep羧激酶(pck)、具有oaa脱羧酶活性的酶或cyb2a或cyb2b(催化乳酸转化为丙酮酸)。pck催化pep转化为oaa，反之亦然，但是对oaa至pep的反应展现出偏好。为了减少oaa至pep的转化，可以破坏天然pck基因的一个或多个拷贝。在某些实施例中，其中的一个或多个天然pck基因已经被破坏的细胞可以表达一个或多个异源pck基因，这一个或多个异源pck基因已被突变为编码以下多肽，该多肽有利于将pep转化为oaa。oaa脱羧酶催化oaa转化为丙酮酸。已经鉴定了具有oaa脱羧酶活性的酶，例如由大肠杆菌中的恩纳-杜道夫醛缩酶(entner-doudoroffaldolase，eda)基因编码的酶以及酵母和真菌中的苹果酸酶(mae)。为了减少oaa脱羧酶活性，可以破坏编码具有oaa脱羧酶活性的酶的天然基因的一个或多个拷贝。在某些实施例中，其中的一个或多个天然oaa脱羧基因已经被破坏的细胞可以表达一个或多个异源oaa脱羧基因，这一个或多个异源oaa脱羧基因已被突变为编码以下多肽，该多肽催化丙酮酸转化为oaa。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包含对选自dse2、scw11、eaf3、sed1和sam2的一种或多种基因的破坏(参见，例如铃木(suzuki)等人，生物科学与生物工程杂志(j.biosci.bioeng.)2013,115,467-474；以及达托(dato)等人，微生物细胞工厂(microbialcellfactories)，2014,13,147)。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码在与3-hp途径产物或中间体进行的不希望的反应中涉及的酶。此类基因的实例包括编码将3-hp转化为3-hp的醛的酶的那些基因，已知这些醛对某些细胞而言是有毒的。

在某些实施例中，在此提供的重组细胞包括一个或多个内源基因的破坏，这一个或多个内源基因编码对3-hp途径具有中性作用的酶，包括例如gal6(将半乳糖转化为葡萄糖的gal系统的负调节物)。中性基因的破坏允许在不影响天然途径的情况下插入一个或多个异源基因。

还可以使用建模设计基因破坏,这些基因破坏另外地优化途径的利用(参见，例如，u.s.2002/0012939、u.s.2003/0224363、u.s.2004/0029149、u.s.2004/0072723、u.s.2003/0059792、u.s.2002/0168654、u.s.2004/0009466、以及美国专利7,127,379)。建模分析允许可靠地预测将代谢移向更有效地生产3-hp对细胞生长的影响。用于鉴定并设计有利于生物合成希望的产物的代谢改变的一种示例性计算方法是optknock计算框架(optknockcomputationalframework)，伯加德(burgard)等人，2003，生物技术与生物工程(biotechnol.bioeng.)84:647-657。

可以使用本领域熟知的方法(包括在此描述的那些方法)构建包括基因破坏的重组细胞。可以破坏该基因的一部分，例如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样一种控制序列可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。

可以通过基因缺失技术来构建包括基因破坏的重组细胞，以消除或减少该基因的表达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除其表达。在此类方法中，使用已经构建为邻接地包含侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。

还可以通过引入、取代和/或除去该基因中的或为其转录或翻译所需的其控制序列中的一个或多个(例如，两个、若干个)核苷酸来构建包括基因破坏的重组细胞。例如，可以插入或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本领域已知的方法，通过定点诱变或pcr产生的诱变完成这样的修饰。参见，例如波特斯坦(botstein)和绍特勒(shortle)，1985，科学(science)229:4719；洛(lo)等人，1985，美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)81:2285；樋口(higuchi)等人，1988，核酸研究(nucleicacidsres)16:7351；岛田(shimada)，1996，分子生物学方法(meth.mol.biol.)57:157；霍(ho)等人，1989，基因(gene)77:61；霍尔顿(horton)等人，1989，基因(gene)77:61；以及萨卡尔(sarkar)和松梅尔(sommer)，1990，生物技术(biotechniques)8:404。

还可以通过将破坏性核酸构建体插入该基因中而构建包括基因破坏的重组细胞，该破坏性核酸构建体包括与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体dna。这样的一种基因破坏可以消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5’和3’区的选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定包含破坏的基因的转化株。

还可以通过基因转化过程构建包括基因破坏的重组细胞(参见，例如，伊格莱西亚斯(iglesias)和特劳特勒(trautner)，1983，分子普通遗传学(moleculargeneralgenetics)189:73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进重组菌株中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包括一种用于选择含有缺陷基因的转化株的标记可以是令人希望的。

可以使用本领域熟知的方法(包括但不限于化学诱变)，通过随机或特异诱变进一步构建包括基因破坏的重组细胞(参见，例如，霍普伍德(hopwood)，微生物学方法中的突变体分离(theisolationofmutantsinmethodsinmicrobiology(j.r.诺里斯(norris)和d.w.里本(ribbons)，编辑))第363-433页，学术出版社(academicpress)，纽约，1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变体菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的寡核苷酸或使dna序列经受pcr产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使用这些诱变方法的任何组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(uv)照射，羟胺，n-甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍(mnng)，n-甲基-n’-亚硝基胍(ntg)邻甲基羟胺，亚硝酸，乙基甲磺酸(ems)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的减少表达或无表达的突变体来进行的。

可以使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核苷酸序列来破坏所选的重组体菌株中的对应基因。

在一个方面中，重组细胞中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因包含侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入一个核酸片段，该核酸片段包括缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在反向选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，包含该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领域已知的其他方法。

生产3-hp以及相关化合物的方法

可以使用在此描述的重组细胞来生产3-hp。在一个方面中，是一种生产3-hp的方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞中的任一重组细胞(例如，包括主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，以生产3-hp；并且(b)回收3-hp。

可以使用本领域熟知的方法，在适合生产3-hp的营养培养基中培养包括主动3-hp途径的重组细胞。例如，可以通过在适合的发酵培养基中和在允许产生3-hp的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固态发酵)来培养这些细胞。

这些重组细胞可以在一种可发酵的培养基中产生3-hp，该可发酵培养基包括一种或多种(例如，两种、若干种)糖，这些糖是例如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的低聚糖。碳源可以是十二碳糖(例如蔗糖)、己糖(例如葡萄糖或果糖)、多糖或葡萄糖的其他聚合物、葡萄糖寡聚物(例如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖)、潘糖以及果糖寡聚物。如果该细胞被修饰为赋予发酵戊糖的能力，则该发酵培养基可以包括戊糖，例如木糖、木聚糖或木糖的其它寡聚物和/或阿拉伯糖。此类戊糖可以适合地是包含半纤维素的生物质的水解产物。在一些实施例中，该细胞不能发酵戊糖和/或该可发酵的培养基包括低于1％的戊糖。在一些情况下，该可发酵的培养基来自天然来源，例如甘蔗、淀粉、或纤维素；并且可以是通过酶水解(糖化作用)对这种来源进行预处理的结果。在一些方面中，该可发酵的培养基包括甘蔗汁。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心目录中)来制备，或可以从可商购的成分制备。

除了来自一种或多种(例如，两种、若干种)糖的适当的碳源之外，该可发酵的培养基可以包含本领域的普通技术人员已知的其他营养素或刺激物，例如大量营养素(如，氮源)以及微量营养素(如，维生素、矿物盐、以及金属辅因子)。在一些方面，碳源优先地可以补充有至少一种碳源，例如酵母提取物、n2、蛋白胨(例如，bactotm蛋白胨)、或大豆蛋白胨(例如，bactotm大豆蛋白胨)。维生素的非限制性实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、以及维生素a、维生素b、维生素c、维生素d和维生素e。矿物盐和金属辅因子的实例包括但不限于na、p、k、mg、s、ca、fe、zn、mn、co以及cu。

在一些实施例中，可以在化学成分确定的培养基中培养本发明的重组细胞。在一个实例中，该培养基包含大约5g/l硫酸铵，大约3g/l磷酸二氢钾，大约0.5g/l硫酸镁、痕量元素和维生素以及大约150g/l葡萄糖。在培养过程中可以允许ph自由变化，或必要的话，可以缓冲，以防止ph跌至预定的水平之下或升至预定的水平之上。在某些实施例中，用足够的细胞接种该发酵培养基，这些细胞是产生约1.0的od600的评估对象。除非另外明确指明，如在此使用，od600是指使用型号du600分光光度计(贝克曼库尔特公司(beckmancoulter))在600nm的波长下以1cm路长测量的光密度。

用于生产3-hp的方法的具体条件可以由本领域的普通技术人员根据在此的教导确定。在这些方法的一些方面中，将这些细胞培养约12小时至约216小时，例如约24小时至约144小时、或约36小时至约96小时。温度典型地在约26℃至约60℃之间，例如约34℃至约50℃。

视情况而定，可以在厌氧、基本上厌氧(微好氧)、或好氧条件下进行培养。简言之，厌氧的是指一种缺少氧气的环境，基本上厌氧的(微好氧的)是指一种其中氧气的浓度比空气低的环境，并且好氧是指一种其中氧气浓度大致等于或大于空气的氧气浓度的环境。基本上缺氧条件包括例如使得在培养基中的溶氧浓度保持在小于10％的饱和度的培养、分批发酵或连续发酵。基本上缺氧条件还包括使细胞在维持有小于1％氧气的气氛的密封室内的液体培养基中或固体琼脂上生长或静止。例如可以通过向培养物鼓吹n2/co2混合物或其他一种或多种适合的非氧气体来维持氧气的百分比。在一些实施例中，在缺氧条件或基本上缺氧条件下进行培养。

在一个实例中，在生产期过程中，发酵培养基中的细胞浓度典型地在约1至40，例如在从2至20、或从3至10克干细胞/升发酵培养基的范围内。希望的话，摄氧率(our)可以贯穿整个发酵变化作为过程控制(参见例如，wo03/102200)。在一些实施例中，在微好氧条件下培养在此提供的重组细胞，这些微好氧条件由从2至45mmol/l/hr，例如2至25、2至20、2至15、2至10、10至45、15至40、20至35或25至35mmol/l/hr的摄氧率表征。在某些实施例中，当在由从2至25mmol/l/hr的摄氧率表征的微好氧条件下培养时，在此提供的重组细胞表现尤其好。可以在生产期过程中缓冲培养基，这样使得将ph维持在约3.0至约7.0或从约4.0至约6.0的范围内。适合的缓冲剂是当酸形成时中和它的碱性材料，并且包括例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵等。通常，那些在常规的发酵过程中使用的缓冲剂在此也是适合的。

在利用缓冲发酵的那些实施例中，当酸性发酵产物形成时，可以将它们中和成对应的盐。在这些实施例中，回收酸包括再生游离酸。这可以通过以下方式完成：移除细胞并用强酸(例如硫酸)酸化发酵液。这导致形成盐副产物。例如，在将钙盐用作中和剂并且将硫酸用作酸化剂的情况下，将石膏产生为盐副产物。将这一副产物与发酵液分离，并且使用例如液液提取、蒸馏、吸收以及其他技术回收酸(参见例如，t.b.维克罗伊(vickroy)，综合生物技术(comprehensivebiotechnology)的第3卷，第38章(编辑m.武-杨(moo-young))，帕加马(pergamon)，牛津，1985；达塔(datta)等人，1995，fems微生物学评论(femsmicrobiol.rev.)，16:221-231；美国专利4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122以及wo93/00440)。

在其他实施例中，在培养过程中，可以允许发酵培养基的ph从处于或高于3-hp的pka的起始ph(典型地是4.5或更高，比如5.5、6.0或6.5)降至处于或低于酸发酵产物的pka，例如低于4.5或4.0，如在约1.5至约4.5的范围内、在从约2.0至约4.0的范围内或在从约2.0至约3.5的范围内。

在仍其他实施例中，可以通过在发酵过程之前或开始时，将发酵液的ph调节为处于或低于产物酸的pka而进行发酵，以产生该产物酸。之后，贯穿整个培养，可以将ph维持为处于或低于该产物酸的pka。在某些实施例中，可以将ph维持为低于4.5或4.0，例如在约1.5至约4.5的范围内、在约2.0至约4.0的范围内或在约2.0至约3.5的范围内。

在此描述的这些方法可以利用任何适合的发酵操作模式。例如，分批模式发酵可以与一个封闭系统一起使用，其中培养基和重组宿主细胞(在发酵的开始设置的)除了试剂(某些例如用于ph控制、泡沫控制、或过程支持所需的其他试剂)之外，没有另外的投入。在此描述的过程还可以在补料分批-模式或连续模式中利用，如上所提及。

可以在若干生物反应器构型中实践在此描述的这些方法，例如搅拌槽、鼓泡塔、气升式反应器以及本领域的普通技术人员已知的其他反应器。视情况而定，能以游离细胞培养或固定化细胞培养的方式执行这些方法。可以使用任何用于支持固定化细胞培养的材料，例如藻酸盐、纤维床、或菱形材料，例如温石棉、蒙脱石ksf和蒙脱石k-10。

在这些方法的一个方面中，生产的3-hp的滴度大于约5g/l，例如大于约10g/l、25g/l、50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l、160g/l、170g/l、180g/l、190g/l、200g/l、210g/l、225g/l、250g/l、275g/l、300g/l、325g/l、350g/l、400g/l或500g/l；或在约10g/l与约500g/l之间，例如约50g/l与约350g/l之间、约100g/l与约300g/l之间、约150g/l与约250g/l之间、约175g/l与约225g/l之间或约190g/l与约210g/l之间。在一个实施例中，以大于约0.01克/克碳水化合物的滴度生产3-hp，例如大于约0.02、0.05、0.75、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0克/克碳水化合物。

在这些方法的一个方面中，当在相同条件下培养时，与培养不具有编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组细胞相比，生产的3-hp的量多至少5％，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％或至少100％。

在于此提供的这些方法的某些实施例中，这些重组细胞产生相对较低水平的乙醇。在某些实施例中，可以按10％或更少的产量，优选按2％或更少的产量生产乙醇。在这些实施例的某些实施例中，产生的乙醇检测不出。然而，在其他实施例中，可以同时生产3-hp和乙醇。在这些实施例中，可以按大于10％、大于25％或大于50％的产量生产乙醇。

可以使用本领域已知的任何程序从发酵培养基中任选地回收3-hp，这些程序包括但不限于色谱法(例如，尺寸排阻色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法)、电泳程序、溶解度差异、渗透、蒸馏、提取(例如，液液提取)、渗透蒸发、萃取过滤、膜过滤、膜分离、反渗透或超滤。在一个方面中，从其他发酵材料中分离3-hp并通过蒸馏的常规方法加以纯化。因此，在一个方面中，该方法进一步包括通过蒸馏纯化回收的3-hp。

还可以通过上述程序(例如，色谱法、电泳程序、溶解度差异、蒸馏或提取)将杂质(污染物)化学转化为更易于从3-hp中除去的产物和/或通过将杂质直接化学转化为3-hp而纯化重组3-hp。例如，在一个方面中，该方法进一步包括通过使用本领域已知的化学技术将β-丙氨酸污染物转化为3-hp而纯化回收的3-hp。

在这些方法的一些方面中，在可任选地纯化之前和/或之后的重组3-hp制剂是基本上纯的。关于生产3-hp的方法，“基本上纯的”意指回收的制剂包含不多于15％的杂质，其中杂质意指除3-hp以外的化合物。在一种变体中，提供了一种基本上纯的制剂，其中该制剂包含至多25％杂质、或至多20％杂质、或至多10％杂质、或至多5％杂质、或至多3％杂质、或至多1％杂质、或至多0.5％杂质。

可以将使用在此披露的方法所生产的3-hp转化为其他有机化合物(例如，如us8,030,045和wo03/082795中所述，其内容通过引用并入本文)。例如，可以将3-hp氢化以形成1,3丙二醇(一种有价值的聚酯单体)。也可以使用在体外或在体内具有氧化还原酶活性的多肽从3-hp生产丙二醇(例如使用如上所述的一种或多种另外的酶活性)。可以使用任何方法氢化有机酸(例如3-hp)，例如用于氢化丁二酸和/或乳酸的那些方法。例如，可以使用金属催化剂氢化3-hp。因此，在一个方面中，是一种生产1,3-丙二醇的方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞(例如，包括主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，其中该重组细胞进一步包含氧化还原酶活性，以生产1,3-丙二醇；并且(b)回收1,3-丙二醇。在另一个方面中，是一种生产1,3-丙二醇的方法，包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞(例如，包含主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，以生产3-hp；(b)回收该3-hp；(c)在合适的条件下氢化3-hp，以生产1,3-丙二醇；并且(d)回收1,3-丙二醇。

3-hp还可以被转化为3-hp的酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或2-乙基己基3-羟基丙酸酯。在一个方面中，是一种生产3-hp酯的方法，包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞(例如，包含主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，其中该重组细胞还包含脂肪酶或酯酶活性，以生产3-hp酯；以及(b)回收该3-hp酯。在一个方面中，是一种生产3-hp酯的方法，该方法包括：(a)在适合的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞(例如，包括主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，以生产3-hp；(b)回收该3-hp；(c)在合适的条件下酯化该3-hp，以产生3-hp酯；以及(d)回收该3-hp酯。在此描述的重组宿主细胞也可用于使用本领域已知的技术在体外或体内产生聚合的3-hp(例如，周(zhou)等人，代谢工程(metab.eng.)2011,13(6),777-785；以及us8,030,045；其内容通过引用并入本文)。

可以将通过任何在此描述的方法生产的3-hp转化为丙烯酸。可以使用本领域已知的技术通过将3-hp化学脱水而产生丙烯酸，例如在催化剂(例如，固体氧化物脱水催化剂，如二氧化钛或氧化铝)的存在下加热。

在一个方面中，是生产丙烯酸或其盐的方法，该方法包括：(a)在合适的条件下，在培养基中培养在此描述的重组细胞(例如，包含主动3-hp途径和编码3-hpdh的异源多核苷酸的重组宿主细胞)，以生产3-hp；(b)回收该3-hp；(c)在适合的条件下，将该3-hp脱水，以生产丙烯酸或其盐；并且(d)回收该丙烯酸或其盐。

可以使用本领域已知的方法进行适合的测定,这些测定用于测试在此描述的生产方法和细胞的3-hp及其衍生物的产生。例如，可以通过多种方法(例如hplc(高效液相色谱)、gc-ms(气相色谱-质谱法)和lc-ms(液相色谱-质谱法))或使用本领域熟知的常规程序的其他适合的分析方法对终产物3-hp和中间体(例如，丙酮酸)以及其他有机化合物进行分析。还可以用培养上清液测试发酵液中的3-hp的释放。可以使用例如针对葡萄糖和醇类的折光率检测器、以及针对有机酸的uv检测器通过hplc(林(lin)等人，《生物技术与生物工程》(biotechnol.bioeng.)90:775-779(2005))、或使用本领域熟知的其他适合的测定和检测方法量化在发酵培养基中的副产物和残余的糖(例如，葡萄糖)。

可通过以下编号的段落进一步描述本发明：

[1]一种重组酵母细胞，包含主动3-hp途径和编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸，其中该异源多核苷酸：

(a)编码与seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201、或seqidno:203具有至少60％序列一致性的3-hpdh；

(b)包含在至少低严格条件下与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200、或seqidno:202的全长互补链杂交的编码序列；或

(c)包含与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200、或seqidno:202具有至少60％序列一致性的编码序列；

其中该细胞能够产生3-hp。

[2]如段落[1]所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸编码与seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201、或seqidno:203具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性的3-hpdh。

[3]如段落[1]或[2]所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸编码3-hpdh，该3-hpdh与seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201、或seqidno:203相差不多于十个氨基酸，例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于两个氨基酸、或相差一个氨基酸。

[4]如段落[1]所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸编码3-hpdh，该3-hpdh具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列包括seqidno:197、seqidno:199、seqidno:201、或seqidno:203或由其组成。

[5]如段落[1]-[4]中任一项所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸包含与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200、或seqidno:202具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的编码序列。

[6]如段落[1]所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸具有以下编码序列，该编码序列包含seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200、或seqidno:202或由其组成。

[7]如段落[1]-[6]中任一项所述的重组细胞，其中该异源多核苷酸包含以下编码序列，该编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与seqidno:196、seqidno:198、seqidno:200、或seqidno:202的全长互补链杂交。

[8]如段落[1]-[7]中任一项所述的重组细胞，其中该3-hpdh利用nad(h)辅因子。

[9]如段落[1]-[8]中任一项所述的重组细胞，其中与nadp(h)相比，该3-hpdh对该辅因子nad(h)具有增加的特异性(例如，与nadp(h)相比，针对nad(h)的大于2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、或1000倍的特异性)。

[10]如段落[1]-[9]中任一项所述的重组细胞，其中该主动3-hp途径通过丙二酸半醛中间体进行。

[11]如段落[1]-[10]中任一项所述的重组细胞，其中当在相同条件下培养时，与不具有编码3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的异源多核苷酸的细胞相比，该细胞产生更大量(例如，多至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、或至少200％)的3-hp。

[12]如段落[1]-[11]中任一项所述的重组细胞，其中当在相同条件下培养时，与第二重组细胞相比，该细胞产生更大量(例如，多至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少75％、至少100％、或至少200％)的3-hp；其中该第二细胞与该酵母细胞相同，其条件是该第二细胞编码seqidno:26的3-hpdh以代替酵母细胞3-hpdh。

[13]如段落[1]-[12]中任一项所述的重组细胞，其中该细胞包含编码天冬氨酸1-脱羧酶(adc)的异源多核苷酸。

[14]如段落[1]-[13]中任一项所述的重组细胞，其中该细胞是克拉布特里阴性或克拉布特里阳性的。

[15]如段落[1]-[14]中任一项所述的重组细胞，其中该细胞属于选自以下的属：伊萨酵母属、假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、有孢圆酵母属、接合酵母属和酵母属。

[16]如段落[15]所述的重组细胞，其中该细胞属于选自以下的进化枝：东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母进化枝以及酵母属进化枝。

[17]如段落[15]所述的重组细胞，其中该细胞选自东方伊萨酵母(例如cnb1)、郎比可假丝酵母以及布拉迪酵母。

[18]如段落[1]-[17]中任一项所述的重组细胞，其中该酵母细胞不能发酵戊糖。

[19]如段落[1]-[18]中任一项所述的重组细胞，其中所述细胞进一步包括对一个或多个内源性dse2、scw11、eaf3、sed1或sam2基因和/或编码pdc、adh、gal6、cyb2a、cyb2b、gpd、gpp、ald或pck的一个或多个内源基因的破坏。

[20]如段落[1]-[19]中任一项所述的重组细胞，其中所述细胞进一步包括对编码pdc的内源基因的破坏。

[21]如段落[1]-[20]中任一项所述的重组细胞，其中所述细胞进一步包括对编码gpd的内源基因的破坏。

[22]一种组合物，包含如段落[1]-[21]中任一项所述的重组细胞。

[23]如段落[22]所述的组合物，其中该组合物包括可发酵的培养基。

[24]如段落[23]所述的组合物，其中该可发酵的培养基包括蔗糖、葡萄糖和/或果糖。

[25]如段落[23]或[24]中任一项所述的组合物，其中该可发酵的培养基包括少于1％的戊糖。

[26]如段落[22]-[25]中任一项所述的组合物，进一步包括3-hp。

[27]如段落[26]所述的组合物，其中该3-hp的滴度大于约1g/l，例如大于约2g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l、100g/l、125g/l、150g/l、200g/l或250g/l。

[28]如段落[22]-[27]中任一项所述的组合物，其中该培养基的ph低于6.5，例如在约1.5至约4.5、约2.0至约4.0或约2.0至约3.5的范围内。

[29]一种生产3-hp的方法，包括：

(a)在适合的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落[1]-[21]中任一项所述的重组酵母细胞，以生产3-hp；并且

(b)回收该3-hp。

[30]如段落[29]所述的方法，其中该可发酵的培养基包括蔗糖、葡萄糖和/或果糖。

[31]如段落[29]或[30]所述的方法，其中该可发酵的培养基包括少于1％的戊糖。

[32]如段落[29]-[31]中任一项所述的方法，其中产生的3-hp的滴度大于约1g/l，例如大于约2g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l、100g/l、125g/l、150g/l、200g/l或250g/l。

[33]如段落[29]-[32]中任一项所述的方法，其中所得3-hp是基本上纯的。

[34]如段落[29]-[33]中任一项所述的方法，其中该可发酵的培养基的ph低于6.5，例如在约1.5至约4.5、约2.0至约4.0或约2.0至约3.5的范围内。

[35]一种生产丙烯酸或其盐的方法，包括：

(a)在适合的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落[1]-[21]中任一项所述的重组细胞，以生产3-hp；

(b)回收该3-hp；

(c)在适合的条件下，将该3-hp脱水，以生产丙烯酸或其盐；并且

(d)回收该丙烯酸或其盐。

[36]一种生产3-hp酯的方法，包括：

(a)在适合的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落[1]-[21]中任一项所述的重组细胞，以生产3-hp；

(b)回收该3-hp；

(c)在合适的条件下，酯化该3-hp，以产生3-hp酯；并且

(d)回收该3-hp酯。

[37]一种生产1,3-丙二醇的方法，包括：

(a)在适合的条件下，在可发酵的培养基中培养如段落[1]-[21]中任一项所述的重组细胞，以生产3-hp；

(b)回收该3-hp；

(c)在合适的条件下，氢化该3-hp，以生产1,3-丙二醇；并且

(d)回收该1,3-丙二醇。

[38]如段落[29]-[37]中任一项所述的方法，其中该重组细胞是cnb1细胞，该cnb1细胞被培养在包含少于1％戊糖的可发酵的培养基中。

通过说明提供了以下实例，并且并不旨在使限制本发明。

实例

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

如wo2012/074818(其内容通过引用并入本文)中所述，由东方伊萨酵母cd1822构建菌株meji412，并表达adc基因以提供通过丙二酸半醛中间体进行的主动3-hp途径。

如wo2012/074818(其内容通过引用并入本文)所述，由东方伊萨酵母meji412构建菌株mcts244/mcts259，并且还包括天然3-hpdh基因的破坏。

如wo2013/049073所述(其内容通过引用并入本文)，由东方伊萨酵母mcts259构建菌株mbin556，并进一步在adh9091位点表达天然3-hpdh。

如wo2012/074818(其内容通过引用并入本文)所述，由东方伊萨酵母mcts259构建菌株mcts263，并进一步在adh9091位点处表达seqidno:27的大肠杆菌3-hpdh。

如wo2013/049073(其内容通过引用并入本文)所述，由东方伊萨酵母mcts259构建菌株mcts276，并进一步在adh9091位点处表达seqidno:30的恶臭假单胞菌3-hpdh。

培养基和溶液

2xyt+amp平板是由16g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/lnacl、100mg/l氨比西林、以及15g/l细菌培养用琼脂构成。

ura选择性平板是由具有硫酸铵的6.7g酵母氮碱(nitrogenbase)、5g酪蛋白氨基酸、100ml0.5m琥珀酸(ph5)、20g诺布尔琼脂(nobleagar)、以及855ml去离子水构成。在高压灭菌之后，添加40ml无菌50％葡萄糖以及2ml10mg/ml氯霉素，并且倒平板。

ura选择性培养基是由具有硫酸铵的6.7g酵母氮碱、5g酪蛋白氨基酸、100ml0.5m琥珀酸(ph5)、以及855ml去离子水构成。在高压灭菌之后，添加40ml无菌50％葡萄糖以及2ml10mg/ml氯霉素。

yp+10％葡萄糖培养基是由500mlyp肉汤和100ml无菌50％葡萄糖构成。

yp肉汤是由10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨构成。

tbe是由10.8g/ltris碱、5.5g/l硼酸、以及4ml/l的0.5medta(ph8.0)构成。

lioac/te溶液是由8份无菌水、1份1mlioac、以及1份10xte构成。

10xte(200ml)是由2.42gtris碱、4ml0.5medta(ph8.0)构成。使用5mhcl将ph调节至7.5，并且将溶液通过高压灭菌器进行灭菌。

peg/lioac/te溶液是由8份50％peg3350、1份1mlioac、以及1份10xte构成。

50％peg3350是通过将100gpeg3350添加至150ml水中并且进行加热和搅拌直至溶解来制备的。然后将体积用水加至200ml，并且通过高压灭菌器进行灭菌。

痕量元素溶液是由edta(15.0g/l)、七水硫酸锌(4.5g/l)、脱水二氯化锰(1.0g/l)、六水氯化钴(ii)(0.3g/l)、五水硫酸铜(ii)(0.3g/l)、脱水钼二钠(0.4g/l)、脱水氯化钙(4.5g/l)、七水硫酸铁(3g/l)、硼酸(1.0g/l)、以及碘化钾(0.1g/l)构成。

维生素溶液是由生物素(d-；0.05g/l)、泛酸钙(d+；1g/l)、烟酸(5g/l)、肌醇(25g/l)、盐酸吡哆醇(1g/l)、对氨基苯甲酸(0.2g/l)、以及盐酸硫胺素(1g/l)构成。

cnb1摇瓶培养基是由尿素(2.3g/l)、七水硫酸镁(0.5g/l)、磷酸二氢钾(3.0g/l)、痕量元素溶液(1ml/l)以及维生素溶液(1ml/l)、葡萄糖(120.0g/l)、2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes)(97.6g/l)构成。在溶解所有培养基组分后，使用适当的碱(例如koh)将培养基的ph调节至初始ph5.8。

表1：引物序列

实例1：dna转化的程序

基于以下具体程序，进行以下实例中描述的将dna转化进宿主基因组中以产生重组菌株。

将3ml的yp+10％葡萄糖培养基添加至14ml法尔肯管(falcontube)中，并且使用无菌环将希望的菌株接种进该培养基中。使培养物在250rpm摇动下在37℃生长过夜(约16小时)。将0.5ml过夜培养物添加至125ml带挡板的包含25ml液体yp+10％葡萄糖培养基的摇瓶中。使摇瓶培养物在250rpm摇动下在37℃生长。以约以小时计的间隔抽取培养物的小等分部分，并且测量od600。使培养物生长直到od600为0.6-1.0。

将细胞通过在室温在2279xg离心来进行收获，将沉淀物重悬浮在25ml无菌水中，然后在室温在2279xg进行离心。将沉淀物再悬浮于1ml无菌水中，并且将再悬浮的细胞转移至1.5ml试管，并且然后以16,100xg进行沉淀。将细胞重悬浮在1mllioac/te溶液中，并且然后在16,100xg进行沉淀。然后将细胞沉淀物重悬浮在250μllioac/te溶液中。

将以下组分添加至1.5ml试管中：100μl以上细胞，10μl新鲜煮沸的然后冰冻的鲑鱼精dna(安捷伦科技，圣克拉拉(santaclara)，加利福尼亚州，美国)，以及10μl所希望的、线性化的转化dna。还制备了用水代替dna的对照反应。向各转化反应中依次添加600μl的peg/lioac/te溶液、40μldmso，并且将反应倒置数次以混合。将转化反应孵育于42℃水浴中持续15分钟，并且将细胞在5,400xg沉淀1min。将细胞重悬浮在水中，分为两部分，并且将转化反应物的各一半铺于ura选择性培养基平板上。将平板放置在37℃下。在生长2天后菌落是可见的。

实例2：构建用于在adh9091基因座(pmcts325)处表达异源近平滑假丝酵母3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的插入载体。

将质粒pmcts325设计成使用ura3作为选择性标记在pdc启动子和终止子的控制下在adh9091基因座处整合近平滑假丝酵母3-hpdh编码序列，并且如以下所述的进行构建。

将质粒pmbin204(在wo2012074818中描述)用xbai和paci消化。通过1％tbe-琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用darkreadertm(克莱尔化学研究(clarechemicalresearch))进行可视化。从凝胶中切下所需的pmbin204的8.4kb片段，并根据制造商的说明，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel公司)进行纯化。

geneart(生命技术公司(lifetechnologiescorporation))提供了不含线粒体靶向序列(seqidno:196)和侧翼为5’xbai和3’paci限制性位点的来自近平滑假丝酵母的3-hpdh编码序列的密码子优化形式，作为命名为14abqbjp的质粒。将该质粒用xbai和paci消化，并根据制造商的说明书，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel)将含有近平滑假丝酵母3-hpdh编码序列的所需1kb片段进行凝胶分离并纯化。

使用t4dna连接酶(新英格兰实验室公司(newenglandbiolabs))将包含近平滑假丝酵母3-hpdh编码序列(同上)的14abqbjpdna片段克隆到8.4kbppmbin204线性化载体(同上)中。该反应混合物含有1xt4dna连接酶缓冲液，1μlt4dna连接酶，1μl上述pmbin204xbai/paci消化的dna片段和5μl上述14abqbjpdna片段，总体积为20μl。将该反应混合物在室温下孵育至少1小时，并且随后根据制造商的说明书，将其转化进入stellar感受态细胞(克隆技术公司(clontech))中。在复苏期后，将来自该转化混合物的两个100μl等分部分放在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2xyt板上并且在37℃下孵育过夜。将转化的推定的重组菌落接种到3ml补充有氨比西林(100μg/ml)的lb培养基中。使用9600工作站(凯杰公司(qiagen,inc.))从这些培养物制备质粒dna，并通过限制性消化和测序进行分析。来自具有正确限制性消化图谱的一个克隆的质粒dna称为pmcts325(图2)。

质粒pmcts325含有在pdc启动子和终止子的控制下的近平滑假丝酵母3-hpdh编码序列(seqidno:196，其编码seqidno:197)，其中ura3选择标记侧翼为与adh9091基因座同源的区域。

实例3：构建用于在adh9091基因座(pmcts326)处表达异源汉逊德巴利酵母(debaryomyceshansenii)3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的插入载体。

将质粒pmcts326设计成允许在adh9091基因座上整合汉逊德巴利酵母(debaryomyceshansenii)3-hpdh编码序列(在pdc启动子和终止子的控制下，使用ura3作为选择性标记)，并且如以下所述的进行构建。

将质粒pmbin204(在wo2012074818中描述)用xbai和paci消化。通过1％tbe-琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用darkreadertm(克莱尔化学研究(clarechemicalresearch))进行可视化。从凝胶中切下所需的pmbin204的8.4kb片段，并根据制造商的说明，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel公司)进行纯化。

geneart(生命技术公司(lifetechnologiescorporation))提供了不含线粒体靶向序列(seqidno:198)和侧翼为5’xbai和3’paci限制性位点的来自汉逊德巴利酵母(d.hansenii)的3-hpdh编码序列的密码子优化形式，作为命名为14abqbip的质粒。将该质粒用xbai和paci消化，并根据制造商的说明书，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel)将含有汉逊德巴利酵母(d.hansenii)3-hpdh编码序列的所需1kb片段进行凝胶分离并纯化。

使用t4dna连接酶(新英格兰实验室(newenglandbiolabs))将包含汉逊德巴利酵母(d.hansenii)3-hpdh编码序列(同上)的14abqbipdna片段克隆到8.4kbppmbin204线性化载体中(同上)。该反应混合物含有1xt4dna连接酶缓冲液，1μlt4dna连接酶，1μl上述pmbin204xbai/paci消化的dna片段，以及5μl上述14abqbipdna片段，总体积为20μl。将该反应混合物在室温下孵育至少1小时，并且随后根据制造商的说明书，将其转化进入stellar感受态细胞(克隆技术公司(clontech))中。在复苏期后，将来自该转化混合物的两个100μl等分部分放在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2xyt板上并且在37℃下孵育过夜。将转化的推定的重组菌落接种到3ml补充有氨比西林(100μg/ml)的lb培养基中。使用9600工作站(凯杰公司(qiagen,inc.))从这些培养物制备质粒dna，并通过限制性消化和测序进行分析。将来自具有正确限制酶切消化模式的一个克隆的质粒dna指定为pmcts326(图3)。

质粒pmcts326含有在pdc启动子和终止子的控制下的汉逊德巴利酵母(d.hansenii)3-hpdh编码序列(seqidno:198，其编码seqidno:199)，其中ura3选择标记侧翼为与adh9091基因座同源的区域。

实例4：构建用于在adh9091基因座(pmcts319)处表达异源季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的插入载体。

将质粒pmcts319设计成允许在adh9091基因座上整合季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3-hpdh编码序列(在pdc启动子和终止子控制下，使用ura3作为选择性标记)，并且如以下所述的进行构建。

将质粒pmbin204(在wo2012074818中描述)用xbai和paci消化。通过1％tbe-琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用darkreadertm(克莱尔化学研究(clarechemicalresearch))进行可视化。从凝胶中切下所需的pmbin204的8.4kb片段，并根据制造商的说明，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel公司)进行纯化。

geneart(生命技术公司(lifetechnologiescorporation))提供了不含线粒体靶向序列(seqidno:200)和侧翼为5’xbai和3’paci限制性位点的来自季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)的3-hpdh编码序列的密码子优化形式，作为命名为14ablqxp的dna链(dnastring)。

使用infusionhd(克隆技术公司(clontech))将包含季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3-hpdh编码序列(同上)的14ablqxpdna片段克隆到8.4kbppmbin204线性化载体中(同上)。反应混合物含有1xinfusionhdpremix，200ng的8.4kbp载体，50ng14ablq3pdna，总体积为10μl。将反应混合物在50℃下孵育15分钟，并且随后根据制造商的说明转化进入stellar感受态细胞(克隆技术公司(clontech))中。在复苏期后，将来自该转化混合物的两个100μl等分部分放在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2xyt板上并且在37℃下孵育过夜。将转化的推定重组菌落接种到3ml补充有氨比西林(100μg/ml)的lb培养基中。使用9600工作站(凯杰公司(qiagen,inc.))从这些培养物制备质粒dna，并通过限制性消化和测序进行分析。将来自具有正确限制酶切消化模式的一个克隆的质粒dna指定为pmcts319(图4)。

质粒pmcts319含有季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)3-hpdh编码序列(seqidno：200，其编码seqidno：201)，它是在pdc启动子和终止子的控制下，其中ura3选择标记侧翼为与adh9091基因座同源的区域。实例5：构建用于在adh9091基因座(pmcts318)处表达异源葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的插入载体。

将质粒pmcts318设计成允许在adh9091基因座处整合葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)3-hpdh编码序列(在pdc启动子和终止子控制下，使用ura3作为选择性标记)，并且如以下所述的进行构建。

将质粒pmbin204(在wo2012074818中描述)用xbai和paci消化。通过1％tbe-琼脂糖凝胶电泳分离得到的片段，并用darkreadertm(克莱尔化学研究(clarechemicalresearch))进行可视化。从凝胶中切下所需的pmbin204的8.4kb片段，并根据制造商的说明，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel)进行纯化。

geneart(生命技术公司(lifetechnologiescorporation))提供了不含线粒体靶向序列(seqidno:202)和侧翼为5’xbai和3’paci限制性位点的来自葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)的3-hpdh编码序列的密码子优化形式，作为命名为14ablq3p的dna链(dnastring)。

使用infusionhd(克隆技术公司(clontech))将包含葡萄牙棒孢酵母(c.lusitaniae)3-hpdh编码序列(同上)的14ablq3pdna片段克隆到8.4kbppmbin204线性化载体中(同上)。反应混合物含有1xinfusionhdpremix，200ng的8.4kbp载体，50ng14ablq3pdna，总体积为10μl。将反应混合物在50℃下孵育15分钟，并且随后根据制造商的说明转化进入stellar感受态细胞(克隆技术公司(clontech))。在复苏期后，将来自该转化混合物的两个100μl等分部分放在补充有100μg氨比西林/ml的150mm2xyt板上并且在37℃下孵育过夜。将转化的推定重组菌落接种到3ml补充有氨比西林(100μg/ml)的lb培养基中。使用9600工作站(凯杰公司(qiagen,inc.))从这些培养物制备质粒dna，并通过限制性消化和测序进行分析。将来自具有正确限制酶切消化模式的一个克隆的质粒dna指定为pmcts318(图5)。

质粒pmcts318含有葡萄牙棒孢酵母(c.lusitaniae)3-hpdh编码序列(seqidno:202，其编码seqidno:203)，它是在pdc启动子和终止子的控制下，其中ura3选择标记侧翼为与adh9091基因座同源的区域。

实例6：构建在adh9091基因座处表达异源3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的重组菌株。

用apai、saci和ehei消化来自实例2-5的pmcts318、pmcts319、pmcts325和pmcts326各约10μg，并使用89mmtris碱-89mm硼酸-2mm二钠edta(tbe)缓冲液在0.7％琼脂糖凝胶上进行分离。从凝胶中切下所需的大约5.6kb片段，并根据制造商的说明，使用nucleospingel和pcr清洁试剂盒(macherey-nagel)进行纯化。如上所述，将这些线性构建体转化到东方伊萨酵母cnb1mcts259中(同上；还参见wo2012074818)。

针对整合位点对来自每个转化的若干单一的分离物进行筛选，以及确认其他基因座仍是被修饰的。根据制造商的说明书，使用引物614627+612909和612908+614626，通过longamptaq(新英格兰实验室(newenglandbiolabs))确认在adh9091处的整合。针对pmcts318、pmcts319、pmcts325和pmcts326中的每一个，来自612908+614626的pcr产物产生约2.0kb的条带，并且来自614627+612909的产物产生约3.5kb的条带。还使用针对adh1202基因座的引物组611245+612794(产生大约3kb条带)和611815+612795(产生大约3.6kb条带)和针对ymr226c基因座的引物组613034+613241(产生约1.4kb的带)来确认经修饰的adh1202基因座和经修饰的ymr226c基因座。对于每个整合盒，如表2中所示设计了具有用于pcr的正确大小条带的三种转化体。

表2

实例7：表达异源3-羟基丙酸脱氢酶(3-hpdh)的重组菌株的3-hp生产和酶活性

将菌株mcts608、mcts610、mcts628、mcts631(实例6)；meji412、mcts244、mcts263(同上；也参见wo2012074818)；以及mbin556、mcts276(同上；也参见wo2013049073)根据以下程序在摇瓶中生长。将菌株在ura选择平板上针对单菌落划线，并在30℃孵育1-2天。种子培养物在含有50mlcnb1摇瓶培养基(接种有来自ura选择平板的1-2个菌落)的250ml挡板烧瓶中制备。种子培养物在30℃下以200rpm振荡生长约18小时。然后将培养物的小等分部分进行抽取，以测量od600直至达到od600为4-6。种子烧瓶培养用于将含有50mlcnb1摇瓶培养基的125ml带挡板的烧瓶接种至od600＝0.2。在30℃下以140rpm震荡孵育培养物液20小时。使用样品的等分试样来测量培养物的光密度(od)。然后将样品的其余部分离心，并将来自上清液的样品用于如wo2012074818中所述的3-hp分析。然后将细胞沉淀用于3-hpdh酶测定分析。表2中的结果表明，天然3-hpdh基因的破坏导致没有可检测的3-hp生产(mcts244)，并且可以通过在adh9091基因座处表达来自葡萄牙棒孢酵母(c.lusitaniae)(seqidno:203)、季也蒙毕赤酵母(m.guilliermondii)(seqidno:201)、近平滑假丝酵母(seqidno:197)或汉逊德巴利酵母(d.hansenii)(seqidno:199)的编码3-hpdh的基因来恢复3-hp生产。这些数据还显示，与mcts263(表达seqidno:27的大肠杆菌3-hpdh)和mcts276(表达seqidno:30的恶臭假单胞菌3-hpdh)相比，这些菌株显示出改善的3-hp生产。

使用正向丙二酸半醛还原酶测定通过在340nm处测量nadh或nadph随时间的消失来测定这些菌株的3hpdh活性。根据由山田(yamada)和雅各比(jacoby)研发的方案内部合成丙二酸半醛(山田(yamada)，e.w.，雅各比(jacoby)，w.b.，1960，“丙二酸半醛向乙酰辅酶a的直接转化(directconversionofmalonicsemialdehydetoacetyl-coenzymea)”，生物化学杂志(journalofbiologicalchemistry)，第235卷，第3期，第589-594页。在一个96孔微板中进行该测定，并且终体积是200μl。通过向190μl的测定缓冲液(5mm丙二酸半醛，50mm磷酸钾(ph6.0)以及0.5mmnadh或nadph)中添加10μl的澄清细胞提取物来起始该反应。在室温(约25℃)下，在一个微板读板机(spectramax340pc，分子设备llc，桑尼维尔，加利福尼亚州)上追踪在340nm处的吸光度，持续10分钟。将一单位定义为在ph6.0下、在25℃下、在丙二酸半醛的存在下，在一分钟内产生1μmol的nadh或nadph所必需的酶的量。使用丙二酸半醛还原酶测定(表3)的结果显示，与表达天然3-hpdh(mbin556)、大肠杆菌3-hpdh(mcts263)或恶臭假单胞菌3-hpdh(mcts276)的相似菌株相比，申请人的重组菌株(具有nadh辅因子)具有增加的3-hpdh活性。

表3

虽然出于清楚理解的目的，已经通过说明以及实例的方式相当详细描述了上文，本领域的普通技术人员将清楚的是，可以实施任何等效方面或修饰。因此，该说明和实例不应当解释为限制本发明的范围。

序列表

<110>诺维信a/s

塔索内（tassone），莫尼卡（monica）

<120>用于生产3-羟基丙酸的重组宿主细胞

<130>12972-wo-pct

<160>213

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>3543

<212>dna

<213>东方伊萨酵母

<400>1

atgtcaactgtggaagatcactcctccctacataaattgagaaaggaatctgagattctt60

tccaatgcaaacaaaatcttagtggctaatagaggtgaaattccaattagaattttcagg120

tcagcccatgaattgtcaatgcatactgtggcgatctattcccatgaagatcggttgtcc180

atgcataggttgaaggccgacgaggcttatgcaatcggtaagactggtcaatattcgcca240

gttcaagcttatctacaaattgacgaaattatcaaaatagcaaaggaacatgatgtttcc300

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gattccgttgatatgggtgatttgcttgtgaaaattgccaaagatgaagcgccagcagct3540

taa3543

<210>2

<211>1180

<212>prt

<213>东方伊萨酵母

<400>2

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151015

sergluileleuserasnalaasnlysileleuvalalaasnarggly

202530

gluileproileargilepheargseralahisgluleusermethis

354045

thrvalalailetyrserhisgluaspargleusermethisargleu

505560

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<211>481

<212>prt

<213>荧光假单胞菌

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leu

<210>7

<211>1140

<212>prt

<213>谷氨酸棒杆菌

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leuaspprogluleuargaspargilecysalaaspalavallysphe

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cysargserileglytyrglnglyalaglythrvalglupheleuval

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proalaaspaspgluglnglyargileleuasptyrleualaaspval

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485490495

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<210>8

<211>1152

<212>prt

<213>苜蓿中华根瘤菌（sinorhizobiummeliloti）

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ilemetsertyrleuserileaspgluvalileargvalalalysleu

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100105110

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leuproaspaspproglugluilelysargleualaglugluilegly

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tyrprovalmetleulysalasertrpglyglyglyglyargglymet

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argalaileargaspprolysaspleuilearggluvalthrgluala

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lysargglualalysalaalapheglylysaspgluvaltyrleuglu

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lysleuvalgluargalaarghisvalgluserglnileleuglyasp

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aspthrglylysphetyrpheilegluvalasnproargileglnval

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leuleuglulysvalthralatrpalaproasnproglyglualaile

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glnargmetileargalaleuargglupheargileargglyvalala

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aspasnsertyrthrthrargpheileaspthrthrprogluleuphe

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glnglnvallysargglnaspargalathrlysleuleuthrtyrleu

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alaaspvalthrvalasnglyhisprogluvallysglyargprolys

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ilealaalaalathrvalleualaalavalgluserglyvalaspval

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770775780

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aspileglulysglylysthrleuvalileleuasnglnalagln

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glygluileaspglulysglymetvallysmetphepheglumet

104010451050

asnglyglnproargserilelysvalproaspargasnarggly

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alaseralaalavalargarglysalaglualaglyasnalaala

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<212>dna

<213>大肠杆菌

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<211>883

<212>prt

<213>大肠杆菌

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lysvalleuglygluthrilelysaspalaleuglygluhisileleu

202530

gluargvalgluthrilearglysleuserlysserserargalagly

354045

asnaspalaasnargglngluleuleuthrthrleuglnasnleuser

505560

asnaspgluleuleuprovalalaargalapheserglnpheleuasn

65707580

leualaasnthralagluglntyrhisserileserprolysglyglu

859095

alaalaserasnprogluvalilealaargthrleuarglysleulys

100105110

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115120125

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245250255

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gluleusermetvalglualathrprogluleuleualaleuvalgly

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asnthrgly

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<212>prt

<213>嗜热自养甲烷杆菌（methanobacteriumthermoautotrophicum）

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leuargleuthrleuargvalproasnprothrvalgluargalaglu

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ileileseralatyrcysargglutyrargargglnvalmetaspleu

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valaspileileasnargvalalaargtyrvalproglyargarglys

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vallysserserphegluglutyrleugluproglutyraspglugly

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hismetlysthrthrglugluileileargalaleuargileasnarg

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pheleugly

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<211>537

<212>prt

<213>产气荚膜梭菌

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metlysileprocyssermetmetthrglnhisproaspasnvalglu

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202530

thrproglnasplysglyglyleuglyileglugluvalmetileasp

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phegluglylysleuthrprotyrhisglnthrserglnilealaleu

505560

glyleuileserasnglyileileproglylysaspvalargvalthr

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proargileproasnalaasnlysgluservalpheargglnleumet

859095

serilemetserileilegluthrasnvalglnserlysgluleuthr

100105110

glythrproalailesergluvalvalvalprometilegluthrgly

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lysgluileserglupheglnaspargvalasnservalvalaspmet

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glyasnlysasntyrlysthrlysleuaspleuasnservalargile

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ileproleuvalgluaspvalproalaleualaasnileaspargile

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leuaspgluhistyrgluileglulysserlysglyhisileleulys

180185190

aspleuargilemetilealaargseraspthralametsertyrgly

195200205

leuileserglyvalleuservalleumetalavalaspglyalatyr

210215220

lystrpglyglulyshisglyvalthrileserproileleuglycys

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glyserleupropheargglyhispheserglugluasnileaspglu

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ileleualathrtyrserglyilelysthrphethrpheglnserala

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leuargtyrasphisglygluglualathrlyshisalavalargglu

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leulysglulysilealaglnserlysproargasnphesergluglu

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leuglnthrpheleulysvalileaspthrvalserphevalserasp

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340345350

glutyrasnarggluvalalaasnleuaspasnvalalaaspleuval

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ilelysthrlystyrglyglngluglyileasplysleuleugluile

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glyglyvalserlyslysileileaspgluglualaargglnglutyr

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lysgluaspmetlystyrvalasngluileleuasnleuglyleuasp

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tyrasppheleuasngluasngluphetyrhisthrleuleulysthr

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<213>东方伊萨酵母

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<213>东方伊萨酵母

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serphethrglyleuasnprogluglnvalalalysleuglulysglu

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hisglyvaltyrleuvalargserglyargalaserilealaglyleu

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<211>418

<212>prt

<213>酿酒酵母

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lysleu

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<213>大肠杆菌

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asppheserpheileilelysglnasnglymetpheserphesergly

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leuthrlysgluglnvalleuargleuarggluglupheglyvaltyr

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metalaproleucysglualailevalalavalleu

385390395

<210>17

<211>139

<212>prt

<213>除虫链霉菌（streptomycesavermitilis）

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<213>丙酮丁醇梭杆菌（clostridiumacetobutylicum）

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<213>东方伊萨酵母

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<210>21

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<212>prt

<213>克鲁弗酵母（saccharomyceskluyveri）

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servalalaleualaasnargproalaleualacyspheproserasn

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325330335

tyrtyrhisaspprolysleuglnproaspglnpropheargglnphe

340345350

asnthrtrpcysglyaspproserlysalaleuilealalysvalile

355360365

tyrglugluilevallyshisaspleuvalthrargthralagluval

370375380

glyasntyrleupheasnargleuglulysleuphegluglylysasn

385390395400

tyrileglnasnleuargglylysglyglnglythrtyrilealaphe

405410415

asppheglythrsersergluargaspserpheleuserargleuarg

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cysasnglyalaasnvalalaglycysglyaspseralavalargleu

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argproserleuthrphegluglulyshisalaaspvalleuvalser

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ilepheasplysthrleuargglnleutyrgly

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<210>22

<211>451

<212>prt

<213>除虫链霉菌（streptomycesavermitilis）

<400>22

metthrproglnproasnproglnvalglyalaalavallysalaala

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proleualavalalaglyalagluglysertyrphetrpasptyrasp

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glyargargtyrleuaspphethrserglyleuvalphethrasnile

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glytyrglnhisprolysvalvalalaalaileglngluglnalaala

65707580

serleuthrthrphealaproalaphealavalglualaargserglu

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alaalaargleuilealagluargthrproglyaspleuasplysile

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phephethrasnglyglyalaaspalailegluhisalavalargmet

115120125

alaargilehisthrglyargprolysvalleuseralatyrargser

130135140

tyrhisglyglythrglnglnalavalasnilethrglyaspproarg

145150155160

argtrpalaseraspseralaseralaglyvalvalhisphetrpala

165170175

protyrleutyrargserargphetyralagluthrgluglnglnglu

180185190

cysgluargalaleugluhisleugluthrthrilealapheglugly

195200205

proglythrilealaalailevalleugluthrvalproglythrala

210215220

glyilemetvalproproproglytyrleualaglyvalarggluleu

225230235240

cysasplystyrglyilevalphevalleuaspgluvalmetalagly

245250255

pheglyargthrglyglutrpphealaalaaspleupheaspvalthr

260265270

proaspleumetthrphealalysglyvalasnserglytyrvalpro

275280285

leuglyglyvalalaileserglylysilealagluthrpheglylys

290295300

argalatyrproglyglyleuthrtyrserglyhisproleualacys

305310315320

alaalaalavalalathrileasnvalmetalaglugluglyvalval

325330335

gluasnalaalaasnleuglyalaargvalilegluproglyleuarg

340345350

gluleualagluarghisproservalglygluvalargglyvalgly

355360365

metphetrpalaleugluleuvallysasparggluthrargglupro

370375380

leuvalprotyrasnalaalaglyglualaasnalaprometalaala

385390395400

pheglyalaalaalalysalaasnglyleutrppropheileasnmet

405410415

asnargthrhisvalvalproprocysasnvalthrglualagluala

420425430

lysgluglyleualaalaleuaspalaalaleuservalalaaspglu

435440445

tyrthrval

450

<210>23

<211>419

<212>prt

<213>除虫链霉菌（streptomycesavermitilis）

<400>23

metseralaleuserprohisleuargglnalathrprovalvalala

151015

valargglygluglyvalhisleutyrglygluaspglyargargtyr

202530

leuaspphethralaglyileglyvalthrserthrglyhiscyshis

354045

proargvalvalalaalaalaglngluglnalaglythrleuvalhis

505560

glyglntyrthrthrvalleuhisproproleuargargleuvalasp

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argleuglygluvalleuproalaglyleuaspserleuphephethr

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asnserglyserglualavalglualaalaleuargleualaarggln

100105110

alathrglyargproasnvalleuvalcyshisglyglyphehisgly

115120125

argthrvalalaalaalaalametthrthrserglythrargphearg

130135140

serglypheserproleumetserglyvalvalvalthrprophepro

145150155160

thralapheargtyrglytrpaspglugluthralathrargpheala

165170175

leuglngluleuasptyrthrleuargthrileserserproaspasp

180185190

thralaalaileilevalgluprovalleuglygluglyglytyrval

195200205

proalathrargalapheleugluglyleuarggluargalaasparg

210215220

hisglyphevalleuileleuaspgluvalglnthrglyvalglyarg

225230235240

thrglyargphetrpglyhisasphispheglyvalthrproaspile

245250255

leuilethralalysglyleualaserglypheproleuserglyile

260265270

alaalaseralagluleumetglylysalatrpproglyserglngly

275280285

glythrtyrglyalaasnalavalalacysalaalaalacysalathr

290295300

leuaspvalvalargaspglulysleuvalaspasnalaglualamet

305310315320

glyalaargleuargalaglyleualaalavalalaalathrthrpro

325330335

alaileglyaspvalargglyleuglyleumetleualasergluphe

340345350

valthrgluaspglyglyproaspprogluthralaalaargvalgln

355360365

argalaalavalaspgluglyleuleuleuleuleucysglyalatrp

370375380

asnglnvalvalargmetileproalaleuvalileaspglualaglu

385390395400

valaspgluglyleuargalatrpseralaalavalgluvalglyval

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proalaarg

<210>24

<211>471

<212>prt

<213>酿酒酵母

<400>24

metserilecysgluglntyrtyrproglugluprothrlysprothr

151015

vallysthrgluserileproglyprogluserglnlysglnleulys

202530

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tyrglulysserleuglyasntyrilethraspvalaspglyasnthr

505560

tyrleuaspleutyralaglnileserserilealaleuglytyrasn

65707580

asnproalaleuilelysalaalaglnserproglumetileargala

859095

leuvalaspargproalaleuglyasnpheproserlysaspleuasp

100105110

lysileleulysglnileleulysseralaprolysglyglnasphis

115120125

valtrpserglyleuserglyalaaspalaasngluleualaphelys

130135140

alaalapheiletyrtyrargalalysglnargglytyraspalaasp

145150155160

pheserglulysgluasnleuservalmetaspasnaspalaprogly

165170175

alaprohisleualavalleuserphelysargalaphehisglyarg

180185190

leuphealaserglyserthrthrcysserlysproilehislysleu

195200205

asppheproalaphehistrpprohisalaglutyrprosertyrgln

210215220

tyrproleuaspgluasnseraspalaasnarglysgluaspasphis

225230235240

cysleualailevalglugluleuilelysthrtrpserileproval

245250255

alaalaleuileilegluproileglnsergluglyglyaspasnhis

260265270

alaserlystyrpheleuglnlysleuargaspilethrleulystyr

275280285

asnvalvaltyrileileaspgluvalglnthrglyvalglyalathr

290295300

glylysleutrpcyshisglutyralaaspileglnproprovalasp

305310315320

leuvalthrpheserlyslyspheglnseralaglytyrphephehis

325330335

aspprolyspheileproasnlysprotyrargglnpheasnthrtrp

340345350

cysglygluproalaargmetileilealaglyalaileglyglnglu

355360365

ileserasplyslysleuthrgluglncysserargvalglyasptyr

370375380

leuphelyslysleugluglyleuglnlyslystyrprogluasnphe

385390395400

glnasnleuargglylysglyargglythrpheilealatrpaspleu

405410415

prothrglyglulysargaspleuleuleulyslysleulysleuasn

420425430

glycysasnvalglyglycysalavalhisalavalargleuargpro

435440445

serleuthrphegluglulyshisalaaspilepheileglualaleu

450455460

alalysservalasngluleu

465470

<210>25

<211>813

<212>dna

<213>东方伊萨酵母

<400>25

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<212>prt

<213>东方伊萨酵母

<400>26

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glulysleuglualaleulysalaaspleuleualalystyrproser

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ilelysvalhisilegluserleuaspvalserlysthrgluthrile

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serglyaspilevalglnleuglyservalalaglyargasnprotyr

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argproglnasnthrvalilealagluthrleuvalphealaserasn

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<210>27

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<212>prt

<213>大肠杆菌

<400>27

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151015

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202530

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leualaserleuproalaglutrpcysasnileaspileleuvalasn

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asnalaglyleualaleuglymetgluproalahislysalaserval

859095

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100105110

metthrargalavalleuproglymetvalgluargasnhisglyhis

115120125

ileileasnileglyserthralaglysertrpprotyralaglygly

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asnvaltyrglyalathrlysalaphevalargglnpheserleuasn

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progluaspvalserglualavaltrptrpvalserthrleuproala

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alaglyleuasnvalhisarggln

245

<210>28

<211>298

<212>prt

<213>粪产碱菌（alcaligenesfaecalis）

<400>28

metserasnthrilealapheileglyleuglyhismetglylyspro

151015

metalaleuasnleuleulysalaglyhisserleuasnvalpheasp

202530

leuasnalaglnalametglngluleuglnalaalaglyalaglnval

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glygluseralavalglnilealaglnaspalaglnmetvalphethr

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metleuproalaglyarghisvalargglnvaltyrgluglygluasn

65707580

glyleuleuglnthrvalalaproglythrvalleuvalaspcysser

859095

thrileaspalaglnthrserglnaspleualaalalysalaserlys

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leuglyleuphemetleuaspalaprovalserglyglythrglygly

115120125

alailealaglythrleuthrphemetvalglyglygluaspglnala

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leuglulysalaargprotyrleuaspalametglylysasnilephe

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hisalaglylysalaglyalaglyglnvalalalysilecysasnasn

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metleuleuglyileleumetalaglythralaglualaleualaleu

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glyvalalahisglyleuaspproalavalleuserthrilemetala

195200205

argserserglyargasntrpalathrgluleutyrasnprotrppro

210215220

glyvalmetproaspvalproalaserargasptyrglnglyglyphe

225230235240

alathrglyleumetleulysaspleuglyleualaalaaspalaala

245250255

valserglnasnseralathrproleuglygluleualaargasnleu

260265270

phealaleuhisalaalaglnglyglnasnalaglyleuasppheser

275280285

serileleuasnleutyrargglnlyshis

290295

<210>29

<211>314

<212>prt

<213>勤奋金属球菌（metallosphaerasedula）

<400>29

metthrglulysvalservalvalglyalaglyvalileglyvalgly

151015

trpalathrleuphealaserlysglytyrservalserleutyrthr

202530

glulyslysgluthrleuasplysglyileglulysleuargasntyr

354045

valglnvalmetlysasnasnserglnilethrgluaspvalasnthr

505560

valileserargvalserprothrthrasnleuaspglualavalarg

65707580

glyalaasnphevalileglualavalilegluasptyraspalalys

859095

lyslysilepheglytyrleuaspservalleuasplysgluvalile

100105110

leualaserserthrserglyleuleuilethrgluvalglnlysala

115120125

metserlyshisprogluargalavalilealahisprotrpasnpro

130135140

prohisleuleuproleuvalgluilevalproglyglulysthrser

145150155160

metgluvalvalgluargthrlysserleumetglulysleuasparg

165170175

ilevalvalvalleulyslysgluileproglypheileglyasnarg

180185190

leualaphealaleupheargglualavaltyrleuvalaspglugly

195200205

valalathrvalgluaspileasplysvalmetthralaalailegly

210215220

leuargtrpalaphemetglypropheleuthrtyrhisleuglygly

225230235240

glygluglyglyleuglutyrphepheasnargglypheglytyrgly

245250255

alaasnglutrpmethisthrleualalystyrasplyspheprotyr

260265270

thrglyvalthrlysalaileglnglnmetlysglutyrserpheile

275280285

lysglylysthrpheglngluileserlystrpargaspglulysleu

290295300

leulysvaltyrlysleuvaltrpglulys

305310

<210>30

<211>295

<212>prt

<213>恶臭假单胞菌

<400>30

metargilealapheileglyleuglyasnmetglyalaprometala

151015

argasnleuilelysalaglyhisglnleuasnleupheaspleuasn

202530

lysalavalleualagluleualagluleuglyglyglnileserpro

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serprolysaspalaalaalaasnsergluleuvalilethrmetleu

505560

proalaalaalahisvalargservaltyrleuasngluaspglyval

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leualaglyileargproglythrprothrvalaspcysserthrile

859095

aspproglnthralaargaspvalserlysalaalaalaalalysgly

100105110

valaspmetglyaspalaprovalserglyglythrglyglyalaala

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

alahisglnprovalileleuglyalavalalaglnglnleutyrgln

260265270

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<213>恶臭假单胞菌

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<212>prt

<213>铜绿假单胞菌

<400>32

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alaalaasnleuleulysalaglyhisargvalasnvalpheaspleu

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<211>382

<212>prt

<213>真氧产碱杆菌

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<213>克氏梭菌（clostridiumkluyveri）

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gluthrphealaaspservalilegluglyglnglnargleuleuval

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lysleutyr

370

<210>35

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<212>prt

<213>产琥拍酸曼氏杆菌

<400>35

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<213>产琥珀酸厌氧螺菌

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glyproglnleu

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<213>产琥珀酸放线杆菌

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<210>38

<211>618

<212>prt

<213>真氧产碱杆菌

<400>38

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151015

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leuthrlysprogluargilehistrpcysaspglyserglngluglu

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275280285

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<213>大肠杆菌

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<213>乳酸乳球菌

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<213>嗜热链球菌

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<213>短芽孢杆菌

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<213>产气肠杆菌

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hisalahisthrargthrvalproargglnthrproprotyrargala

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<212>prt

<213>结核分枝杆菌

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alaglyasnglyvalvalalaalaleualaalalysthralavalpro

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alavalvallysasnmetseralaserleugluvalprothralathr

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glylysargserleuvalvalalaglyilelysargcysgluthrmet

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argaspglylysleuthrthrgluaspphealaglyvalthrileser

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metproglyglnglyalaileileglyvalglyalametglutyrpro

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alaglupheglnglyalaserglugluargilealagluleuglyile

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glylysleuilethrleuthrserthrtyrasphisargileilegln

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glyalagluserglyasppheleuargthrilehisgluleuleuleu

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leuprovalargtrpserthraspasnproaspserilevalasplys

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leumetalaaspthraspproleuargleuasplysalaargphearg

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metileglyalaproilephehisvalasnglyaspaspprogluala

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lysaspvalvalileaspmetleucystyrargargargglyhisasn

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<211>985

<212>prt

<213>慢生型大豆根瘤菌

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proaspalavalgluglyserglyaspvallystyrhisleuglyala

325330335

serseraspargglupheaspglyasnargilehisleuserleuthr

340345350

alaasnproserhisleugluilevalaspprovalvalleuglylys

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thrtyrproargtyrserargserserprotyrproseraspvalala

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lysmetileaspalaproilephehisvalasnglyaspaspproglu

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alavalvalphealaalalysvalalathrglupheargglnlysphe

465470475480

hislysprovalvalileaspmetphecystyrargarghisglyhis

485490495

asngluglyaspgluproalaphethrglnprovalmettyrlyslys

500505510

ilealaalahisproserthrleugluleutyralaargargleuile

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sergluglyvalmetthrgluglygluvalasplysalalysalaasp

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trpargalaargleuaspalaglupheglualaglythrsertyrlys

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proasnlysalaasptrpleuaspglylystrpalaglyphelysile

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alaaspglnglugluaspalaargargglyvalthrglyvalaspile

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glnvalasnglyvalserargargproargtyrvalglyargalaala

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seralaalathralathrglyleumetserlyshisglnalaglnleu

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lysalapheleuaspglualaleuser

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<210>46

<211>995

<212>prt

<213>洛蒂根瘤菌

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metalaargglnaspglnthrasnaspglnpheserleuthrserphe

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leutyrglyglyasnalaasptyrileaspalaleutyralaalatyr

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gluaspaspproalaservalasnproglutrpglngluphepheala

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glyleulysaspaspalaglyaspvalargargasnalalysglyala

505560

sertrpalalysprosertrpproleuglnalaasnglygluleuval

65707580

seralaleuaspglyasntrpglyilevalglulyshisleuglulys

859095

lysvallysasplysalavalthrasnglyvalvalleuseraspala

100105110

aspvalhisglnalathrargaspservalargalailemetmetile

115120125

argalatyrargmetargglyhisleuhisalaasnleuaspproleu

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tyrglyphethralaalaasptyraspargproilepheleuaspasn

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thrargthrtyrcysserthrleuglyvalgluphemethisileser

195200205

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lysgluileserphethrasnthrglylyslysalaileleuglnlys

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leuvalglualagluglyphegluglnpheileaspvallystyrlys

245250255

glythrlysargpheglyleuaspglyglyglualaleuileproala

260265270

leugluglnilevallysargglyglyglnleuglymetlysgluile

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metalalysprohisargalailephehisgluphelysglyglyser

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alaalaproaspgluvalgluglyserglyaspvallystyrhisleu

325330335

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<212>prt

<213>乳酸乳球菌

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340345350

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glnasnlys

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<212>prt

<213>东方伊萨酵母

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prolysserlysphealatyrgluseralalysvalalaproglugly

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ileilethrglnasptyrleutrplysargleusertyrpheleulys

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proargaspileilevalthrgluthrglythrserserpheglyval

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<213>乳酸克鲁维酵母

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hisaspalalysalagluthrlyslysleuileaspleuthrglnphe

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proalaphevalthrprometglylysglyserileaspglulyshis

245250255

proargpheglyglyvaltyrvalglythrleuserserproalaval

260265270

lysglualavalgluseralaaspleuvalleuservalglyalaleu

275280285

leuserasppheasnthrglyserphesertyrsertyrlysthrlys

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<212>prt

<213>运动发酵单胞菌

<400>52

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leuaspasnleuleuleuasnlysasnmetgluglnvaltyrcyscys

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asngluleuasncysglypheseralagluglytyralaargalalys

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glyalaalaalaalavalvalthrtyrservalglyalaleuserala

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proalalysileasphisvalilelysthralaleuargglulyslys

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alathrmetalaalaalalysserphepheproglugluasnprohis

245250255

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420425430

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thrglugluleuvallystrpglylysargvalalaalaalaasnser

545550555560

arglysprovalasnlysleuleu

565

<210>53

<211>557

<212>prt

<213>巴氏醋酸杆菌

<400>53

metthrtyrthrvalglymettyrleualagluargleuvalglnile

151015

glyleulyshishisphealavalglyglyasptyrasnleuvalleu

202530

leuaspglnleuleuleuasnlysaspmetlysglniletyrcyscys

354045

asngluleuasncysglypheseralagluglytyralaargserasn

505560

glyalaalaalaalavalvalthrpheservalglyalaileserala

65707580

metasnalaleuglyglyalatyralagluasnleuprovalileleu

859095

ileserglyalaproasnserasnaspglnglythrglyhisileleu

100105110

hishisthrileglylysthrasptyrsertyrglnleuglumetala

115120125

argglnvalthrcysalaalagluserilethraspalahisserala

130135140

proalalysileasphisvalileargthralaleuarggluarglys

145150155160

proalatyrleuaspilealacysasnilealasergluprocysval

165170175

argproglyprovalserserleuleusergluprogluileasphis

180185190

thrserleulysalaalavalaspalathrvalalaleuleulysasn

195200205

argproalaprovalmetleuleuglyserlysleuargalaalaasn

210215220

alaleualaalathrgluthrleualaasplysleuglncysalaval

225230235240

thrilemetalaalaalalysglyphepheprogluasphisalagly

245250255

pheargglyleutyrtrpglygluvalserasnproglyvalglnglu

260265270

leuvalgluthrseraspalaleuleucysilealaprovalpheasn

275280285

asptyrserthrvalglytrpserglymetprolysglyproasnval

290295300

ileleualagluproaspargvalthrvalaspglyargalatyrasp

305310315320

glyphethrleuargalapheleuglnalaleualaglulysalapro

325330335

alaargproalaseralaglnlysserservalprothrcysserleu

340345350

thralathrseraspglualaglyleuthrasnaspgluilevalarg

355360365

hisileasnalaleuleuthrserasnthrthrleuvalalagluthr

370375380

glyaspsertrppheasnalametargmetthrleualaglyalaarg

385390395400

valgluleuglumetglntrpglyhisileglytrpservalproser

405410415

alapheglyasnalametglyserglnaspargglnhisvalvalmet

420425430

valglyaspglyserpheglnleuthralaglngluvalalaglnmet

435440445

valargtyrgluleuprovalileilepheleuileasnasnarggly

450455460

tyrvalilegluilealailehisaspglyprotyrasntyrilelys

465470475480

asntrpasptyralaglyleumetgluvalpheasnalaglyglugly

485490495

hisglyleuglyleulysalathrthrprolysgluleuthrgluala

500505510

ilealaargalalysalaasnthrargglyprothrleuileglucys

515520525

glnileaspargthraspcysthraspmetleuvalglntrpglyarg

530535540

lysvalalaserthrasnalaarglysthrthrleuala

545550555

<210>54

<211>528

<212>prt

<213>恶臭假单胞菌

<400>54

metalaservalhisglythrthrtyrgluleuleuargargglngly

151015

ileaspthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu

202530

lysasppheprogluasppheargtyrileleualaleuglngluala

354045

cysvalvalglyilealaaspglytyralaglnalaserarglyspro

505560

alapheileasnleuhisseralaalaglythrglyasnalametgly

65707580

alaleuserasnalatrpasnserhisserproleuilevalthrala

859095

glyglnglnthrargalametileglyvalglualaleuleuthrasn

100105110

valaspalaalaasnleuproargproleuvallystrpsertyrglu

115120125

proalaseralaalagluvalprohisalametserargalailehis

130135140

metalasermetalaproglnglyprovaltyrleuservalprotyr

145150155160

aspasptrpasplysaspalaaspproglnserhishisleupheasp

165170175

arghisvalserserservalargleuasnaspglnaspleuaspile

180185190

leuvallysalaleuasnseralaserasnproalailevalleugly

195200205

proaspvalaspalaalaasnalaasnalaaspcysvalmetleuala

210215220

gluargleulysalaprovaltrpvalalaproseralaproargcys

225230235240

propheprothrarghisprocyspheargglyleumetproalagly

245250255

ilealaalaileserglnleuleugluglyhisaspvalvalleuval

260265270

ileglyalaprovalpheargtyrhisglntyraspproglyglntyr

275280285

leulysproglythrargleuileservalthrcysaspproleuglu

290295300

alaalaargalaprometglyaspalailevalalaaspileglyala

305310315320

metalaseralaleualaasnleuvalglugluserserargglnleu

325330335

prothralaalaprogluproalalysvalaspglnaspalaglyarg

340345350

leuhisprogluthrvalpheaspthrleuasnaspmetalaproglu

355360365

asnalailetyrleuasngluserthrserthrthralaglnmettrp

370375380

glnargleuasnmetargasnproglysertyrtyrphecysalaala

385390395400

glyglyleuglyphealaleuproalaalaileglyvalglnleuala

405410415

gluprogluargglnvalilealavalileglyaspglyseralaasn

420425430

tyrserileseralaleutrpthralaalaglntyrasnileprothr

435440445

ilephevalilemetasnasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe

450455460

alaglyvalleuglualagluasnvalproglyleuaspvalprogly

465470475480

ileasppheargalaleualalysglytyrglyvalglnalaleulys

485490495

alaaspasnleugluglnleulysglyserleuglnglualaleuser

500505510

alalysglyprovalleuilegluvalserthrvalserprovallys

515520525

<210>55

<211>528

<212>prt

<213>铜绿假单胞菌

<400>55

metlysthrvalhisseralasertyrgluileleuargarghisgly

151015

leuthrthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu

202530

lysasppheprogluasppheargtyrileleuglyleuhisglugly

354045

alavalvalglymetalaaspglyphealaleualaserglyargpro

505560

alaphevalasnleuhisalaalaalaglythrglyasnglymetgly

65707580

alaleuthrasnalatrptyrserhisserproleuvalilethrala

859095

glyglnglnvalargsermetileglyvalglualametleualaasn

100105110

valaspalaglyglnleuprolysproleuvallystrpserhisglu

115120125

proalacysalaglnaspvalproargalaleuserglnalailegln

130135140

thralaserleuproproargalaprovaltyrleuserileprotyr

145150155160

aspasptrpalaglnproalaproalaglyvalgluhisleualaala

165170175

argglnvalserglyalaalaleuproalaproalaleuleualaglu

180185190

leuglygluargleuserargserargasnprovalleuvalleugly

195200205

proaspvalaspglyalaasnalaasnglyleualavalgluleuala

210215220

glulysleuargmetproalatrpvalalaproseralaserargcys

225230235240

propheprothrarghisalacyspheargglyvalleuproalaala

245250255

ilealaglyileserargleuleuaspglyhisaspleuileleuval

260265270

valglyalaprovalpheargtyrhisglnphealaproglyasptyr

275280285

leuproalaglyalagluleuvalglnvalthrcysaspproglyglu

290295300

alaalaargalaprometglyaspalaleuvalglyaspilealaleu

305310315320

thrleuglualaleuleugluglnvalargproseralaargproleu

325330335

proglualaleuproargproproalaleualaglugluglyglypro

340345350

leuargprogluthrvalpheaspvalileaspalaleualaproarg

355360365

aspalailephevallysgluserthrserthrvalthralaphetrp

370375380

glnargvalglumetarggluproglysertyrphepheproalaala

385390395400

glyglyleuglypheglyleuproalaalavalglyalaglnleuala

405410415

glnproargargglnvalileglyileileglyaspglyseralaasn

420425430

tyrglyilethralaleutrpseralaalaglntyrargvalproala

435440445

valpheileileleulysasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe

450455460

alaglyvalleugluvalproaspalaproglyleuaspvalprogly

465470475480

leuaspphecysalailealaargglytyrglyvalglualaleuhis

485490495

alaalathrargglugluleugluglyalaleulyshisalaleuala

500505510

alaaspargprovalleuilegluvalprothrglnthrileglupro

515520525

<210>56

<211>526

<212>prt

<213>施氏假单胞菌

<400>56

metalaservalhisserilethrtyrgluleuleuargargglngly

151015

ileaspthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu

202530

lysasppheprogluasppheargtyrileleualaleuglngluala

354045

cysvalvalglyilealaaspglytyralaglnalaserarglyspro

505560

alapheileasnleuhisseralaalaglythrglyasnalametgly

65707580

alametserasnalatrpasncyshisserproleuilevalthrala

859095

glyglnglnasnargalametileglyvalglualaleuleuthrasn

100105110

valaspalaalaserleuproargproleuvallystrpsertyrglu

115120125

proalaseralaalagluvalprohisalametserargalailehis

130135140

metalasermetalaproargglyprovaltyrleuservalprotyr

145150155160

aspasptrpasplysglualaaspproglnserhishisleutyrasp

165170175

argservalasnseralavalargleuasnaspglnaspleugluval

180185190

leuvalglualaleuasnseralaserasnproalailevalleugly

195200205

proaspvalaspseralaasnalaasnalaaspcysvalthrleuala

210215220

gluargleulysalaprovaltrpvalalaproseralaproargcys

225230235240

propheprothrarghisprocyspheargglyleumetproalagly

245250255

ilealaalaileserglnleuleugluglyhisaspvalvalleuval

260265270

ileglyalaprovalpheargtyrhisglntyraspproglyglntyr

275280285

leulysproglythrargleuileserilethrcysaspproleuglu

290295300

alaalaargalaprometglyaspalailevalalaaspileglythr

305310315320

metthralaalaleualaserargileglyglusergluargglnleu

325330335

proalavalleuproserprogluargvalasnglnaspalaglyarg

340345350

leuargprogluthrvalpheaspthrleuasnglumetalaproglu

355360365

aspalailetyrleuasngluserthrserthrthralaglnmettrp

370375380

glnargleuasnmetargasnproglysertyrtyrphecysalaala

385390395400

glyglyleuglyphealaleuproalaalaileglyvalglnleuala

405410415

gluproaspargglnvalilealavalileglyaspglyseralaasn

420425430

tyrserileseralaleutrpthralaalahistyrasnileproala

435440445

ilepheleuilemetasnasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe

450455460

alaglyvalleuglualagluasnvalproglyleuaspvalprogly

465470475480

ileaspphecysalailealalysglytyrglyileproalaleulys

485490495

alaaspasnleugluglnleulysglyserilehisglualaleuser

500505510

alalysglyprovalleuilegluvalserthrvalserleu

515520525

<210>57

<211>528

<212>prt

<213>荧光假单胞菌

<400>57

metlysthrvalhisseralasertyraspileleuargglnglngly

151015

leuthrthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu

202530

lysglypheprogluasppheargtyrileleuglyleuhisglugly

354045

alavalvalglymetalaaspglyphealaleualaserglyglnpro

505560

alaphevalasnleuhisalaalaalaglythrglyasnglymetgly

65707580

alaleuthrasnalatrptyrserhisserproleuvalilethrala

859095

glyglnglnvalargsermetileglyvalglualametleualaasn

100105110

valaspalaproglnleuprolysproleuvallystrpseralaglu

115120125

proalacysalagluaspvalproargalaleuserglnalailehis

130135140

metalaasnglnalaprolysglyprovaltyrleuserileprotyr

145150155160

aspasptrpalaargproalaproalaglyvalgluhisleualaarg

165170175

argglnvalalathralaglyleuproseralaalaglnleuargser

180185190

leuvalglnargleualaalaalaargasnprovalleuvalleugly

195200205

proaspvalaspglyserargserasnhisleualavalglnleuala

210215220

glulysleuargmetproalatrpvalalaproseralaserargcys

225230235240

propheprothrarghisproserpheargglyvalleuproalaala

245250255

ilealaglyileserargcysleualaasphisaspleuileleuval

260265270

valglyalaprovalpheargtyrhisglnphealaproglyasptyr

275280285

leuproalaglythrgluleuleuhisilethrcysaspproglyglu

290295300

alaalaargalaprometglyaspalaleuvalglyaspilevalglu

305310315320

thrleuglnalaleuvaltrpalaleuproaspcysaspargprogln

325330335

proglnalaleuproproalaalaprovalglugluleuglyglyleu

340345350

leuargprogluthrvalpheaspvalileaspgluleualaprolys

355360365

aspalailetyrvallysgluserthrserthrvalglyalaphetrp

370375380

glnargvalglumetarggluproglysertyrtyrpheproalaala

385390395400

glyglyleuglypheglyleuproalaalavalglyvalglnleuala

405410415

argprogluargargvalileglyvalileglyaspglyseralaasn

420425430

tyrglyilethralaleutrpthralaalaglntyrglnileproval

435440445

valpheileileleulysasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe

450455460

alaglyvalleuglnvalseraspalaproglyleuaspvalprogly

465470475480

leuaspphecysalaileglyargglytyrglyvalhisservalgln

485490495

alaasnthrargglualaphealaglnalaleuserglualaleuala

500505510

glyaspargprovalleuilegluvalprothrleuthrileglupro

515520525

<210>58

<211>1220

<212>prt

<213>橙色绿屈挠菌

<400>58

metalathrglyglusermetserglythrglyargleualaglylys

151015

ilealaleuilethrglyglyalaglyasnileglysergluleuthr

202530

argargpheleualagluglyalathrvalileileserglyargasn

354045

argalalysleuthralaleualaglumetglnalaglualaglyval

505560

proalalysargileaspleugluvalmetaspglyseraspproval

65707580

alavalargalaglyileglualailevalalaarghisglyglnile

859095

aspileleuvalasnasnalaglyseralaglyalaglnargargleu

100105110

alagluileproleuthrglualagluleuglyproglyalagluglu

115120125

thrleuhisalaserilealaasnleuleuglymetglytrphisleu

130135140

metargilealaalaprohismetprovalglyseralavalileasn

145150155160

valserthrilepheserargalaglutyrtyrglyargileprotyr

165170175

valthrprolysalaalaleuasnalaleuserglnleualaalaarg

180185190

gluleuglyalaargglyileargvalasnthrilepheproglypro

195200205

ilegluseraspargileargthrvalpheglnargmetaspglnleu

210215220

lysglyargprogluglyaspthralahishispheleuasnthrmet

225230235240

argleucysargalaasnaspglnglyalaleugluargargphepro

245250255

servalglyaspvalalaaspalaalavalpheleualaseralaglu

260265270

seralaalaleuserglygluthrilegluvalthrhisglymetglu

275280285

leuproalacyssergluthrserleuleualaargthraspleuarg

290295300

thrileaspalaserglyargthrthrleuilecysalaglyaspgln

305310315320

ileglugluvalmetalaleuthrglymetleuargthrcysglyser

325330335

gluvalileileglypheargseralaalaalaleualaglnpheglu

340345350

glnalavalasngluserargargleualaglyalaaspphethrpro

355360365

proilealaleuproleuaspproargaspproalathrileaspala

370375380

valpheasptrpalaglygluasnthrglyglyilehistrpileleu

385390395400

proalathrserhisgluproalaprocysvalilegluvalaspasp

405410415

gluargvalleuasnpheleualaaspgluilethrglythrileval

420425430

ilealaserargleualaargtyrtrpglnserglnargleuthrpro

435440445

glyalaargalaargglyproargvalilepheleuserasnglyala

450455460

aspglnasnglyasnvaltyrglyargileglnseralaalailegly

465470475480

glnleuileargvaltrparghisglualagluleuasptyrglnarg

485490495

alaseralaalaglyasphisvalleuproprovaltrpalaasngln

500505510

ilevalargphealaasnargserleugluglyleugluphealacys

515520525

alatrpthralaglnleuleuhisserglnarghisileasngluile

530535540

thrleuasnileproalaasnileseralathrthrglyalaargser

545550555560

alaservalglytrpalagluserleuileglyleuhisleuglylys

565570575

valalaleuilethrglyglyseralaglyileglyglyglnilegly

580585590

argleuleualaleuserglyalaargvalmetleualaalaargasp

595600605

arghislysleugluglnmetglnalametileglnsergluleuala

610615620

gluvalglytyrthraspvalgluaspargvalhisilealaprogly

625630635640

cysaspvalserserglualaglnleualaaspleuvalgluargthr

645650655

leuseralapheglythrvalasptyrleuileasnasnalaglyile

660665670

alaglyvalgluglumetvalileaspmetprovalgluglytrparg

675680685

histhrleuphealaasnleuileserasntyrserleumetarglys

690695700

leualaproleumetlyslysglnglyserglytyrileleuasnval

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sersertyrpheglyglyglulysaspalaalaileprotyrproasn

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argalaasptyralavalserlysalaglyglnargalametalaglu

740745750

valphealaargpheleuglyprogluileglnileasnalaileala

755760765

proglyprovalgluglyaspargleuargglythrglygluargpro

770775780

glyleuphealaargargalaargleuileleugluasnlysargleu

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asngluleuhisalaalaleuilealaalaalaargthraspgluarg

805810815

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820825830

leugluglnasnproalaalaprothralaleuarggluleualaarg

835840845

argpheargsergluglyaspproalaalaserserserseralaleu

850855860

leuasnargserilealaalalysleuleualaargleuhisasngly

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885890895

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900905910

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915920925

pheaspvalalametalathrvaltyrtyrleualaaspargasnval

930935940

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945950955960

prothrglyglygluleupheglyleuproserprogluargleuala

965970975

gluleuvalglyserthrvaltyrleuileglygluhisleuthrglu

980985990

hisleuasnleuleualamettyrleugluargtyrglyalaarggln

99510001005

valtrpilevalgluthrgluthrglyalagluthrmetargarg

101010151020

leuleuhisasphisvalglualaglyargleumetthrileval

102510301035

alaglyaspglnileglualaalaileaspglnalailethrarg

104010451050

tyrglyargproglyprovalvalcysthrpropheargproleu

105510601065

prothrvalproleuvalglyarglysaspserasptrpserthr

107010751080

valleuserglualagluphealagluleucysgluhisglnleu

108510901095

thrhishispheargvalalaarglysilealaleuseraspgly

110011051110

alaserleualaleuvalthrprogluthrthralathrserthr

111511201125

thrgluglnphealaleualaasnpheilelysthrthrleuhis

113011351140

alaphethralathrileglyvalglusergluargthralagln

114511501155

argileleuileasnglnvalaspleuthrargargalaargala

116011651170

glugluproargaspprohisgluargglnglngluleugluarg

117511801185

pheileglualavalleuleuvalthralaproleuproproglu

119011951200

alaaspthrargtyralaglyargilehisargglyargalaile

120512101215

thrval

1220

<210>59

<211>1229

<212>prt

<213>卡氏玫瑰弯菌

<400>59

metserthrvalargargleugluglylysvalalaleuilethrgly

151015

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sergluglugluglugluleuglnargphevalasnalavalleu

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leuthrseralaproleuprothrproleugluserargtyrarg

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alaargiletyrargglyasnalailethrval

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<210>60

<211>1217

<212>prt

<213>赤杆菌属物种

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metserlysgluglyasnalaalalysglyargleugluglylysval

151015

alaleuilethrglyalaalaglyasnleuglyasngluileserarg

202530

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859095

aspileleuileasnasnalaglyseralaglyprolysglnproleu

100105110

hisasnvalproleuserproglnglumetglualacysglyaspthr

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gluthrvalargaspalametleuasnileleuglyvalthrtrpasn

130135140

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145150155160

asnileserthrilepheserhisthrargtyrtyrglyargthrala

165170175

tyrvalvalprolysalaalaleuasnalaleuserasnglnleuala

180185190

sergluleuglyproargglyileargvalasnthrvalpheprogly

195200205

proilegluseraspargileargthrvalphealaalametaspglu

210215220

valglnserglnprolysaspthrthralaasntyrphethrglyarg

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metalaleuthrargservalasnglylysvalaspglylysproleu

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seralaasnargthrseralaserthrtyrmetthrargprosermet

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asntrpaspaspalaleuvalalaalahisthrleuileglysergly

325330335

alalysvalargleuglyleualaargasnalaaspvalalaglnala

340345350

asnalaargleulysalaglnglyileglyglugluleuthrvalthr

355360365

argpheasnargalagluproaspalametgluaspalaleualaala

370375380

pheserglyaspvalaspglyalailethrglyalaileileleupro

385390395400

vallysproserglyhisphethrglyserleuleualaalaaspasp

405410415

aspthrvalthrlysphemetaspthrgluleuvalglyalaileala

420425430

valserargserleualaargtyrtrphisglyarggluaspleugln

435440445

serproproargcysvalphemetthrasnproglyaspproleugly

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asnserphealaservalleuseralaglyilethrglnleuilearg

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485490495

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530535540

glugluthrglyserarglysalametvalglyphealagluasnile

545550555560

thrglyleuhisleuglylysvalalapheilethrglyglyserala

565570575

glyileglyglyglnvalalaargleuleualaleualaglyalalys

580585590

valmetmetvalalaargargglusergluleuvalalaalaargasp

595600605

argilevalglygluleuglnaspileglyphealaglyvalgluarg

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argvallystyrmetalaaspileaspvalseraspphealaserleu

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asplysalavalaspalathrleugluglupheglyargileasptyr

645650655

leuileasnasnalaglyvalalaglyalagluaspmetvalileasp

660665670

metgluproglualatrpargphethrleuaspalaasnleuileser

675680685

asntyrhisleumetglnargvalvalproleumetlysgluglngly

690695700

serglytyrvalleuasnvalsersertyrpheglyglyglulysphe

705710715720

leualavalalatyrproasnargalaasptyrglyleuserlysala

725730735

glyglnargalametvalglualapheserpropheleuglyproglu

740745750

valglncysasnalailealaproglyprovalaspglyaspargleu

755760765

serglythrglyglylysproglyleupheglnargargalalysleu

770775780

ileleugluasnlysargleuasnalavaltyrseralavalilehis

785790795800

alailearggluglyglyaspalaalalysileleuthrargleuser

805810815

argasnserthrserthrleuserhisaspalaglualaprogluglu

820825830

leuarglysleualaleuaspphealaserglnglyaspglyleucys

835840845

thrtrpaspglntyrleuleuthraspalametalaglnargleuleu

850855860

valargleuglnleuglyglypheleuleuglyserasnglutrpala

865870875880

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serasnthrgluargglumetpheglyserprolysglngluargile

965970975

asplysmetlysglylysthrvaltrpileileglygluhisleuser

980985990

asptyrvalalaalathrileglugluleuvalserglycysglyval

99510001005

alalysvalvalleuilealalysasplysserglyglulysala

101010151020

valargaspglnleuproasnaspleuserlysaspalaleuglu

102510301035

valleuilealaglyaspglyleugluglualametaspgluala

104010451050

leuglyhistrpglylysprothrthrvalleusermetprogly

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107010751080

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valalaleualaasnphevallysthrserleuhisalaphethr

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alathrvalalavalgluasngluargleuvalhisaspvalpro

114511501155

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argaspalaaspgluhisalaglugluleuargargphethrarg

117511801185

alavalleuleuvalglyalaproleuproaspalaglnaspser

119011951200

argtyrargserlysiletyrargglythrsermetthrval

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<210>61

<211>357

<212>prt

<213>勤奋金属球菌（metallosphaerasedula）

<400>61

metargargthrleulysalaalaileleuglyalathrglyleuval

151015

glyileglutyrvalargmetleualaasphisprotyrilelyspro

202530

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354045

valargtrpglnthrvalglyasnvalprolysgluvalalaasngln

505560

gluvallysprothraspprolysleumetaspaspvalaspileile

65707580

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859095

alalysleuglypheasnvalileserasnserproasphisargphe

100105110

aspmetaspvalprometileileprogluvalasnprohisthrval

115120125

thrleuileaspgluglnarglysargargasptrplysglypheile

130135140

valthrthrproleucysthralaglnglyalaalaileproleuthr

145150155160

proiletyrglnasnphelysmetserglyvalmetilethrthrmet

165170175

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tyrileasplysarg

355

<210>62

<211>356

<212>prt

<213>嗜热古菌

<400>62

metargargthrleulysalaalaileleuglyalathrglyleuval

151015

glyileglutyrvalargmetleuserasnhisprotyrilelyspro

202530

alatyrleualaglylysglyservalglylysprotyrglygluval

354045

valargtrpglnthrvalglyglnvalprolysgluilealaaspmet

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gluilelysprothraspprolysleumetaspaspvalaspileile

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859095

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aspproaspvalproleuleuvalprogluleuasnprohisthrile

115120125

serleuileaspgluglnarglysargargglutrplysglypheile

130135140

valthrthrproleucysthralaglnglyalaalaileproleugly

145150155160

alailephelysasptyrlysmetaspglyalapheilethrthrile

165170175

glnserleuserglyalaglytyrproglyileproserleuaspval

180185190

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195200205

lysgluilepheargileleusergluvallysargasnvalaspglu

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prolysleugluaspvalserleualaalathrthrhisargileala

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245250255

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proglnaspleulysleuprothralaproserlysproileileval

275280285

metasngluaspthrargproglnvaltyrpheaspargtrpalagly

290295300

aspileproglymetservalvalvalglyargleulysglnvalasn

305310315320

lysargmetileargleuvalserleuilehisasnthrvalarggly

325330335

alaalaglyglyglyileleualaalagluleuleuvalglulysgly

340345350

tyrileglulys

355

<210>63

<211>482

<212>prt

<213>酿酒酵母

<400>63

metseralaphevalargvalvalproargileserargserserval

151015

leuthrargserleuargleuglnleuargcystyralasertyrpro

202530

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354045

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505560

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65707580

glupheglngluaspglytyrleualalysileleuvalproglugly

859095

thrlysaspileprovalasnlysproilealavaltyrvalgluasp

100105110

lysalaaspvalproalaphelysaspphelysleugluaspsergly

115120125

seraspserlysthrserthrlysalaglnproalagluproglnala

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glulyslysglnglualaproalaglugluthrlysthrseralapro

145150155160

glualalyslysseraspvalalaalaproglnglyargilepheala

165170175

serproleualalysthrilealaleuglulysglyileserleulys

180185190

aspvalhisglythrglyproargglyargilethrlysalaaspile

195200205

glusertyrleuglulysserserlysglnserserglnthrsergly

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alaalaalaalathrproalaalaalathrserserthrthralagly

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seralaproserproserserthralasertyrgluaspvalproile

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serthrmetargserileileglygluargleuleuglnserthrgln

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glyileprosertyrilevalserserlysileserileserlysleu

275280285

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leuserileasnaspleuleuvallysalailethrvalalaalalys

305310315320

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arglysphelysasnvalaspvalservalalavalalathrprothr

340345350

glyleuleuthrproilevallysasncysglualalysglyleuser

355360365

glnileserasngluilelysgluleuvallysargalaargileasn

370375380

lysleualaprogluglupheglnglyglythrilecysileserasn

385390395400

metglymetasnasnalavalasnmetphethrserileileasnpro

405410415

proglnserthrileleualailealathrvalgluargvalalaval

420425430

gluaspalaalaalagluasnglypheserpheaspasnglnvalthr

435440445

ilethrglythrpheasphisargthrileaspglyalalysglyala

450455460

gluphemetlysgluleulysthrvalilegluasnproleuglumet

465470475480

leuleu

<210>64

<211>420

<212>prt

<213>酿酒酵母

<400>64

metleualaalaserphelysargglnproserglnleuvalarggly

151015

leuglyalavalleuargthrprothrargileglyhisvalargthr

202530

metalathrleulysthrthrasplyslysalaprogluaspileglu

354045

glyseraspthrvalglnilegluleuprogluserserphegluser

505560

tyrmetleugluproproaspleusertyrgluthrserlysalathr

65707580

leuleuglnmettyrlysaspmetvalileileargargmetglumet

859095

alacysaspalaleutyrlysalalyslysileargglyphecyshis

100105110

leuservalglyglnglualailealavalglyilegluasnalaile

115120125

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130135140

phemetargglyalaservallysalavalleualagluleumetgly

145150155160

argargalaglyvalsertyrglylysglyglysermethisleutyr

165170175

alaproglyphetyrglyglyasnglyilevalglyalaglnvalpro

180185190

leuglyalaglyleualaphealahisglntyrlysasngluaspala

195200205

cysserphethrleutyrglyaspglyalaserasnglnglyglnval

210215220

phegluserpheasnmetalalysleutrpasnleuprovalvalphe

225230235240

cyscysgluasnasnlystyrglymetglythralaalaserargser

245250255

seralametthrglutyrphelysargglyglntyrileproglyleu

260265270

lysvalasnglymetaspileleualavaltyrglnalaserlysphe

275280285

alalysasptrpcysleuserglylysglyproleuvalleuglutyr

290295300

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<213>枯草芽孢杆菌

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<213>酿酒酵母

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<212>prt

<213>橙色绿屈挠菌

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ilegluproleu

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<213>橙色绿屈挠菌

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<212>prt

<213>橙色绿屈挠菌

<400>82

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151015

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ilealaglyileglyalaileserasnmetglnilecysvalalaval

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alaasppheserphemetglyalasermetglyservaltyrglyglu

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lysmetalaargseralagluargalaalagluleuglyvalproleu

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metargglnlysleuproalaglypheglnthralagluphemetleu

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alalysalagluleualaglyargargalathrleuproglnproile

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met

305

<210>83

<211>378

<212>prt

<213>枯草芽孢杆菌

<400>83

metileileglyvalprolysgluilelysasnasngluasnargval

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alaleuthrproglyglyvalserglnleuileserasnglyhisarg

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valleuvalgluthrglyalaglyleuglyserglyphegluasnglu

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alatyrgluseralaglyalagluileilealaaspprolysglnval

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tyrvaltyrphearglysglyleuvalleuphethrtyrleuhisleu

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alaalagluprogluleualaglnalaleulysasplysglyvalthr

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alailealatyrgluthrvalsergluglyargthrleuproleuleu

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thrprometsergluvalalaglyargmetalaalaglnileglyala

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glnpheleuglulysprolysglyglylysglyileleuleualagly

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valproglyvalserargglylysvalthrileileglyglyglyval

165170175

valglythrasnalaalalysmetalavalglyleuglyalaaspval

180185190

thrileileaspleuasnalaaspargleuargglnleuaspaspile

195200205

pheglyhisglnilelysthrleuileserasnprovalasnileala

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aspalavalalaglualaaspleuleuilecysalavalleuilepro

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glyalalysalaprothrleuvalthrgluglumetvallysglnmet

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lysproglyservalilevalaspvalalaileaspglnglyglyile

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lyshisglyvalvalhistyralavalalaasnmetproglyalaval

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proargthrserthrilealaleuthrasnvalthrvalprotyrala

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leuglnilealaasnlysglyalavallysalaleualaaspasnthr

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alavalalaargaspleuglytyrglutyrvalproalaglulysala

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<210>84

<211>505

<212>prt

<213>粟酒裂殖酵母

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metphethrasptyrproasnaspileasncysgluserproargmet

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seraspleuaspglyphecysglnasnalapheseraspleuasnser

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leuasnglnglnvalphelysalaasntyralavalargglyalaleu

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glnmetglyglnserproilethrphevalargglnvalleuserleu

859095

cysglntyrprothrleuleuasphisalagluglulystrpphegln

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asnleupheprothraspvalvalglnargserlysmetleuleulys

115120125

gluserglyserleuglyalatyrseralaserglnglyileproleu

130135140

valargarghisvalalaasppheileargalaargaspglypheasp

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cysgluproseraspiletyrleuthrserglyalaserhisalaala

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argleuilemetthrleuileilealaargprothraspglyvalmet

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195200205

serglysermetvalsertyrserleuserglugluasnasntrpasp

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ileasppheaspglnphelyslysserpheaspglualaserlyslys

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260265270

lysalalysglyilevalleuleualaaspgluvaltyrglnasnasn

275280285

iletyrglnasnlysphehisserpheargarglysleuglygluleu

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325330335

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340345350

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<210>85

<211>507

<212>prt

<213>酿酒酵母

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metthrmetthrhisglnglnaspleulysglyvalphethralalys

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ileglyglyserileglyalatyrserhisserglnglyvalprogly

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alathrserleuleuserleuleucyslysaspserglnthrglyleu

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phehisglnaspphepheserlystyrargasn

500505

<210>86

<211>471

<212>prt

<213>枯草芽孢杆菌

<400>86

metlysasnlystrptyrlysprolysarghistrplysgluileglu

151015

leutrplysaspvalprogluglulystrpasnasptrpleutrpgln

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leuthrhisthrvalargthrleuaspaspleulyslysvalileasn

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leuthrgluaspgluglugluglyvalargileserthrlysthrile

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proleuasnilethrprotyrtyralaserleumetaspproaspasn

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proargcysprovalargmetglnservalproleusergluglumet

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serprovalproglyleuthrhisargtyrproaspargvalleuphe

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ileserglyglyaspglyleuleuileasnaspglnileleuglutyr

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ileleulysgluleuargserileprohisleugluvalileargile

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glythrargalaprovalvalpheproglnargilethrasphisleu

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leuvalasnalaglyvalprovalglyasnglnalavalvalleuala

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ilegluglyleuargglyhisthrserglytyralavalprothrphe

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valvalaspalaproglyglyglyglylysilealaleuglnproasn

340345350

tyrvalleuserglnserproasplysvalileleuargasnpheglu

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370375380

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gluproileglyleuseralailephealaasplysgluvalserphe

405410415

thrprogluasnvalaspargilelysargargglualatyrileala

420425430

asnprogluhisgluthrleulysaspargargglulysargaspgln

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leulysglulyslyspheleualaglnglnlyslysglnlysgluthr

450455460

glucysglyglyaspserser

465470

<210>87

<211>416

<212>prt

<213>牙龈卟啉单胞菌

<400>87

metalagluserargarglystyrtyrpheproaspvalthraspglu

151015

glntrpasnasptrphistrpglnvalleuasnargilegluthrleu

202530

aspglnleulyslystyrvalthrleuthralagluglugluglugly

354045

vallysgluserleulysvalleuargmetalailethrprotyrtyr

505560

leuserleuileaspprogluasnproasncysproilearglysgln

65707580

alaileprothrhisglngluleuvalargalaprogluaspglnval

859095

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100105110

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165170175

valseraspgluargleuglutyrileleulysargleuarggluile

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195200205

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provaltrpleuasnthrhispheasnhisproasngluvalthrglu

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245250255

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serglytyralavalprothrphevalvalaspalaproglyglygly

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glylysileprovalmetproasntyrvalvalserglnserproarg

340345350

hisvalvalleuargasntyrgluglyvalilethrthrtyrthrglu

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progluasntyrhisgluglucysaspcysgluaspcysargalagly

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lyshislysgluglyvalalaalaleuserglyglyglnglnleuala

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ilegluproseraspleualaarglyslysarglyspheasplysasn

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<210>88

<211>425

<212>prt

<213>核梭杆菌

<400>88

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151015

gluglutrpasnasptrpthrtrpglnvallysasnargileglulys

202530

ileaspaspleulyslystyrvalgluleuseralagluglugluglu

354045

glyvalvalargthrleugluthrleuargmetalailethrprotyr

505560

tyrpheserleuileaspmetasnseraspargcysproilearglys

65707580

glnalaileprothrileglngluilehisglnseraspalaaspleu

859095

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<213>埃氏巨球形菌

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275280285

leugluleuthrgluasnalavalvalasnleuglyvalglyalapro

290295300

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305310315320

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325330335

alaargpheglyserserargasnalaaspalaileileasphisthr

340345350

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385390395400

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metglyleulyslys

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<212>prt

<213>丙酸杆菌

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glu

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<211>260

<212>prt

<213>大豆疫霉菌

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lyspheglyglnprogluilethrleuglythrileproglycysgly

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glythrglnargleuileargalavalglylysserlysalametglu

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glyleuvalalaargvalvalproalaaspglnleuleuaspgluala

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leulysthralaasnlysilealaserpheserglnprovalvallys

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phelysaspglu

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<213>橙色绿屈挠菌

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metserglugluserleuvalleuserthrilegluglyproileala

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ileleuthrleuasnargproglnalaleuasnalaleuserproala

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leuileaspaspleuilearghisleuglualacysaspalaaspasp

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glyalaaspilelysalametalaasnalathrproileaspmetleu

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glyglnprogluileasnleuglyileileproglyalaglyglythr

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glnargleuthrargalaleuglyprotyrargalametgluleuile

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leuthrglyalathrileseralaglnglualaleualahisglyleu

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valcysargvalcysproprogluserleuleuaspglualaargarg

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ilealaglnthrilealathrlysserproleualavalglnleuala

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lysglualavalargmetalaalagluthrthrvalarggluglyleu

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lysgluglymetglnalapheileglulysargalaproasnpheser

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glyarg

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<212>prt

<213>深红红螺菌

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leuasnargprolysalaleuasnalaleuseralaglyleuvalarg

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aspleuglyalaalaleuaspalapheglualaaspvalasnvalhis

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valilevalleuthrglyserasplysalaphealaalaglyalaasp

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ilelysglumetalaglulyssertyrmetaspalatyrleugluasp

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ilealaalavalalaglyphealaleuglyglyglycysglumetala

130135140

metmetcysasppheileilealaalaglnasnalalyspheglygln

145150155160

progluileasnleuglythrleuproglyalaglyglythrglnarg

165170175

leuthrargphevalglylysserlysalametaspmetcysleuthr

180185190

glyargmetmetaspalaaspglualatrplyscysglyleuvalser

195200205

argilevalprovalaspaspleulysaspgluvalleulysileala

210215220

glualailealaasplysserleuproilethrmetmetvallysglu

225230235240

alavalasnalaalatyrgluthrthrleualaglnglyvalargphe

245250255

gluargargleupheglnalaserphealathraspaspglnlysglu

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glymetasnalapheileglulysargglnproserphethrasparg

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<210>94

<211>258

<212>prt

<213>蒴红螺菌

<400>94

metsertyrglnthrleuilevalgluilealaaspglyvalalaleu

151015

ileargleuasnargproglualaleuasnalaleuasnserglnleu

202530

leuglygluleualaalaalaleuserthrleuaspalaaspproala

354045

valargcysphevalleuthrglyserasplysalaphealaalagly

505560

alaaspilelysglumetalaasplysserphevalaspmetleulys

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leuaspphepheglythrgluglyaspalaileleuargthrarglys

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provalilealaalavalalaglytyralaleuglyglyglycysglu

100105110

leualametmetcysasppheileleucysalagluasnalalysphe

115120125

glyglnprogluileasnleuglyvalvalalaglyileglyglythr

130135140

glnargleuthrargphevalglylysserlyssermetglumethis

145150155160

leuthrglyargphemetaspalaalaglualagluargserglyleu

165170175

valserargvalleuproleualaaspleuleuproglualaleuala

180185190

thralaarglysilealaglulysseralailealathrmetvalala

195200205

lysaspcysvalasnargalatyrgluthrthrleuarggluglyval

210215220

leutyrgluargargvalphehisalaleuphealathrgluaspgln

225230235240

lysgluglymetalaalaphealaglulysargproalalyspheala

245250255

asplys

<210>95

<211>290

<212>prt

<213>智人

<400>95

metalaalaleuargvalleuleusercysalaargglyproleuarg

151015

proprovalargcysproalatrpargprophealaserglyalaasn

202530

pheglutyrileilealaglulysargglylysasnasnthrvalgly

354045

leuileglnleuasnargprolysalaleuasnalaleucysaspgly

505560

leuileaspgluleuasnglnalaleulysilepheglugluasppro

65707580

alavalglyalailevalleuthrglyglyasplysalaphealaala

859095

glyalaaspilelysglumetglnasnleuserpheglnaspcystyr

100105110

serserlyspheleulyshistrpasphisleuthrglnvallyslys

115120125

provalilealaalavalasnglytyralapheglyglyglycysglu

130135140

leualametmetcysaspileiletyralaglyglulysalaglnphe

145150155160

alaglnprogluileleuileglythrileproglyalaglyglythr

165170175

glnargleuthrargalavalglylysserleualametglumetval

180185190

leuthrglyaspargileseralaglnaspalalysglnalaglyleu

195200205

valserlysilecysprovalgluthrleuvalgluglualailegln

210215220

cysalaglulysilealaserasnserlysilevalvalalametala

225230235240

lysgluservalasnalaalapheglumetthrleuthrgluglyser

245250255

lysleuglulyslysleuphetyrserthrphealathraspasparg

260265270

lysgluglymetthralaphevalglulysarglysalaasnphelys

275280285

aspgln

290

<210>96

<211>399

<212>prt

<213>荧光假单胞菌

<400>96

metargvalvalleucyslysphealaleuleuargserhisaspgly

151015

serseralaasnileleuilelysasnasnlysserarggluleuser

202530

metthralaglnvalserthrglualaserhisalaalaileleugln

354045

aspgluvalleualagluvalargasnhisileglyhisleuthrleu

505560

asnargproalaglyleuasnalaleuthrleuglnmetvalargser

65707580

leuthrserglnleuglnalatrpseraspaspproglnvaltyrala

859095

valvalleuargglyalaglyglulysalaphecysalaglyglyasp

100105110

ileargserleutyraspserphelysasnglyaspthrleuhisgln

115120125

aspphephevalgluglutyralaleuaspleualailehishistyr

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arglysprovalleualaleumetaspglyphevalleuglyglygly

145150155160

metglyleuvalglnglyalaaspleuargvalvalthrgluargser

165170175

argleualametprogluvalalaileglytyrpheproaspvalgly

180185190

glysertyrpheleuproargileproglygluleuglyiletyrleu

195200205

glyvalthrglyvalglnileargalaalaaspalaleutyrcysgly

210215220

leualaasptrptyrleuaspserhislysleualaaspleuaspgln

225230235240

lysleuaspasnleuargtrphisaspserproleulysaspleugln

245250255

glyalaleualaargleualavalglnglnleuproaspalaproleu

260265270

alaalaleuargproalaileasphisphephealaleuproaspval

275280285

proserilevalgluglnleuglnglnvalthrvalalaaspserhis

290295300

glutrpalaleuasnthrvalserleumetglnthrargserproleu

305310315320

alametalavalthrleuglumetleuargargglyargargleuser

325330335

leugluglncysphealaleugluleuhisleuaspargglntrpphe

340345350

gluargglyaspleuilegluglyvalargalaleuileileasplys

355360365

asplysserproargtrpasnproprothrleuhisglyleualaleu

370375380

asnhisvalgluserphephehishispheglulysvalvallys

385390395

<210>97

<211>351

<212>prt

<213>蜡状芽孢杆菌

<400>97

metthrgluglnvalleupheservalsergluasnglyvalalathr

151015

ilethrleuasnargprolysalaleuasnserleusertyraspmet

202530

leuglnproileglyglnlysleulysglutrpgluhisaspgluarg

354045

ilealaleuilevalleulysglyalaglythrlysglyphecysala

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glyglyaspilelysthrleutyrglualaargserasngluvalala

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leuglnhisalagluargphepheglugluglutyrgluileaspthr

859095

tyriletyrglntyrthrlysproileilealacysleuaspglyile

100105110

valmetglyglyglyvalglyleuthrasnglyalalystyrargile

115120125

valthrgluargthrlystrpalametproglumetasnileglyphe

130135140

pheproaspvalglyalaalatyrpheleuasnlysalaproglytyr

145150155160

thrglyargphevalalaleuthralaserileleulysalaserasp

165170175

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180185190

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245250255

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260265270

serproileserleulysvalthrleulysglnpheileaspglygln

275280285

asplysservalgluglucysphealathraspleuileleualalys

290295300

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<210>98

<211>381

<212>prt

<213>智人

<400>98

mettrpargleumetserargpheasnalaphelysargthrasnthr

151015

ileleuhishisleuargmetserlyshisthraspalaalagluglu

202530

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prolyspheleuasnalaleuthrleuasnmetileargglniletyr

505560

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ilelysglyalaglyglylysalaphecysalaglyglyaspilearg

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valileserglualaglulysalalysglnlysilealaprovalphe

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phearggluglutyrmetleuasnasnalavalglysercysglnlys

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protyrvalalaleuilehisglyilethrmetglyglyglyvalgly

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leuservalhisglyglnpheargvalalathrglulyscysleuphe

145150155160

alametprogluthralaileglyleupheproaspvalglyglygly

165170175

tyrphephealathrthrproarglysthrtrpleuleuprocysile

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asnglypheargleulysglyargaspvaltyrargalaglyileala

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thrhisphevalaspserglulysleualametleuglugluaspleu

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leualaleulysserproserlysgluasnilealaservalleuglu

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asntyrhisthrgluserlysileaspargasplysserpheileleu

245250255

glugluhismetasplysileasnsercyspheseralaasnthrval

260265270

glugluileilegluasnleuglnglnaspglyserserphealaleu

275280285

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290295300

thrleuargglnleumetgluglyserserlysthrleuglngluval

305310315320

leuthrmetglutyrargleuserglnalacysmetargglyhisasp

325330335

phehisgluglyvalargalavalleuileasplysaspglnserpro

340345350

lystrplysproalaaspleulysgluvalthrglugluaspleuasn

355360365

asnhisphelysserleuglyserseraspleulysphe

370375380

<210>99

<211>261

<212>prt

<213>埃氏巨球形菌

<400>99

vallysthrvaltyrthrleuglyileaspvalglyserserserser

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lysalavalileleugluaspglylyslysilevalalahisalaval

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valgluileglythrglyserthrglyprogluargvalleuaspglu

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valphelysaspthrasnleulysilegluaspmetalaasnileile

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alathrglytyrglyargpheasnvalaspcysalalysglygluval

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sergluilethrcyshisalalysglyalaleupheglucysprogly

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thrthrthrileleuaspileglyglyglnaspvallysserilelys

100105110

leuasnglyglnglyleuvalmetglnphealametasnasplyscys

115120125

alaalaglythrglyargpheleuaspvalmetserlysvalleuglu

130135140

ileprometserglumetglyasptrptyrphelysserlyshispro

145150155160

alaalavalserserthrcysthrvalphealaglusergluvalile

165170175

serleuleuserlysasnvalprolysgluaspilevalalaglyval

180185190

hisglnserilealaalalysalacysalaleuvalargargvalgly

195200205

valglygluaspleuthrmetthrglyglyglyserargaspprogly

210215220

valvalaspalavalserlysgluleuglyileprovalargvalala

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leuhisproglnalavalglyalaleuglyalaalaleuilealatyr

245250255

asplysilelyslys

260

<210>100

<211>428

<212>prt

<213>埃氏巨球形菌

<400>100

metsergluglulysthrvalaspileglusermetserserlysglu

151015

alaleuglytyrpheleuprolysvalaspgluaspalaarglysala

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lyslysgluglyargleuvalcystrpseralaservalalapropro

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gluphecysthralametaspilealailevaltyrprogluthrhis

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<213>埃氏巨球形菌

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<213>酿酒酵母

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leulyslysalavalglnasnileileleuglyiletyrtyrasnser

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<213>大肠杆菌

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ilealaalailevalprotrpasnpheproleuleuleuthrcystrp

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hisglualaglyglnalaleuserarghisasnaspileaspalaile

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alathralaalaglyilephetyrasnglnglyglnvalcysileala

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<213>肺炎克雷伯菌

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serglulysserproleuthralaleuargleualaglyleualalys

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