对伯氏疏螺旋体的新型抗病毒活性的鉴定的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2014年10月31日的美国临时专利申请no.62/073,605和申请日为2015年3月23日的美国临时专利申请no.62/136,678的优先权，其中的每个均通过引用整体而被并入本文。
背景技术：
莱姆病是一种多系统疾病，该疾病由螺旋体细菌伯氏疏螺旋体所引起(meek等人，1996；stricker等人，2011)。该疾病由蜱媒介传播，所述蜱媒介可以通过啮齿动物，爬行动物，鸟和鹿传播(stricker等人，2011；radolf等人，2012)。在美国，莱姆病病例数在过去15年翻了一番(orloski等人，2000；bacon等人，2008)，并且估计每年约有30万病例(centersfordiseasecontrol，2014)。目前，莱姆病被认为是在美国和欧洲最常见的蜱传播疾病(bacon等人，2008；armedforceshealthsurveillance；2001-2012；cdc，lymedisease，2014)。莱姆病早期的临床表现最常见的特征是游走性红斑皮疹，常伴有流感样症状。炎症性关节炎或神经功能障碍可为未经治疗的感染的频繁后遗症。
大多数莱姆病患者可用抗生素多西环素或阿莫西林在用药2-4周的持续时间后治愈，特别是在疾病的早期阶段。但是，一部分患者尽管进行了抗菌治疗仍经历持续症状，包括疲劳、神经认知困难(脑疲劳)或者肌肉骨骼疼痛。当在抗生素治疗后症状持续超过6个月的时候，这已被建议作为一种非传染性的治疗后莱姆病综合征(ptlds)，由于无法找到可行的剩余生物且采用头孢曲松、多西环素或阿莫西林的长期单一疗法缺乏实质性的疗效(cdc，post-treatmentlymediseasesyndrome，2014；wormser等人，2006；klempner等人，2013)。患有ptlds或慢性持续性莱姆病的约10-20％的患者(疾病控制中心，2014)，尤其是那些由于忽视蜱叮咬或不准确的测试而错过早期诊断和治疗的患者(stricker等人，2011)。
目前尚不清楚什么机制传播了这些患者中的这种情况。提出的概念包括宿主反应，虽然缓慢或无效的杀死b.螺旋体持留菌已被表示为可能的解释，尽管缺乏存在于ptlds中的活生物体的证据(berndtson，2013)。以前的研究表明b.螺旋体在抗生素短期疗程之后可能仍然存在于一些患者中(stricker等人，2011；hodzic等人，2008；diterich等人，2003)。
当ptlds只有主观症状复合体时，尽管进行了抗生素治疗，约10％的莱姆关节炎晚期患者有客观，持续性关节肿胀(antibioticrefractorylymearthritis；steere和glickstein，2004)。虽然，这种反应的一部分可以包括在某些宿主中由b.螺旋体诱导的自身免疫模拟，另外的解释取决于持续感染所驱动的免疫应答或者抗原性碎片的存在(bockenstedt等人，2012)。
某些人已提出了在抗生素治疗之后b.螺旋体是否仍然存在于某些患者内且进一步逃避宿主免疫清除的问题，但存在争议(stricker等人，2011；hodzic等人，2008；diterich等人，2003)。在各种动物模型中，例如小鼠，狗和猴，采用多西环素，头孢曲松或替加环素的抗生素治疗不能完全根除如异核诊断和pcr所示的b.螺旋体的检测，即使活生物体不能在常规培养基中培养(barthold等人，2010；等人，2012；hodzic等人，2014；straubinger等人，1997)。最近的研究显示，抗生素后的持久性与不可培养的b.螺旋体dna的复苏同时存在，该不可培养的b.螺旋体dna于抗生素治疗后12个月的小鼠内被发现(hodzic等人，2014)。关于蜱异体接种诊断法的人类研究显示，一些患者治疗后仍然具有伯氏疏螺旋体病菌(marques等人，2014)。这些观察表明采用抗生素剂量的持续性b.螺旋体的某种形式不能够完全消除，虽然在动物实验中的抗生素水平可能不足。
目前没有用于治疗慢性持续性莱姆病的有效的抗生素。目前使用的一线药物，如多西环素，阿莫西林和米诺环素对持续性b.螺旋体只有有限的活性。许多前瞻性、随机临床研究已经发现，采用常用的抗生素单一疗法的额外延长抗生素治疗没有显着有益效果，也没有证据表明具有长期症状的病人体内的b.螺旋体的持续存在(klempner等人，2013；fallon等人，2008)。一项研究报道了长期静脉注射头孢曲松对疲劳症状的一些改善，虽然最终认为不值得冒为此效果而仅采用头孢曲松注射的风险(krupp等人，2003)。头孢曲松最近被证明是对于抗b.螺旋体持留菌比多西环素或阿莫西林更有活性(feng，wang，shi等人，2014)。有趣的是，在人类中的一项最近研究通过在尽管进行了抗生素治疗的单个ptlds患者中的异体接种诊断法而证明了b.螺旋体dna的恢复(marques等人，2014)。b.螺旋体能够在体外具有复杂的生活方式，其特征在于多形性形式，包括螺旋体，原生质体(或l型)，囊肿或圆形体(rb)，以及小菌落形式(diterich等人，2003；brorson等人，2009；sapi等人，2012；miklossy等人，2008；alban等人，2000；hodzic等人，2008)。这些b.螺旋体的形态变体具有不同的抗生素敏感性(sapi等人，2011)。rb形式显示为球菌状的，b.螺旋体的膜结合非典型变体，在实验应力条件下形成，如饥饿，氧化应激，ph变化，加热或培养中的抗生素治疗(brorson等人，2009；murgia和cinco，2004；brorson和brorson，1997；kersten等人，1995)。rb形式具有较低的代谢并且抵抗各种应力，可能是一种保护机制以克服不利的环境条件(murgia和cinco，2004；brorson等人，2009)。这些对通过包括多西环素和阿莫西林在内的许多抗生素杀灭相对耐受(feng，wang，shi等人，2014；brorson等人，2009)，并且可在新鲜的含非抗生素的传代培养物中恢复到传统螺旋形式的螺旋体(brorson等人，2009；brorson和brorson，1998；murgia与cinco，2004)。
b.螺旋体的圆形体形式也在螺旋体感染期间于体内被发现，如见于脊髓液(brorson和brorson，1998)，以及慢性神经莱姆病患者的脑组织中(miklossy等人，2008)。这些发现表明b.螺旋体的圆形体形式可能在慢性莱姆病中发挥作用。
虽然，非典型囊肿或颗粒形式已经在人类中被发现(miklossy等人，2008)，既没有好的证据证明这种形态变体与人类感染是共同常见的，在初始治疗后也没有额外的抗生素改善具有持续症状的患者(lantos等人，2014)。当一线药物多西环素，阿莫西林和米诺环素相当有效地杀灭b.螺旋体的复制螺旋体形式的时候，它们对非复制的持留菌或生物膜样聚集体或富集在稳定期培养物中的b.螺旋体的微菌落具有很小的活性(feng，wang，shi等人，2014；sapi等人，2011)。
此外，虽然一些抗生素已经进行了对于它们抗b.螺旋体的活性检测，b.螺旋体中的全谱抗生素敏感性尚未确定(hunfeld和brade，2006)。于是，寻找有效的抗生素及其组合对于开发用于慢性莱姆病的有效治疗是重要的。fda批准的药物已经具有相对清楚的安全性和病人体内的药代动力学特征，以及制造和分销网络。因此，如果批准的药物被证明有活性，那么批准的药物可以快速应用于治疗莱姆病。
筛选具有抗b.螺旋体活性的新型抗生素，采用目前的活性测定是困难的，目前的活性测定主要基于显微计数和pcr。这些测定是冗长的且不能被用于高通量筛选。常用的live/deadbaclight测定具有较高的背景问题，并且不能以高通量形式直接用于细菌的活力评估，如伯氏疏螺旋体或者其它感兴趣的细菌。
技术实现要素：
一方面，本公开主题提供了用于评估螺旋体有机体的生存力或评估螺旋体有机体的抗微有机体药物敏感性的方法，所述螺旋体有机体例如来自疏螺旋体属，并且优选为伯氏疏螺旋体物种，以及相关有机体和其它细菌，包括但不限于：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，鲍氏不动杆菌和结核分枝杆菌。
因此，在一些方面，本公开主题提供了一种用于评估来自所选属的细菌的生存力的方法，该方法包括：(a)建立细菌培养物，包含从所选属分离的细菌；(b)用染色混合物孵育细菌培养物，所述染色混合物包含：(i)第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示培养物里的活细菌细胞，和(ii)第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示培养物里的死亡的细菌细胞；以及(c)计算第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值；并且(d)评估培养物里的细菌的生存力，其中，(c)中所计算出的比值指示培养物里的活细菌的百分比。
在一些方面，本公开主题提供了一种用于评估来自所选属的细菌对至少一种抗微生物剂的敏感性的方法，该方法包括：(a)建立细菌培养物，包含从所选属分离的细菌；(b)在合适的条件下孵育所述培养物用于出现细菌生长，采用：(i)至少一个剂量的至少一种抗微生物剂；和(ii)染色混合物，包含第一试剂，该第一试剂发射第一颜色的荧光，指示培养物里的活细菌，并包含第二试剂，该第二试剂发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示培养物里的死细菌，其中，第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值指示培养物内活细菌的百分比；以及(c)在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的一段时间后，通过计算(b)(ii)中的比值来评估来自所选属的细菌对至少一种抗微生物剂的敏感性，无需细菌生长，如果(b)(ii)中的比值在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的一段时间之后保持相同或降低，那么其中所述细菌被评估为对至少一种抗微生物剂敏感的，并且，如果(b)(ii)中的比值在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的该段时间之后增加了，那么所述细菌被评估为对至少一种抗微生物剂抗性的。
在特定方面，该方法以高通量形式执行，例如用于药物筛选。
在其它方面，本公开主题提供了一种识别候选试剂的方法，所述候选试剂能够抑制来自所选属的细菌的生长或存活，所述方法包括：(a)建立培养物，包含从所选属分离的细菌；(b)使所述培养物与测试试剂接触；(c)在测试试剂的存在下，在不同的时间跨度对不生长的持留菌以连续时间推移的方式并且以增长独立的方式进行快速抗微生物药敏试验来评估培养物内细菌的生存力，并与对照培养物中细菌的生存力进行比较，所述对照培养物缺少用于药物筛选的测试试剂，以使对测试试剂的敏感性可以快速确定，而不需要像在常规抗生素敏感性试验中那样依赖细菌生长，其中，评估培养物内细菌的生存力包括：(i)用染色混合物孵育所述培养物，所述染色混合物包含：第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示培养物里的活细菌，和第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示死亡的细菌；(ii)计算第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值，其中所述比值指示培养物里的活细菌的百分比；以及(d)如果对于培养物计算的比值比对于对照组培养物类似计算的比值要小，则识别所述测试试剂为候选试剂，所述候选试剂能够抑制来自所选属的细菌的生长或存活。
在一些方面，本公开主题提供了用于筛选能够抑制来自所选属的细菌的生长或存活至少一种试剂的试剂盒，所述试剂盒包含来自所选属的细菌分离的非复制持留菌形式和用于进行sybrgreeni/碘化丙啶活力测定的试剂。
在某些方面，本公开主题提供了用于评估来自所选属的细菌培养物的生存力和对至少一种试剂的敏感性的试剂盒，所述试剂(例如，目前的莱姆病抗生素或者任何新试剂)能抑制来自所选属的细菌的生长或存活，所述试剂盒包含来自所选属的细菌培养物，用于进行sybrgreeni/碘化丙啶活力测定的试剂，以及可选的至少一种测试试剂。
在某些方面，本公开主题提供了用于筛选至少一种候选试剂的试剂盒，所述候选试剂能够抑制来自所选属的细菌的生长或存活，所述试剂盒包含：(a)分离的细菌群体，包含来自所选属的细菌或者其培养物；(b)染色混合物，包含：(i)第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示活细菌细胞，和(ii)第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示死亡的细菌细胞；其中，当将染色混合物与细菌群体或其培养物一起孵育时，计算的第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值指示群体或其培养物内活细菌的百分比；以及(c)使用(a)中的细菌和(b)中的染色混合物的指令，以筛选至少一种候选试剂，所述候选试剂能抑制来自所选属的细菌的生长或存活。
在本公开方法的某些方面，选择的属为疏螺旋体属。在特定的方面，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它方面，所选择的属选自由以下组成的组：葡萄球菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，不动杆菌属和分支杆菌属。在更具体的方面，所述细菌选自由以下组成的组：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯杆菌，鲍氏不动杆菌，非结核分枝杆菌以及结核分枝杆菌。
在某些方面，本公开主题提供了一种用于抑制来自所选属的细菌的生长和/或存活的方法，该方法包括：将来自所选属的细菌与有效量的以下物质相接触：(a)选自下组中的至少一种化合物：达托霉素，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，硝呋醛肟，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，头孢甲肟，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素和链霉素；(b)选自下组中的至少一种化合物：道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少两种化合物的组合，包括：
(i)选自下组中的第一化合物：达托霉素，头孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧哒嗪；和(ii)选自下组的不同于第一化合物的第二化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三种化合物的组合，包括：(i)作为第一化合物的多西环素；(ii)选自下组中的第二化合物：达托霉素或头孢哌酮；和(iii)不同于第二化合物的选自下组中的第三化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在其它方面，本公开主题提供了一种在有需要的受试者中用于治疗莱姆病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的：
(a)选自下组中的至少一种化合物：达托霉素，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，硝呋醛肟，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，头孢甲肟，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素和链霉素；(b)选自下组中的至少一种化合物：道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少两种化合物的组合，包括：
(i)选自下组中的第一化合物：达托霉素，头孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧哒嗪；和(ii)选自下组的不同于第一化合物的第二化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三种化合物的组合，包括：(i)作为第一化合物的多西环素；(ii)选自下组中的第二化合物：达托霉素或头孢哌酮；和(iii)不同于第二化合物的选自下组中的第三化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在一些方面，本公开主题提供了一种在有需要的受试者中用于治疗莱姆病的方法，所述方法包括：(a)向受试者施用有效量的至少两种试剂的组合，所述至少两种试剂包括：(i)至少一种试剂抑制来自疏螺旋体属的复制形式的细菌的生长和/或存活；以及(ii)至少一种试剂抑制来自疏螺旋体属的非复制的持留菌形式的细菌的生长和/或存活。
本公开主题的某些方面已经在上文中进行了详细描述，通过本公开的主题，发明内容得以完整或部分地被描述，随着描述的进行，结合如下文优选描述的实施例和附图，其它方面将变得明显而易于理解。
附图说明
图1显示了用抗生素治疗之后的代表性的形态变化疏螺旋体属细胞；
图2显示了在96孔板中用于分析b.螺旋体生存力的方法的比较；
图3显示了活的b.伯氏疏螺旋体的百分比与sybrgreen/碘化丙啶(pi)测定的绿/红荧光比之间的线性关系(在live/dead测定之前，1bsk-h培养基在洗涤步骤中被除去)；
图4显示了b.螺旋体b31菌株进行的常规的生存力测定mtt，xtt，荧光素二乙酸酯测定(fda)，市售live/deadbaclight测定，以及本公开的sybrgreeni/pi测定；
图5a～5d显示了所述b.螺旋体b31菌株，观察到：(图5a)荧光显微镜live/deadbaclight染色；(图5b)sybrgreen/pi染色；(图5c)fda染色；以及(图5d)由sybrgreen/pi染色的b.螺旋体生物膜；
图6显示了sybrgreen/pi测定，示出了在抗生素暴露中与直接显微镜计数的相关性(1样品由live/deadbaclight试剂盒染色)；
图7显示了细菌持留菌和潜伏感染的阴阳模型的代表性图，其中，它提出靶向生长和非生长细菌群体，为更有效地治疗难治的疾病或者持续性细菌感染，甚至癌症(zhang，2014)；
图8a～8c显示了：(图8a)b.螺旋体b31菌株的体外生长曲线；使用sybrgreeni/pi染色，用荧光显微镜观察到的b.螺旋体b31菌株(图8b)对数期(3天培养)和稳定期(7天培养)的代表性图像；箭头表示稳定期的b.螺旋体的多种形态形式；以及(图8c)5天治疗后，b.螺旋体的对数期(3天)和稳定期(7天)对50μm药物的敏感性。残留活细胞的百分比通过sybrgreeni/pi测定法测定。图9显示了在稳定期的疏螺旋体持留菌上对fda批准的药物库(2000个化合物)的筛选。抗稳定期(培养7天)的b.螺旋体的一些有效抗生素的体外活性得到了显示；
图10a～10d显示了通过道诺霉素(图10a)，头孢哌酮(图10b)，四环素(图10c)以及无药物对照(图10d)处理的b.螺旋体b31菌株的稳定期的代表性图像。处理后用sybrgreeni/pi进行染色；
图11显示了用卡泊霉素(左)和氯法齐明(右)处理的b.螺旋体b31菌株的稳定期的代表性图像；
图12显示了一些用于b.螺旋体b31菌株的持留菌活性抗生素的抗生素最小抑制浓度(mics)；
图13a～13c显示了以下代表性图像：(图13a)3日龄对数期；(图13b)7日龄稳定期；以及(图13c)10日龄稳定期的b.螺旋体培养物；将不同龄的b.螺旋体培养物用sybrgreeni/pi测定染色，并在显微镜下观察(400×放大倍率)。箭头指示稳定期培养物内螺旋体(s)，圆形体(r)，以及小菌落(m)形式的b.螺旋体；
图14显示了药物的效果(50μg/ml)和在稳定期的疏螺旋体的组合。处理5天后，稳定期的b.螺旋体对单独的药物及其组合的敏感性。g/r：绿/红比率；括号内的值：显微镜计数残留活细胞的百分比；dox：多西环素；amox：阿莫西林；cef-p：头孢哌酮；cef-t：头孢曲松；mtz：甲硝唑；cfz：氯法齐明；mcz：咪康唑；pmb：多粘菌素b；
图15显示了抗疏螺旋体生物膜的代表性药物组合。用落射荧光倒置显微捕获的图像(20x放大倍率)。药物浓度，50μg/ml；
图16显示了代表性的药物组合抗疏螺旋体生物膜的活性。荧光强度和图像面积通过imageproplus软件计算得到；
图17a和图17b显示了单独的抗生素和其组合对聚集的小菌落形式与浮游形式的b.螺旋体的效果。稳定期b.螺旋体培养物(10日龄)用10μg/ml药物(标记在图像上)处理7天，然后通过sybrgreeni/pi测定染色。绿细胞表示活细胞，而红细胞表示死细胞：(图17a)如通过400×放大倍率的荧光显微镜观察到的，b.螺旋体聚集小菌落(mc)形式比浮游形式(圆形体和螺旋形)(pt)更耐受不同的抗生素或其组合；并且，(图17b)通过200×放大倍率的荧光显微镜评估了b.螺旋体小菌落形式对抗生素和抗生素组合的敏感性。当小菌落被检查时，单个rb的亮度比小菌落弱得多，这使得单个细胞难以观察。缩写：dox，多西环素；cefp，头孢哌酮；cfz，氯法齐明；dap，达托霉素；smx，磺胺甲恶唑；cab，羧苄青霉素；car，卡波霉素；
图18a～18i显示了用不同的单独抗生素或其组合处理的10日龄b.螺旋体稳定期培养物的传代培养物(15天)。使用sybrgreeni/pi染色，用荧光显微镜(400×放大倍率)拍摄代表性图像。只有dox+dap+cefp完全杀死所有形式的b.螺旋体持留菌，包括小菌落形式的b.螺旋体持留菌，如传代培养15天后缺乏任何可行的绿色螺旋形式所示。缩写：dox，多西环素；cefp，头孢哌酮；cfz，氯法齐明；dap，达托霉素；smx，磺胺甲恶唑；
图19a～19d显示了在传代培养期间，阿莫西林的存在下显微镜示出的圆形体形式，并且随后回到b.螺旋体的螺旋形式：(图19a)5日龄的b.螺旋体培养物，主要由螺旋形式组成；(图19b)在用阿莫西林(50μg/ml)处理3天后从b.螺旋体的螺旋形式形成的球菌圆形体形式；(图19c)在新鲜bsk-培养基中传代培养5天之后，从b.螺旋体的圆形体形式(图19b)回复到螺旋体形式；并且(图19d)用100μg/ml阿莫西林将7日龄的稳定期b.螺旋体处理3天；
图20显示了将5日龄的螺旋体和阿莫西林诱导的圆形体的b.螺旋体(5天)暴露于50μm的多西环素，头孢呋辛和头孢曲松中5天。残留活细胞的百分比通过sybrgreeni/pi测定法测定，然后进行荧光显微镜计数；
图21a～21i显示了用不同抗生素(50μm)处理7天，随后用sybrgreeni/pi测定法染色并用荧光显微镜显示的b.螺旋体(将6日龄培养物用50μg/ml阿莫西林诱导72小时)的阿莫西林诱导的圆体形式的代表性图像；
图22a～22p显示了在稳定期b.螺旋体微菌落上单独或组合使用抗生素的效果。b.螺旋体(10日龄)的稳定期培养物被单独或组合使用10μg/ml药物处理7天(标记在图像上)，然后用sybrgreeni/pi测定法染色。绿细胞表示活细胞，而红细胞表示死细胞。缩写：dox，多西环素；cefp，头孢哌酮；art，青蒿素；dap，达托霉素；cefm，头孢美唑；scp，磺胺氯达嗪；
图23a～23i显示了b.螺旋体(将6日龄的培养物用50μg/ml的阿莫西林诱导72小时)的阿莫西林诱导的圆形体形式的传代培养物(20天)，采用不同的单独抗生素或其组合对其进行处理。使用sybrgreeni/pi染色，用荧光显微镜拍摄的代表性图像。20天传代培养之后(图23g)，只有dox+dap+cefp完全杀死b.螺旋体持留菌的所有圆形体，如缺乏任何可行的绿色螺旋形式所示。缩写：dox，多西环素；cefp，头孢哌酮；dap，达托霉素；art，青蒿素；scp：磺胺氯达嗪；
图24显示了稳定期b.螺旋体的代表性图像，所述稳定期b.螺旋体用不同的化合物(50μm)进行了处理，并随后用sybrgreeni/pi测定进行了染色。缩写：dox：多西环素，amo：阿莫西林，dap：达托霉素，dau：道诺霉素，nog：诺加霉素，pyr：嘌呤霉素，rho：rhodomycina，cha：chaetochromin，pro：灵菌红素，mit：丝裂霉素，nan：纳紫霉素，dac：更生霉素，emo：大黄素；
图25显示了用不同化合物(20μm)处理并随后用sybrgreeni/pi测定法染色的稳定期b.螺旋体b31菌株的代表性图像。缩写：dox：多西环素，dap：达托霉素，dau：道诺霉素，nog：诺加霉素，pyr：嘌呤霉素，rho：rhodomycina，cha：chaetochromin，pro：灵菌红素，nan：纳紫霉素。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以下描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
i、用于识别抗持留菌活性的方法
本公开主题涉及用于评估细菌(例如，来自疏螺旋体属，例如，b.螺旋体的复制和/或非复制持留菌形式，和在一些实施例中，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯杆菌，鲍氏不动杆菌，以及结核分枝杆菌)生存力的方法，用于评估细菌对候选抗微生物剂的敏感性的方法，用于筛选抑制细菌的生长或存活的至少一种试剂的方法，用于抑制细菌的生长和/或存活的方法，治疗莱姆病的方法，并且涉及能够用于实施所述方法的组合物和试剂盒。
因此，在一些实施例中，本公开主题提供了一种用于评估来自疏螺旋体属的细菌的生存力的方法，所述方法包括：(a)建立细菌培养物，包含从疏螺旋体属分离的细菌；(b)用染色混合物孵育细菌培养物，所述染色混合物包含：(i)第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示培养物里的活细菌细胞，和(ii)第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示培养物里的死亡的细菌细胞；以及(c)计算第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值；并且(d)评估培养物里的细菌的生存力，其中，(c)中所计算出的比值指示培养物里的活细菌的百分比。
在一些实施例中，本公开主题提供了一种新的sybrgreeni/碘化丙啶(pi)检测法(也称为sybrgreen/pi)，基于用于细菌的快速生存力评估的绿色荧光与红色荧光的比值，其中所述细菌例如为来自疏螺旋体属或选自由以下组成的组的属：葡萄球菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，不动杆菌属分支杆菌属。该检测法优于常用的其它用于测量生存力和用于b.螺旋体和其它细菌的快速药物敏感性试验的检测法，如目前市售的live/deadbaclight生存力测定(invitrogen，carlsbad，ca)。此处所使用的术语“生存力测定”是指确定细胞维持或恢复生存力的能力的测定，如增长的能力。
在其它实施例中，本公开主题提供了一种用于评估来自疏螺旋体属的细菌的生存力的方法，所述方法包括：(a)获得包含来自疏螺旋体属的细菌细胞的培养物；(b)通过使用sybrgreeni/碘化丙啶测定实施培养物内细菌细胞的生存力测定，所述sybrgreeni/碘化丙啶测定基于指示活细菌细胞的绿色荧光与指示死亡细菌细胞的红色荧光的比值，包括：(i)将所述培养物与包含sybrgreeni和碘化丙啶的染色混合物混合；(ii)使培养物和染色混合物在黑暗中孵育；(iii)确定培养物的荧光强度，并在测量绿色荧光的535nm处与测量红色荧光的635nm处染色混合物；以及(iv)计算绿色荧光与红色荧光的比值；并且其中，绿色荧光与红色荧光的比值大于约7意味着细菌细胞是活的。
在一些实施例中，第一颜色是绿色，第二颜色是红色或橙色。在其它实施例中，第一试剂为sybrgreeni而第二试剂为碘化丙啶。在另外的实施例中，sybrgreeni以约0.1x至约100x的浓度范围存在于培养物中，而碘化丙啶则以约0.1mm至约5mm的浓度范围存在于培养物中。在另外的实施例中，培养物中sybrgreeni的浓度为10x，并且碘化丙啶的浓度为2mm。
在一些实施例中，所述培养物还包括bsk-h培养基。在其它实施例中，用所述混合物孵育所述培养物的步骤进行约15分钟。在另外的实施例中，孵育的步骤在黑暗中实施。
疏螺旋体属是螺旋体门的细菌属。所述伯氏疏螺旋体广义的复合物包括至少18种基因种。该属中的细菌的非限制性实例包括：b.伯氏疏螺旋体，b.伽氏疏螺旋体，b.阿氏疏螺旋体，b.americana，b.carolinensis，b.lusitaniae，b.japonica，b.miyamotoi和b.sinica。在一些实施例中，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，所述伯氏疏螺旋体包括选自以下组的形态形式：螺旋形式，原生质球形式，囊性或圆体形式，小菌落形式，生物膜样和生物膜形式，以及它们的组合。
在一些实施例中，所述方法以高通量方式实施，例如，用于药物筛选。意外地发现了在某些实施例中本发明所述的方法可在没有洗涤步骤的情况下使用，并用于高通量筛选。也就是说，所述方法可用于评估细菌的生存力、对抗微生物剂的敏感性，在没有洗涤的情况下以及直接以高通量方式用于药物筛选。在其它实施例中，高通量方式使用至少一种多孔微板。合适的多孔微量培养板的非限制性实例包括但不限于：6孔微量培养板，24孔微量培养板，96孔微量培养板，384孔微量培养板和1536孔微量培养板。在其它实施例中，所述多孔微孔板包含96孔微量培养板。
在一些实施例中，本公开主题提供了一种用于评估来自疏螺旋体属的细菌对至少一种抗微生物剂的敏感性的方法，该方法包括：(a)建立细菌培养物，包含从疏螺旋体属分离的细菌；(b)在合适的条件下孵育所述培养物用于出现细菌生长，采用：(i)至少一个剂量的至少一种抗微生物剂；和(ii)染色混合物，包含第一试剂，该第一试剂发射第一颜色的荧光，指示培养物里的活细菌，并包含第二试剂，该第二试剂发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示培养物里的死细菌，其中，第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值指示培养物内活细菌的百分比；以及(c)在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的一段时间后，通过计算(b)(ii)中的比值来评估来自疏螺旋体属的细菌对至少一种抗微生物剂的敏感性，无需细菌生长，如果(b)(ii)中的比值在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的一段时间之后保持相同或降低，那么其中所述细菌被评估为对至少一种抗微生物剂敏感的，并且，如果(b)(ii)中的比值在暴露于至少一个剂量的至少一种抗微生物剂的该段时间之后增加了，那么所述细菌被评估为对至少一种抗微生物剂抗性的。
在其它实施例中，本公开主题提供了一种用于筛选能抑制来自疏螺旋体属的细菌的化合物的方法，所述方法包括：(a)获取对数期或稳定期的细菌培养物，其包含来自疏螺旋体属的细菌；(b)使所述培养物与测试化合物接触；(c)通过使用sybrgreeni/碘化丙啶测定法，进行培养物内细菌细胞的生存力测定，所述sybrgreeni/碘化丙啶测定法基于指示活细菌细胞的绿色荧光与指示死亡细菌细胞的红色荧光的比值，包括：(i)将所述培养物与包含sybrgreeni和碘化丙啶的染色混合物混合；(ii)使培养物和染色混合物在黑暗中孵育；(iii)确定培养物的荧光强度，并在测量绿色荧光的535nm处与测量红色荧光的635nm处染色混合物；(iv)计算绿色荧光与红色荧光的比值；以及(v)将所述绿色荧光与红色荧光的比值与具有已知量的活和死细菌细胞数的一对照组的绿色荧光与红色荧光的比值进行比较，以确定培养物内活细菌细胞和死细菌细胞的百分比；并且(d)将培养物内用测试化合物处理的活细菌细胞的百分比与在相同条件下但无测试化合物的情况下的对照组进行比较；其中，与在相同条件下但无测试化合物的情况下的对照组中活细菌细胞或死菌细胞的百分比相比，采用了测试化合物的培养物内的活细菌细胞百分比的显著降低和/或死亡细菌细胞百分比的显著增加，表示所述测试化合物能够抑制细菌细胞。
在一些实施例中，所述方法还包括确定对于所述至少一种抗微生物剂的最小抑制浓度中断点。在其它实施例中，第一颜色是绿色，第二颜色是红色或橙色。在另外的实施例中，第一试剂是sybrgreeni，且第二试剂是碘化丙啶。在另外的实施例中，培养物内的sybrgreeni的浓度为约10x，并且碘化丙啶的浓度为约2mm。在其它实施例中，所述培养物还包含bsk-h培养基。
在一些实施例中，所述细菌是伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，所述伯氏疏螺旋体包含选自由以下组成的组的形态形式：螺旋形式，原生质球形式，囊性或圆体形式，小菌落形式，生物膜样和生物膜形式，以及它们的组合。
在一些实施例中，所述方法以高通量形式实施。在其它实施例中，所述高通量形式使用至少一种多孔微板。在另外的实施例中，所述多孔微板包括96孔微孔板。
在一些实施例中，本公开主题提供了一种用于识别候选试剂的方法，所述候选试剂能够抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活，所述方法包括：(a)建立培养物，包含从疏螺旋体属分离的细菌；(b)使所述培养物与测试试剂接触；(c)在测试试剂的存在下，在不同的时间跨度对不生长的持留菌以连续时间推移的方式并且以增长独立的方式进行快速抗微生物药敏试验来评估培养物内细菌的生存力，并与对照培养物中细菌的生存力进行比较，所述对照培养物缺少用于药物筛选的测试试剂，以使对测试试剂的敏感性可以快速确定，而不需要像在常规抗生素敏感性试验中那样依赖细菌生长，其中，评估培养物内细菌的生存力包括：(i)用染色混合物孵育所述培养物，所述染色混合物包含：第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示活细菌，和第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示死亡的细菌；(ii)计算第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值，其中所述比值指示培养物里的活细菌的百分比；以及(d)如果对于培养物计算的比值比对于对照组培养物类似计算的比值要小，则识别所述测试试剂为候选试剂，所述候选试剂能够抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活。如此处所使用的，“类似计算的比值”的意思是，对照培养物的比值采用与计算细菌培养物的比值相同的方式计算得到。
在一些实施例中，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，培养物包含稳定期培养物。在其它实施例中，所述稳定期培养物包含非复制持留菌细胞。在其它实施例中，所述稳定期培养物包含选自以下组成的组的形态形式：圆形体形式，浮游形式和生物膜形式。
在一些实施例中，第一颜色是绿色，第二颜色是红色或橙色。在其它实施例中，第一试剂是sybrgreeni，而第二试剂是碘化丙啶。在其它实施例中，培养物内sybrgreeni的浓度大约是10x，并且碘化丙啶的浓度大约是2mm。在其它实施例中，培养物还包含bsk-h培养基。
在一些实施例中，所述方法以高通量形式实施。在其它实施例中，所述高通量形式使用至少一种多孔微板。在其它实施例中，所述多孔微板包括96孔微孔板。
在某些实施例中，所述方法包括进行微观计数再筛选，以确认至少一种测试试剂是候选试剂，用于抑制细菌的生长或存活。
如本文所使用的，术语“抑制”或者“显著减少”的意思是，例如，在培养物中或在受试者中的细菌的生长和/或存活相较于未处理的对照培养物或受试者下降，抑制，减弱，减少或阻滞了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或甚至100％。本文中所述抑制细菌的“存活”是指杀死细菌或减少活细菌细胞计数。在一些实施例中，细菌的生长被抑制超过约50％。在其它实施例中，用试验化合物处理后的培养物内活细菌细胞的百分比，要比在对照组中的活细菌细胞的百分比少约50％，所述对照组在相同条件下，但其中不存在测试化合物。在其它实施例中，稳定期的细菌培养物包含非复制持留菌细胞。另外，如此处所使用的术语“显著增加”的意思是增加了至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％或甚至100％。
所述测试化合物(与本文中的试剂同义使用)可以是测试抑制活性需要的，尤其是测试抗持留菌活性需要的任何化合物或药物。术语“抗持留菌活性”的意思是该化合物具有抗那些在接触或施用一个疗程的抗生素之后可能仍然存在于培养物或受试者内的细菌细胞的抑制活性。持留性细菌可以逃避宿主免疫清除，并导致受试者内慢性持续性感染。测试化合物可以是已知化合物，如已识别的药物，发现在至少一种疾病或病症中有效，或者可为未知化合物，其不被认为在任何疾病或病症中有效。在一些实施例中，所述测试化合物是已知的化合物，其已获卫生管理机构(例如fda或ema)批准用于除了治疗慢性持续性莱姆病之外的指示。在一些实施例中，所述测试化合物是一种已知其显示针对除了那些来自疏螺旋体属之外的细菌的抗生素活性的化合物。在一些实施例中，所述测试化合物是一种已知化合物，其在以前没有被报道显示有针对非复制的持留菌形式的细菌的抗生素活性。
在一些实施例中，所述方法以高通量的形式实施。通过“高通量”形式的意思是，许多样品，如测试化合物，可一次进行测试。例如，在其它实施例中，高通量形式使用至少一块96孔板。当然，普通技术人员会理解的是，更大或更小的微孔板可被用于高通量形式，以实施本发明所述的方法。
如本文所使用的，术语“细菌培养物”或“培养物”是指，生长在培养基中的细菌，所述培养基有利于这些细菌的生长。所述细菌培养物可以在任何类型的容器中找到，如烧瓶，试管，微孔板等。一般地，细菌具有不同的生长阶段。当细菌群体首先进入允许生长的高营养环境的时候，细胞需要适应它们的新环境。生长的第一阶段为滞后期，是一段生长缓慢的时期，当细胞适应高营养环境且准备快速增长的时候。滞后期具有很高的生物合成率，这是由于生产出了快速生长所需的蛋白质。生长的第二阶段为对数期，也称为对数或指数相，其中所述细菌经历快速指数生长。在对数期过程中，营养物以最大速度新陈代谢，直至营养物之一被耗尽，并开始限制增长。生长的第三阶段为稳定期，且是由被耗尽的营养物引起的。在一些实施例中，在“稳定期”的细菌培养物的意思是，培养物内的细菌具有大致相等的出生率和死亡率。本文所使用的术语细菌的“生长形式”一般指在滞后或对数期的而非稳定期的细菌。在一些实施例中，稳定期细菌培养物已经生长了约7天。在其它实施例中，所述稳定期细菌培养物包含非复制持留菌细胞。“非复制持留菌细胞”的意思是，进入停止复制的状态且能够耐受抗生素的细菌细胞。
ii、用于识别抗持留菌活性和药敏评价的试剂盒
本公开主题还涉及用于实施本发明所述方法的试剂盒。通常，目前公开的试剂盒包含一些或所有组分，试剂，供应品等，以实施根据本公开主题的一种方法。在一些实施例中，术语“试剂盒”是指任何预期的任何制品(例如，一个包装或容器)，包含有来自疏螺旋体属的细菌和有效量的试剂，用于实施目前公开的测定方法。所述试剂盒也可包括用于实施本发明所述方法的一组特定指令。在其它实施例中，本公开主题提供了一种用于筛选能够抑制来自疏螺旋体属的细菌的药物的试剂盒，该试剂盒包含来自疏螺旋体属的细菌细胞和用于实施目前公开的测定方法的试剂。
相应地，在一些实施例中，本公开主题提供了一种用于筛选能抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活的至少一种试剂的试剂盒，该试剂盒包含来自疏螺旋体属的细菌的分离的非复制持留菌形式和用于进行sybrgreeni/碘化丙啶生存力测定的试剂。
在其它实施例中，本公开主题提供了一种用于筛选至少一种候选试剂的试剂盒，所述候选试剂能够抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活，所述试剂盒包括(a)分离的细菌群体，包含来自疏螺旋体属的细菌或者其培养物；(b)染色混合物，包含：(i)第一试剂，其发射第一颜色的荧光，指示活细菌细胞，和(ii)第二试剂，其发射与第一颜色形成对比的第二颜色的荧光，并且指示死亡的细菌细胞；其中，当将染色混合物与细菌群体或其培养物一起孵育时，计算的第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值指示群体或其培养物内活细菌的百分比；以及(c)使用(a)中的细菌和(b)中的染色混合物的指令，以筛选至少一种候选试剂，所述候选试剂能抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活。
在一些实施例中，所述试剂盒还包含至少一种测试试剂，以筛选其抑制来自疏螺旋体属的细菌生长或存活的能力。在其它实施例中，所述试剂盒还包含用于将细菌群体或其培养物与至少一种测试试剂相接触的指令。在其它实施例中，该试剂盒进一步包含用细菌群体或其培养物孵育染色混合物的指令。在进一步的实施例中，该试剂盒还包含评估细菌在群体或其培养物中的生存力的指令。在另外的实施例中，所述试剂盒还包含用于计算第一颜色的发射荧光强度与第二颜色的发射荧光强度的比值的指令。
在一些实施例中，计算出的强度比指示在暴露于至少一种测试试剂一段时间之后群体或培养物中的活细菌百分比。在特定实施例中，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，所述细菌选自由以下组成的组：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯杆菌，鲍氏不动杆菌以及结核分枝杆菌。
在一些实施例中，第一试剂发出绿色荧光，而第二试剂发出红色或橙色荧光。在其它实施例中，所述第一试剂为sybrgreeni，并且所述第二试剂为碘化丙啶。在另外的实施例中，所述试剂盒还包括在筛选中以约10x的浓度使用sybrgreeni和在筛选中以约2mm的浓度使用碘化丙啶的指令。
在一些实施例中，本公开的主题提供了一种用于评估来自疏螺旋体属的细菌培养物生存力和其对于至少一种能抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长或存活的试剂(例如，目前莱姆病的抗生素或任何新的药剂)的敏感性的试剂盒，所述试剂盒包含：来自疏螺旋体属的细菌的培养物，用于实施sybrgreeni/碘化丙啶测定的试剂，以及可选的至少一种测试试剂。
iii、用于抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长和/或存活的方法
本公开主题提供了用于杀死、抑制和/或预防细菌细胞生长的方法。在一些实施例中，本发明提供了一种用于抑制来自疏螺旋体属的细菌的生长和/或存活的方法，所述方法包括：将来自疏螺旋体属的细菌与有效量的以下物质相接触：(a)选自下组中的至少一种化合物：达托霉素，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，硝呋醛肟，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，头孢甲肟，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素和链霉素；(b)选自下组中的至少一种化合物：道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少两种化合物的组合，包括：(i)选自下组中的第一化合物：达托霉素，头孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧哒嗪；和(ii)选自下组的不同于第一化合物的第二化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三种化合物的组合，包括：(i)作为第一化合物的多西环素；(ii)选自下组中的第二化合物：达托霉素或头孢哌酮；和(iii)不同于第二化合物的选自下组中的第三化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。在其它实施例中，(c)(ii)和(d)(iii)中的化合物可以是目前使用的治疗莱姆病的任何一线药物。在另外的实施例中，本公开的方法包含施用(a)，(b)，(c)和(d)中所述化合物的任何组合，例如，至少两种化合物，包含选自(a)，(b)，(c)和(d)的第一化合物和选自(a)，(b)，(c)和(d)的不同于第一化合物的第二化合物；至少三种化合物，包含选自(a)，(b)，(c)和(d)的第一化合物，选自(a)，(b)，(c)和(d)的不同于第一化合物的第二化合物和选自(a)，(b)，(c)和(d)的不同于第一或第二化合物的第三化合物，等等。
在一些实施例中，(b)中的至少一种化合物选自由以下组成的组：道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；以及诺加霉素。在其它实施例中，(c)中的至少两种化合物的组合为达托霉素和多西环素。在另外的实施例中，(c)中的至少两种化合物的组合是达托霉素和头孢哌酮。
在一些实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和头孢哌酮。在另外其它实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和磺胺甲氧哒嗪。在其它实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和氯法齐明。在另外的其它实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和羧苄青霉素。在进一步的实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素和氯法齐明。在另外的实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素和磺胺甲氧哒嗪。在其它实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素和咪康唑。
在一些实施例中，所述细菌是伯氏疏螺旋体。在其它实施例里，所述细菌包含复制形式的伯氏疏螺旋体，非复制持留菌形式的伯氏疏螺旋体，以及复制形式的伯氏疏螺旋体和非复制持留菌形式的伯氏疏螺旋体的组合。在另外的实施例中，该细菌包含选自以下组的伯氏疏螺旋体的形态形式：圆形体形式，浮游形式，生物膜形式。在其它实施例内，所述细菌选自由以下组成的组：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肺炎克雷伯杆菌，鲍氏不动杆菌，以及结核分枝杆菌。在进一步的实施例中，所述接触发生在体外或体内。
本文所使用的术语“接触”是指，导致本发明所述的至少一种化合物物理接触至少一种细菌细胞或环境的任何动作，至少一种细菌细胞驻留在所述环境中(例如培养基)。
iv、治疗莱姆病的方法
在一些实施例中，本公开主题提供了治疗莱姆病的方法，例如，在患有治疗莱姆病后综合征(ptlds)和/或抗生素难治性莱姆关节炎的受试者中治疗。已经发现，有效量的特定抗生素与有效量的至少一种其它特定抗生素相结合能够杀灭非复制持留菌细胞。在其它实施例中，该方法抑制受试者中的细菌感染，例如伯氏疏螺旋体感染的受试者。
因此，在一些实施例中，本公开主题提供了一种在有需要的受试者中治疗莱姆病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的：(a)选自下组中的至少一种化合物：达托霉素，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，硝呋醛肟，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，头孢甲肟，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素和链霉素；(b)选自下组中的至少一种化合物：道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；(c)至少两种化合物的组合，包括：(i)选自下组中的第一化合物：达托霉素，头孢哌酮，咪康唑，以及磺胺甲氧哒嗪；和(ii)选自下组的不同于第一化合物的第二化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌；或者(d)至少三种化合物的组合，包括：(i)作为第一化合物的多西环素；(ii)选自下组中的第二化合物：达托霉素或头孢哌酮；和(iii)不同于第二化合物的选自下组中的第三化合物：达托霉素，阿莫西林，头孢呋辛，头孢曲松，咪康唑，多西环素，羧苄青霉素，氯法齐明，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，磺胺氯达嗪，硝呋诺酮，呋喃妥因，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，氯四环素，头孢甲肟，头孢美唑，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素，链霉素，道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。在其它实施例中，(c)(ii)和(d)(iii)里的化合物可以是目前使用的治疗莱姆病的任何一线药物。在另外的实施例中，本公开的方法包括施用(a)，(b)，(c)和(d)中所述化合物的任何组合。
在一些实施例中，(b)中的至少一种化合物选自由以下组成的组：道诺霉素3-肟，二甲基道诺霉素，柔红霉素，9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-，以及诺加霉素。在其它实施例中，(c)中的至少两种化合物的组合为达托霉素和多西环素。在另外进一步的实施例中，(c)中的至少两种化合物的组合为达托霉素和头孢哌酮。
在一些实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和头孢哌酮。在其它实施例内，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和磺胺甲氧哒嗪。在另外的实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和氯法齐明。在进一步的实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：达托霉素，多西环素和羧苄青霉素。在另外的实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素和氯法齐明。在一些实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素和磺胺甲氧哒嗪。在其它实施例中，(d)中的至少三种化合物的组合为：头孢哌酮，多西环素与咪康唑。
在一些实施例中，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，所述细菌包含复制形式的伯氏疏螺旋体，非复制形式的伯氏疏螺旋体，以及复制形式的伯氏疏螺旋体和非复制形式的伯氏疏螺旋体的组合。在另外的实施例中，所述细菌包含选自由以下组成的组的伯氏疏螺旋体的形态形式：圆形体形式，浮游形式和生物膜形式。在其它实施例中，所述受试者已经或被怀疑患有治疗莱姆病后综合征(ptlds)和/或抗生素难治性莱姆关节炎。
在某些实施例中，本公开的主题提供了一种在有需要的受试者中治疗莱姆病的方法，该方法包含：(a)向受试者施用有效量的至少两种试剂的组合，所述至少两种试剂包括：(i)至少一种试剂抑制来自疏螺旋体属的复制形式的细菌的生长和/或存活；以及(ii)至少一种试剂抑制来自疏螺旋体属的非复制持留菌形式的细菌的生长和/或存活。在其它实施例中，所述方法还包括选自以下的一个或多个步骤：(b)从受试者获得生物样品，所述生物样品包含一种或多种形态形式的来自疏螺旋体属的细菌；(c)分离至少一种形态形式的细菌；(d)培养所分离的细菌；并且(e)评估培养的细菌对至少一种抑制复制形式的细菌的生长和/或存活的试剂，至少一种抑制非复制的持留菌形式的细菌的生长和/或存活的试剂，或二者的敏感性。
在一些实施例中，抑制复制形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂选自由以下组成的组：β-内酰胺，破坏dna的抗生素，以及能量抑制剂。在其它实施例中，抑制复制形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂采用一种培养物在体外孵育，所述培养物包含：来自疏螺旋体属的非复制的持留菌形式的细菌，抑制复制形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂，抑制培养物内非复制性持留菌细菌的小于25％的群体的生长和/或存活。在另外的实施例内，抑制复制形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂，选自由以下组成的组：多西环素，头孢哌酮，羧苄青霉素，氯法齐明以及它们的组合。在进一步的实施例中，抑制非复制持留菌形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂，是含蒽醌的化合物。在进一步的实施例中，抑制非复制持留菌形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂采用一种培养物在体外进行孵育，所述培养物包含：来自疏螺旋体属的非复制持留菌形式的细菌，抑制非复制持留菌形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂，抑制培养物内非复制持留菌形式的细菌的大于约50％的群体的生长和/或存活。在一些实施例中，至少一种试剂抑制培养物内非复制持留菌形式的细菌的大于约75％的群体的生长和/或存活。在一些实施例里，至少一种试剂比目前用于莱姆病的抗生素更好地抑制生长和/或存活，所述目前用于莱姆病的抗生素例如为：多西环素，阿莫西林，头孢呋辛，或者头孢曲松，甲硝唑，替硝唑，以及它们的组合。在其它实施例中，至少一种试剂比目前用于莱姆病的抗生素更好地抑制生长和/或存活，并且该试剂可以使用本公开的方法来确定。
在某些实施例中，抑制非复制性持留菌形式的细菌的生长和/或存活的至少一种试剂选自由以下组成的组：达托霉素，青蒿素，环丙沙星，磺胺醋酰，磺胺甲氧哒嗪，硝呋醛肟，磷霉素，金霉素，磺胺噻唑，氯法齐明，头孢甲肟，头孢哌酮，卡波霉素，头孢替安，头孢吡肟，阿莫地喹，磷霉素和链霉素；道诺霉素3-肟；二甲基道诺霉素；柔红霉素；9，10-蒽二酮，1-羟基-4-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-，蒽-9，10-二酮，1，5-双〔3-〔〔(2-羟乙基)氨基〕丙基〕氨基〕-9，10-二氢-；诺加霉素；派洛宁b；n-烯丙基-2-(甲硫基)[1，3]噻唑并[5，4-d]嘧啶-7-胺；嘌呤霉素；rhodomycina；chaetochromin，9，10-蒽二酮，1，4-二羟基-2-[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-；灵菌红素；丝裂霉素；纳紫霉素；9-羟基-2-(2-哌啶基乙基)乙酸玫瑰酯；n-[3-(2-吡啶基)异喹啉-1-基]-2-吡啶甲脒；萘-1，4-二酮，2-氯-5，8-二羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-；9h-噻吨-9-酮，1-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-7-羟基-4-甲基-，一水合物；更生霉素；大黄素；(5，8-二羟基-1，4-二氧代-1，4-二氢萘-2，3-二基)二甲烷二基二氨基甲酸酯；1-苯胺甲酰胺，n-[2-(二甲基氨基)乙基]-6，9-二甲氧基-；(5-苯基-1，3-噻唑-2-基)甲醇；3，3’，4’，7-四羟基黄酮；苯甲酸，2-羟基-(2，6-吡啶二基二亚乙基)二酰肼，镍络合物；1-(1，2-二氢-5-苊基)-n-羟基-1-苯基甲亚胺；2-甲基-4，4’-[(4-亚氨基-2，5-环己二烯-1-亚基)亚甲基]二苯胺；3，3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青碘化物；以及1，8-二(苯硫基)蒽醌。
在一些实施例中，所述细菌为伯氏疏螺旋体。在其它实施例中，所述细菌包含复制形式的伯氏疏螺旋体，非复制持留菌形式的伯氏疏螺旋体，以及复制形式的伯氏疏螺旋体和非复制持留菌形式的伯氏疏螺旋体的组合。在另外的实施例中，所述细菌包含选自由以下组成的组的伯氏疏螺旋体的形态形式：圆形体形式，浮游形式和生物膜形式。
本文所使用的术语“抗生素”是指，具有杀死或抑制细菌生长的能力的化合物，特别是来自疏螺旋体属的细菌，包括但不限于：疏螺旋体属，葡萄球菌属，埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，不动杆菌属和分枝杆菌属。更一般而言，一种抗菌剂为一种杀死微生物或抑制其生长的试剂。抗菌药物可根据它们主要针对的微生物进行分组。例如，抗生素用于抗细菌。如此处所使用的术语“β-内酰胺”或“β-内酰胺抗生素”指的是具有β-内酰胺环作为其核心结构的一部分的抗生素，如青霉素和青霉素衍生物(青霉烷类)，头孢菌素(头孢类)，单环β-内酰胺类以及碳青霉烯类。这些抗生素中的多种都是通过抑制细菌细胞壁的生物合成而发挥作用。
在一些实施例中，所述受试者已经或被怀疑患有治疗莱姆病后综合征(ptlds)和/或抗生素难治性莱姆关节炎。通过本发明所述方法治疗的受试者在其许多实施例中理想地为人类受试者，虽然应当理解的是，本文所述的方法对所有脊椎动物物种都有效，所有脊椎动物物种皆意在被包涵在术语“受试者”中。因此，“受试者”可包括用于医学目的的人类受试者，例如，用于治疗现有的疾病，障碍，病症，或者用于预防性治疗，即用于预防疾病，障碍，病症的发作；或者用于医药、兽医或发展用途的动物受试者。合适的动物受试者包括哺乳动物，包括但不限于：灵长类，例如，人，猴，猿，长臂猿，黑猩猩，猩猩，猕猴等等；牛科动物，例如，牲畜牛，野牛等等；绵羊类动物，例如，绵羊等；山羊类动物，例如，山羊等等；猪类动物，例如，家猪，野猪等等；马科动物，例如，马，驴，斑马等等；猫科动物，包括野猫和家猫；犬科动物，包括狗；兔形目动物，包括兔子，野兔等等；以及啮齿动物，包括小鼠，大鼠，豚鼠等等。动物可以为转基因动物。在一些实施例中，所述受试者为人类，包括但不限于：胎儿，新生儿，婴儿，少年和成人受试者。此外，“受试者”可包括患有罹患或怀疑患有疾病、障碍或病症的患者。因此，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。受试者也包括动物疾病模型(例如，在实验中使用的大鼠或小鼠等)。
在一些实施例中，术语“有效量”指的是，抑制或杀死细菌细胞所需的抗生素或化合物的量。在其它实施例中，术语“有效量”，治疗剂的“治疗有效量”指的是，引起期望的生物应答所必需的试剂的量。如本领域技术人员会理解的，试剂的有效量可以根据这些因素而变化：期望的生物学终点，待递送的药剂，药物组合物的组合，靶组织或细胞等。更具体的是，术语“有效量”是指足以产生所需效果的量，例如，以降低或改善严重性，持续时间，进展或疾病、障碍或病症的发作，或者其一种或多种症状；防止疾病、障碍或病症的发展，导致疾病、障碍或病症的消退；防止与疾病、障碍或病症相关的症状的复发，发展，发作或进展，或者增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。在特定的实施例中，所述疾病、障碍或病症为莱姆病。
此处所使用的术语“处理”，“治疗”等的意思是，下降，抑制，减弱，减少或阻滞疾病、障碍或病症的根本原因，或者稳定疾病、障碍或病症和/或与其相关的症状的发展或进展。此处所使用的术语“处理”，“治疗”等可以指治愈性治疗，预防性治疗和防止性治疗。所述处理、给药或治疗可以是连续的或间歇的。连续处理、给药或治疗是指在至少每天的基础上连续一天或多天进行不间断的治疗。间歇处理或给药，或者以间歇方式处理或给药，是指：治疗是不连续的，但是，而是周期性循环的。根据本发明所述方法的处理可导致疾病、障碍或病症的完全缓解或治愈，或者部分改善疾病、障碍或病症的一种或多种症状，并且可以是临时的或永久的。术语“处理”也意在包括预防，治疗和治愈。
术语“组合”以其最广泛的含义被使用，并且意思是，受试者施用至少两种试剂，例如，一种抗生素和一种或多种抗菌剂。更具体地，术语“组合”指伴随施用两种(或多种)活性剂，用于治疗，例如，具有异质细菌群体的单个和多个疾病状态，所述异质细菌群体由生长和非生长的或其之间的任何细菌细胞组成。如此处所使用的，活性剂可在单一剂型中被组合并施用，可以独立的剂型同时施用，或者可以独立的剂型在相同或分开的日子里交替或顺序施用。在本公开主题的一个实施例中，活性剂在单一剂型中被组合并施用。在另一实施例中，所述活性剂以独立的剂型施用(例如，其中期望改变一种而不是另一种的量)。单一剂型包括额外的活性剂，用于治疗疾病状态。
进一步地，本文所述的化合物可以单独施用或与辅药组合施用，所述辅药增强化合物的稳定性，在某些实施例中促进含有它们的药物组合物的施用，提供增加的溶解性或分散性，增加抑制活性，提供辅助治疗等，包括其它活性成分。有利地，这种组合疗法使用较低剂量的常规治疗剂，于是避免了当这些试剂作为单一疗法时可能的毒性和发生的不良副作用。
化合物的给药时间可以是变化的，只要实现了这些试剂组合的有益效果。因此，词汇“与……相结合”指的是，同时、依次、或结合其施用一种化合物和至少一种额外的治疗剂，所述额外的治疗剂例如为抗生素或其它化合物。因此，施用了一种化合物与至少一种额外的治疗剂的组合的受试者，能够在同一时间(即同时地)或在不同的时间(即在同一天或不同的日子里以任何顺序依次地)接受所述化合物和所述至少一种额外的治疗剂，只要在受试者中获得两种试剂的组合的效果即可。
当顺序给药时，试剂可在1分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，120分钟，180分钟，240分钟或更长的时间内一个接一个地施用。在其它实施例中，顺序施用的试剂可在1天，5天，10天，15天，20天或更多天内一个接一个地施用。当所述化合物和至少一种额外的治疗剂被同时施用时，它们可作为不同的药物组合物施用给受试者，每个都包含化合物或至少一种额外的治疗剂，或者，它们可作为单一的药物组合物施用给受试者，含有所有的试剂。
当组合施用时，引起特定的生物反应的每个试剂的有效浓度可小于单独施用时每个试剂的有效浓度，从而允许一种或多种试剂的剂量相对于如果该试剂作为单一试剂施用而需要的剂量减少。多试剂的效果可能，但不必是，相加或协同。所述试剂可以施用多次。
在一些实施例里，当组合施用时，两种或多种试剂可以具有协同效应。如本文所使用的，术语“协同作用”，“协同”，“协同地”以及其类似表述，如“协同效应”或“协同组合”或“协同组合物”是指这样的情况：化合物或至少一种额外的治疗剂的组合的生物活性要大于单独施用时各个试剂的生物活性的总和。
协同作用可以用“协同指数(si)”来表示，其通常可以通过f.c.kull等人(appliedmicrobiology9，538(1961))描述的方法测定，其由以下公式计算出比率：
qa/qa+qb/qb＝协同指数(si)
其中：
qa是单独作用的组分a的浓度，其产生相对于组分a的终点；
qa是混合物中的组分a的浓度，其产生终点；
qb是单独作用的组分b的浓度，其产生相对于组分b的终点；
qb是混合物中的组分b的浓度，其产生终点；
通常，当qa/qa和qb/qb的和大于1时，则指示拮抗作用。当它们的和等于1时，指示相加性。当它们的和小于1时，则显示了协同作用。si越低，由该特定混合物显示的协同作用则越大。因此，“协同组合”具有比基于单独使用时观察到的单个组分的活性可预期的更高的活性。进一步地，“协同有效量”的组分是指，例如在存在于组合物的另一种治疗剂中引起协同效应所需的组分的量。
v、一般定义
在整个说明书和权利要求书中，术语“包含”，“含有”以一种非排他性意义被使用，除非上下文另有要求。同样地，术语“包括”及其其语法变体旨在是非限制性的，以使得列出的名单中的项目并不排除其他类似的项目，其他类似的项目可以替换或添加到列出的项目中。
实施例
以下实施例已经包含向本领域普通技术人员提供指导以实施当前公开的主题的代表性实施例。根据本公开和本领域的一般水平的技术，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且在不脱离当前公开的主题的范围的情况下可以采用多种改变、修改和变化。以下的合成描述和具体实施例仅意在用于说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制本公开的化合物通过其它方法制成。
实施例
以下实施例已经包含向本领域普通技术人员提供指导以实施当前公开的主题的代表性实施例。根据本公开和本领域的一般水平的技术，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且在不脱离当前公开的主题的范围的情况下可以采用多种改变、修改和变化。以下的合成描述和具体实施例仅意在用于说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制本公开的化合物通过其它方法制成。
实施例1
鉴定伯氏疏螺旋体的新型抗抑郁活性的方法
细菌菌株、培养基和培养物：伯氏疏螺旋体菌株b31从americantypetissuecollection获得。将伯氏疏螺旋体在含有6％兔血清(sigma-aldrich，st.louis，mo)的bsk-h培养基(himedialaboratoriespvt.ltd.)中培养。所有培养基用0.2-μm过滤器过滤灭菌。将培养物在无抗生素的无菌50-ml封闭锥形管(bdbiosciences，sandiego，ca)中进行33℃温育。7天后，将100μl稳定期伯氏疏螺旋体培养物(1×106个细胞)转移到96孔组织培养微量培养板中用药物进行筛选。
显微技术：在配备有微分干涉对比(dic)和落射荧光照明的nikoneclipsee800显微镜上检查样品，并用spot滑块彩色照相机记录。通过使用细菌计数室(hausserscientificpartnership，horsham，pa)和dic显微镜直接计数进行细胞增殖测定。为了测定伯氏疏螺旋体的生存力，进行sybrgreeni/pi测定或live/deadbaclight细菌生存力测定。通过使用细菌计数室和落射荧光显微镜计数这些细胞中活(绿色)和死(红色)的伯氏疏螺旋体的比率。
抗生素和fda批准的药物文库：将多西环素、阿莫西林、甲硝唑、氯法齐明、酮康唑、咪康唑、阿司匹林、多粘菌素b(pmb)和磺胺甲恶唑(smx)(均购自sigma-aldrich)标准研究所，2007)形成库存溶液。所有抗生素原液通过0.2μm过滤器过滤灭菌。然后将所述原液预稀释到500-m预稀释的原液中并储存在-20℃环境中。将约翰霍普金斯临床化合物文库(jhccl)(chong等人，2006)中的每种药物制成具有dmso的10-mm储备溶液。将储备溶液排列在总共24个96孔板中，留下用于对照的每个板中的第一和最后一列。将这些主平板中的每种溶液用pbs稀释以制备成500-μm预稀释的平板。每个预稀释板中的第一和最后一列作为空白对照，多西环素对照和阿莫西林对照。将预稀释的药物板密封并储存在-20℃环境中。
抗生素敏感性试验：为了定性测定抗生素的效果，将10μl来自预稀释板或预稀释储备液的各化合物加入筛选板中的伯氏疏螺旋体培养物中。将每孔的终体积调节至100μl。将板密封并置于33℃培养箱中7天。
为了测定筛选平板中的活细胞和死细胞，如之前的研究中所述使用sybrgreeni/pi测定(feng、wang、sh等人，2014)。将sybrgreeni(10,000×原液，invitrogen，carlsbad，ca)(10μl)与30μl碘化丙啶(20mm，sigma-aldrich)混合到1.0ml无菌dh2o中并充分混合。将染色混合物(10μl)加入每个孔中并充分混合。将板在室温下在黑暗中孵育15分钟。在485nm的激发波长下，使用hts7000生物测定读数器(perkinelmerinc.，waltham，ma)对筛选平板的每个孔测量535nm(绿色发射)和635nm(红色发射)波长下的荧光强度。同时，将伯氏疏螺旋体悬浮液(活的和70％异丙醇杀死的)与五种不同比例的活的：死细胞(0∶10，2∶8，5∶5，8∶2，10∶0)混合加入96孔板的孔中。然后将sybrgreeni/pi试剂加入到每一个样品中，并且如上所述使用hts7000plusbioassayreader测量活/死的伯氏疏螺旋体的各比例的绿/红荧光比。通过最小二乘拟合分析获得活细菌百分比与绿色/红色荧光比率之间关系的回归方程和回归曲线。使用回归方程计算平板的每个孔中的活细胞的百分比。一些有效的候选物通过落射荧光显微镜计数进一步证实。
mic测定：使用标准微量稀释法测定在72小时孵育期后抑制伯氏疏螺旋体的可见生长的抗生素最小抑制浓度(mic)(sapi等人，2011；dever等人，1992；boerner等，1995)。将伯氏疏螺旋体细胞(1×105)接种到每孔含有90μl新鲜bsk-h培养基的96孔微量培养板的每个孔中。将每种稀释的抗生素(10μl)加入到培养物中。所有实验一式三份进行。将96孔板密封并置于33℃的培养箱中5天。在孵育后使用sybrgreeni/pi测定细菌计数室细胞增殖情况。
建立用于药物筛选的稳定期模型：在用一些目前使用的抗生素治疗之后，疏螺旋体细胞的代表性形态学变化显示在图1中。在对数期，用阿莫西林和多西环素处理的疏螺旋体细胞采用囊性或圆形体形式。在稳定期，用相同抗生素处理的疏螺旋体细胞采用螺旋形式。伯氏疏螺旋体的这些形态变体对抗生素具有不同的敏感性。
结果
用于测定96孔板中的伯氏疏螺旋体生存力的方法的结果显示，使用绿色荧光与红色荧光比的sybrgreen/碘化丙啶(pi)测定导致活细胞百分比与比值之间的一致的相关性(图2)。当绘制时，发现这是线性比关系(图3)。
图4显示了具有常用的活力测定mtt、xtt、荧光素二乙酸酯测定(fda)，市场销售的live/deadbaclight测定和本公开的sybrgreeni/pi测定的伯氏疏螺旋体b31菌株。sybrgreeni/pi测定具有小于10％的误差，并且约在20分钟内完成。
图5a-5d显示用以下方法观察到的伯氏疏螺旋体b31菌株：(a)荧光显微镜live/deadbaclight染色；(b)sybrgreen/pi染色；(c)fda染色；和(d)由sybrgreen/pi染色的伯氏疏螺旋体生物膜。sybrgreen/pi测定结果显示直接显微镜计数与抗生素暴露相关(图6)。
图7显示了细菌持续性和潜伏感染的阴阳模型的代表图(zhang，2014)。阴阳模型描绘了一个动态和复杂的细菌群体，包括在连续体中处于不同代谢状态的生长(yang，红色)和非生长群体(yin，黑色)，并且这些群体可以相互转化。在不断增长的人口(yang)中，有一小部分非生长或缓慢生长的持久性有机体(yin)，其又含有少量生长细菌。持久性群体再次是异质的，并且由连续体中的各种子群体组成，并且包括持久体的不同层级。在tb的情况下，异烟肼(inh)杀死生长细菌(yang)，利福平(rif)杀死一些生长的细菌和缓慢生长的滞留物，而吡嗪酰胺(pza)仅杀死存留物。不被抗生素杀死的持续性可以恢复为复制形式(逆转)并导致复发。目前莱姆病抗生素多西环素和阿莫西林或头孢曲松仅杀死生长的伯氏疏螺旋体细菌(yang)，并对休眠的非生长性伯氏疏螺旋体(yin)几乎没有活性。阴阳模型提出靶向复制和非复制细胞以更好地治疗持续性细菌感染，包括莱姆病。例如，新鉴定的持久活性药物或抗生素例如达托霉素、氯法齐明、头孢哌酮、卡波霉素、磺胺药物和/或喹诺酮类可与目前使用的莱姆病抗生素如多西环素、阿莫西林和/或头孢曲松一起使用，其对增殖的伯氏疏螺旋体细菌(yang)具有活性，以更有效地治疗所有形式的莱姆病，特别是慢性和持续形式的疾病。
图8伯氏疏螺旋体培养物在bsk-h培养基中生长7天，通过显微镜计数在不同时间点测定细胞数。在5-6天后，伯氏疏螺旋体生长达到峰值(5×107螺旋体/ml)。直到孵育11天(图8a)，细胞密度的显微镜计数保持相对恒定。研究表明，持久性伯氏疏螺旋体可能具有不同的形态，即圆形体(囊肿)和生物膜。这些多种形态的伯氏疏螺旋体可能具有不同的抗生素敏感性(brorson等人，2009；sapi等人，2011)。通过显微镜检查，圆形体和生物膜样集落的比例在稳定期伯氏疏螺旋体培养物中显著增加(图8b)。这些稳定期培养物可以代表不同形态形式的混合群体。选择7天的伯氏疏螺旋体稳定期培养物作为筛选药物的持续模型。
评价稳定期伯氏疏螺旋体的体外抗生素敏感性：以前的研究和临床经验表明多西环素和阿莫西林对伯氏疏螺旋体表现出杀菌活性(hunfeld和brade，2006)。用于莱姆病的常规抗生素如多西环素和青霉素不会杀死螺旋体的囊性形式，但一些研究表明，甲硝唑可以杀死伯氏疏螺旋体的囊性形式(brorson和brorson，1999)。本方法公开的主题公开了这些前线药物(多西环素、阿莫西林和甲硝唑)对对数期和稳定期伯氏疏螺旋体和通过sybrgreeni/pi测定的评价和易感性的作用。用临床常用抗生素治疗显示这些前线药物对对数期伯氏疏螺旋体有效，但对稳定期伯氏疏螺旋体的影响很小(图8c)。显微镜计数的结果与sybrgreeni/pi测定的结果相关。
筛选fda批准的用于针对休眠的伯氏疏螺旋体的有效药物的药物文库：为了筛选对持续伯氏疏螺旋体、稳定期伯氏疏螺旋体起作用的抗生素，用作筛选fda批准的药物文库的持久性模型。同时，将多西环素和阿莫西林添加到每个测试板作为对照药物。对照药物活性的几种测量显示使用sybrgreeni/pi测定的结果显示相对误差小于15％。在所测试的1514种药物中，几十种抗生素被认为具有比临床常用针对伯氏疏螺旋体细菌的抗生素更高的活性(表1)。荧光显微镜计数进一步验证了一些有效的候选药物测量sybr绿色i/pi，他们的协调是好的，最大差异小于20％。
表1.针对稳定期伯氏疏螺旋体多发性硬化症具有良好活性(优于目前的临床药物)的最佳27种活性物
a稳定期伯氏疏螺旋体(7日龄)细胞用药物处理7天。
b通过落射荧光显微镜计数测定残留的活的伯氏疏螺旋体。
c根据回归方程和通过sybrgreeni/pi测定获得的绿色/红色荧光比率计算残留存活的伯氏疏螺旋体。
d实验组和阿莫西林治疗样品的标准t检验的p值。
e实验组和多西环素处理的样品的标准t检验的p值。
基于初步筛选，选择一些活性候选物(具有小于50％的残余活细胞)以通过sybrgreeni/pi测定和显微镜计数进行重新筛选。重新筛选证实了初步筛选的结果。几种fda批准的药物被鉴定显示对稳定期伯氏疏螺旋体具有良好的杀菌活性。一些药物的杀菌活性显着高于前线抗生素多西环素或阿莫西林的杀菌活性(图9)。例如，达托霉素、氯法齐明、卡波霉素、一些头孢菌素抗生素(例如头孢哌酮、头孢噻吩和头孢吡肟)、链霉素和抗疟疾抗生素阿莫地喹，显示出对稳定期伯氏疏螺旋体的相对高的杀菌活性。
代表图显示了稳定期伯氏疏螺旋体菌株b31经达托霉素、头孢哌酮和四环素(图10a-10d)以及卡波霉素和氯法齐明显示(图11)处理后的变化。这些化合物中的一些能阻断蛋白质合成。例如，大环内酯类具有比青霉素或头孢曲松更大的活性，用于伯氏疏螺旋体存留者。碳霉素，一种大环内酯，显示比其他大环内酯类如红霉素具有更高的伯氏疏螺旋体的活性。其他化合物可能损害dna和/或能量，如氯法齐明。化合物也可能阻断dna合成。一些磺胺药物，如塞米松和磺胺异恶唑，对稳定期伯氏疏螺旋体有效，而磺胺甲恶唑也表现出较低的mic(≤0.2μg/ml)。
虽然大多数药物不影响sybrgreeni/pi测定，但一些有色化合物会造成对sybrgreeni/pi测定的干扰。例如，吡磺酸托吡酯和多柔比星通过sybrgreeni/pi测定显示非常高的活性，但是通过显微计数没有观察到杀菌活性。发现这些红色化合物可能使背景变红导致假阳性结果。因此，建议通过其他方法例如显微计数来进行sybrgreeni/pi数据的验证。
mic测试：通过新的sybrgreeni/pi测定和显微镜计数测定一些有效抗生素的mic对稳定期伯氏疏螺旋体的作用。从两种方法获得的结果相同。多西环素、阿莫西林和甲硝唑的mic值(图12)与以前的研究一致(sapi等人，2011；hunfeld和brade，2006)。同时，发现对数期伯氏疏螺旋体对卡泊霉素、头孢哌酮、头孢替安和磺胺甲恶唑非常敏感(图12)。另一方面，甲硝唑、氯法齐明、他唑巴坦、酮康唑、咪康唑对伯氏疏螺旋体的繁殖力影响效果较弱(图12)。
本公开的主题提供了适合于高通量筛选以鉴定新药物和快速评价伯氏疏螺旋体的抗生素敏感性的快速且方便的生存力测定(例如，sybrgreeni/pi)(feng、wang、shi等人，2014)。使用这种快速方法，筛选了fda批准的针对伯氏疏螺旋体的非复制顽固性的活性化合物文库。鉴定了许多药物候选物，其具有对疏螺旋体菌的杀菌活性。
达托霉素是用于治疗革兰氏阳性生物引起的感染的脂肽抗生素。目前公开的数据显示达托霉素在所有活性命中具有针对稳定期伯氏疏螺旋体维生素的最高活性。达托霉素可从多个方面破坏细菌细胞膜功能。它插入膜中，并产生允许细胞泄漏离子的孔，这导致快速去极化，导致膜电位的丧失和细菌细胞的死亡(pogliano等人，2012)。用达托霉素处理的伯氏疏螺旋体细胞在染色后显示几乎所有的红色荧光为螺旋体(图10a)。这个结果表明达托霉素可以破坏伯氏疏螺旋体的细胞膜，导致碘化丙锭渗透到细胞中。显微镜计数显示达托霉素处理后的几个原生质球；不希望受任何一个特定理论的束缚，认为达托霉素可诱导原生质球细胞的裂解。
大环内酯类和酮内酯类药物在以前的研究中被选为莱姆病临床治疗的候选抗生素(hunfeld和brade，2006)。在这里，已经发现卡波霉素、16-元大环内酯，比常规大环内酯类如红霉素和罗红霉素显示出对稳定期伯氏疏螺旋体的更高的杀菌活性。mic数据(图12)显示卡巴霉素也能有效对抗伯氏疏螺旋体。
用β-内酰胺治疗伯氏疏螺旋体是临床上常用的治疗方法(hunfeld和brade，2006)。β-内酰胺可通过破坏细胞壁的肽聚糖层的合成而诱导伯氏疏螺旋体的圆形体繁殖体(kersten等人，1995)。显微镜检查还显示，圆形体繁殖体(brorsen等，2009)大多数是头孢哌酮处理的稳定期伯氏疏螺旋体(图10b)。根据先前研究测量的mic，所有β-内酰胺显示出良好的抗伯氏疏螺旋体增殖的活性。然而，本方法公开的主题显示，β-内酰胺抗生素对稳定期伯氏疏螺旋体细胞的作用存在差异。
头孢哌酮是第三代头孢菌素，似乎是针对稳定期伯氏疏螺旋体的最佳β-内酰胺抗生素，然后是一些第二代头孢菌素，例如头孢替安、头孢美唑和头孢噻肟。如在以前的研究(hunfeld和brade，2006)，第一代头孢菌素显示对稳定期伯氏疏螺旋体的活性非常有限。已经发现头孢菌素对稳定期伯氏疏螺旋体的活性不能根据它们对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的活性谱与这些抗生素的经典代组分完全匹配。这一观察结果可能与伯氏疏螺旋体与普通革兰氏阴性或革兰氏阳性菌的差异有关(
四环素抗生素，特别是多西环素，在临床环境中用作莱姆病的前线药物。这些抗生素具有较低的mic值(hunfeld和brade，2006)，并且对伯氏疏螺旋体的增殖具有良好的抑制活性。有趣的是，发现四环素比多西环素对稳定期伯氏疏螺旋体具有更高的活性。观察到大多数细胞是在由四环素处理的稳定期伯氏疏螺旋体中的圆形体繁殖体(图10c)。伯氏疏螺旋体可能在稳定期或在不利条件下形成不同的形态，而四环素抗生素可能对一些形态细胞例如圆形体(囊肿)细胞无效(sapi等人，2011)。
此外，一些fda批准的抗生素被发现在本公开主题中对稳定期伯氏疏螺旋体具有杀细菌活性。氯法齐最初被开发用于治疗结核病，虽然现在它通常用于麻风病的治疗(arbiser和moschella，1995)。目前公开的数据显示，氯法齐明对稳定期伯氏疏螺旋体有效，尽管氯法齐明的mic相对较高(6.25μg/ml)。此外，一些磺胺类药物，例如亚砜和磺胺异恶唑，被发现对稳定期伯氏疏螺旋体有效，而磺胺甲恶唑显示低mic值(≤0.2μg/ml)。这些有效的抗生素可以被认为是在动物模型和临床研究中进一步药物组合研究的候选物。
总之，使用新开发的sybrgreeni/碘化丙锭(pi)测定法，在富含非复制型持久性细胞的稳定期伯氏疏螺旋体中筛选由约2,000种化合物组成的fda批准的药物文库。从用于治疗其他疾病或病症的现有药物中鉴定了许多对伯氏疏螺旋体存留者具有优异活性的候选药物。这些药物包括达托霉素、氯法齐明、卡波霉素、磺胺药物如磺胺甲恶唑和某些头孢菌素，如头孢哌酮。本方法公开的主题提供了可用于鉴定对疏螺旋体属中的细菌的新的抗持久活性的方法。
实施例2
药物组合对疏螺旋体在体外的存活：消灭
通过使用达托霉素、头孢哌酮和多西环素实现
材料和方法
菌株、培养基和培养物：菌株、培养基和培养物按照实施例1获得和使用。
抗生素：多西环素(dox)、阿莫西林(amo)、头孢哌酮(cefp)、氯法齐明(cfz)、咪康唑(mcz)、多粘菌素b(pmb)、磺胺甲恶唑(smx)、达托霉素(dap)、carbomycin(magnamycina)、乳链菌肽、羧苄青霉素、氧氟沙星、替加环素、羟氯喹、利福平和克拉霉素(sigma-aldrich)溶解在合适的溶剂中(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，2007)。抗生素原液通过0.2μm过滤器过滤灭菌，除了氯法齐明，将其溶解在dsmo(二甲基亚砜)中，不予过滤。然后将储备物储存在-20℃环境中。
显微技术：在配备有微分干涉对比(dic)和表面荧光照明的nikoneclipsee800显微镜上检查样品，并用spot滑块彩色照相机记录。通过使用细菌计数室(hausserscientificpartnership)和dic显微镜直接计数进行细胞增殖测定。进行sybrgreeni/pi测定以评估伯氏疏螺旋体的生存力。通过使用细菌计数室和落射荧光显微镜计数这些细胞，计算活(绿色)和死(红色)伯氏疏螺旋体的比率。捕获每个样品的三个代表性图像用于定量分析。应用imagepro-plus软件测量如先前所述的伯氏疏螺旋体的不同形式(螺旋体、圆形体和小菌落)的生物量(荧光强度)(shopov和williams，2000)。
抗生素暴露测定：为了定性测定抗生素的效果，将10μl来自预稀释板或预稀释储备液的各化合物加入96孔板中的稳定期伯氏疏螺旋体培养物中。对于每种抗生素，将每孔的终体积调节至100μl，浓度为10μg/ml。将板密封并置于33℃培养箱中7天。sybrgreeni/pi生存力测定法用于评估抗生素暴露后的活细胞和死细胞(feng，wang，shi，etal。，2014)。简言之，将10μlsybrgreeni(10,000×储备液，invitrogen)与30μl碘化丙啶(pi，20mm)混合到1.0ml无菌dh2o中。然后，向每个孔中加入10μl染色混合物并充分混合。将板置于室温下黑暗中孵育15分钟，然后在485nm的激发波长下读板，在酶标仪中测量在535nm(绿色发射)和635nm(红色发射)下的荧光强度(hts7000plusbioassayreader，perkinelmerinc.，usa)。使用最小二乘拟合分析，获得活细菌百分比与绿色/红色荧光比率之间关系的回归方程和回归曲线。使用回归方程计算96孔板的每个孔中的活细胞的百分比。经抗生素处理的伯氏疏螺旋体亚种群培养以评估生物体的生存力：在eppendorf管中用药物或药物组合处理七天龄的伯氏疏螺旋体培养物(1×107螺旋体/ml)(500μl)。在33℃下振荡培养7天后，通过离心收集细胞，并用1ml新鲜的bsk-h培养基冲洗，然后重悬于500μl不含抗生素的新鲜bsk-h培养基中。然后将50μl细胞悬浮液转移至1ml新鲜bsk-h培养基中，在33℃下传代培养2周。使用sybrgreeni/pi测定和通过如上所述的显微镜评估细菌计数室(hausserscientificpartnership)的细胞增殖情况。
结果
利用新开发的sybrgreeni/pi生存力测定法，最近针对稳定期伯氏疏螺旋体保留物和27个候选药物筛选了fda批准的药物文库，其分别具有比目前推荐的莱姆抗生素多西环素或阿莫西林更高的活性(实施例1；feng、wang、shi等人，2014)。在前27个确认的药物候选物中，达托霉素、氯法齐明、卡波霉素、磺胺药物(例如磺胺甲恶唑)和某些头孢菌素(例如头孢哌酮)对伯氏疏螺旋体菌具有更高的活性(feng、wang、shi等人，2014)。有趣的是，一些药物候选物，如达托霉素和氯法齐明，对非生长持久剂具有最高活性，对活性生长的具有高mic的伯氏疏螺旋体的活性差，分别为12.5-25μg/ml和6.25μg/ml(feng、wang、shi等人，2014)。尽管这些具有抗持久性的药物候选物在单独使用时可能不具有良好的活性，这是由于其对生长的伯氏疏螺旋体具有差的活性，所以提出了这样的问题，即它们是否可以与另一种抗生素如多西环素一起用于抑制或杀死伯氏疏螺旋体的增殖。这样的组合可以产生莱姆病的更有效的治疗方法。
实验上，由于稳定期培养物包含具有不同形态变体的生长和非生长细菌的混合群体，例如对抗生素耐受的圆形体和小菌落(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sapi等人，2011)，最有可能单一药物不能有效地杀死所有细菌群体，其中包括形态变异体。在本方法公开的主题中，评价一系列药物组合，目的是鉴定出最有效杀死伯氏疏螺旋体培养物的最佳药物组合。
伯氏疏螺旋体培养物具有不同比例的形态变体，包括圆形体和小菌落形式作为培养物的年龄：如先前研究所示(feng、wang、shi等人，2014)，稳定期培养物富集形态变体，例如圆形形式和生物膜样聚集的小菌落，与对数期培养中发现的单个螺旋体相比，以增加的比例形成(图13)。为了更准确地评估不同形态变异形式的比例，检查从不同年龄的培养物取得的每个样品的代表性图像以测量不同形态形式的伯氏疏螺旋体的百分比(表2)。结果发现对数期(3日龄)伯氏疏螺旋体培养物几乎完全由螺旋形式(96％)组成，几乎没有圆形体(4％)且没有聚集的小菌落形式(图13a)。在伯氏疏螺旋体的7天龄的稳定期培养物中，有38％的螺旋形，23％的囊状或圆形，和39％的小集落形式(图13b)。当将伯氏疏螺旋体稳定期培养物培养10天时，小菌落形式的百分比增加至64％，螺旋形和圆形形式分别为20％和16％(图13c)。
对数期和稳定期培养物中的滞留频率：由于伯氏疏螺旋体在琼脂平板上不容易形成菌落，通过计算杀菌抗生素杀死的细菌的百分比来测定抗生素暴露后的持续频率的常规方法不能应用于伯氏疏螺旋体。因此，在培养物暴露于抗微生物剂之后，使用sybrgreeni/pi生存力测定来评估对数期和稳定期培养物中的伯氏疏螺旋体菌的频率。大肠杆菌培养物在暴露于抗生素后用作对照，以验证用于持续频率评估的sybrgreeni/pi生存力测定。暴露于50μg/ml阿莫西林3小时的对数期大肠杆菌培养物的持续频率对于sybrgreeni/pi测定为4.4％，对于cfu测定为0.9％(表1)。使用sybrgreeni/pi测定，对照期培养物的伯氏疏螺旋体的持续频率范围为5-10％，但在用头孢曲松、多西环素或阿莫西林处理的稳定期培养物中的范围为16-27％(表1)。考虑到sybrgreeni/pi生存力测定似乎比用大肠杆菌对照的cfu测定提供持续频率的约5倍(4.4％/0.9％)的过高估计，伯氏疏螺旋体的实际持续频率可能对于伯氏螺旋体对数期培养物为1-2％，对于稳定期培养物为3-5.5％。
小菌落形式比自由、活的螺旋体和圆形体更耐受抗生素：先前的研究表明，稳定期伯氏疏螺旋体对抗生素比对数期培养更具抗性或耐受性(feng、wang、shi等人，2014)。考虑到稳定期培养物的形态变体的异质性(图13b和图13c)，不同变体形式的伯氏疏螺旋体对通常用于莱姆病的抗生素(多西环素，阿莫西林和头孢曲松)的易感性是以更定量的方式确定。有趣的是，发现不同的变体形式对这些抗生素具有不同的易感性(表2)。主要由螺旋形式组成的对数期培养物(3日龄)对这些抗生素高度敏感，而主要包含圆形体和生物膜样微集落形式的稳定期(7天和10天)培养物对这些抗生素的影响，如在抗生素暴露后剩余的活细胞的比例所示(表2)。
图14显示药物(50μg/ml)和组合对稳定伯氏疏螺旋体的影响。图15显示了5种有希望针对疏螺旋体生物膜的药物组合。图16显示药物组合对疏螺旋体生物膜的活性。
当10天龄的稳定期培养物(其由小部分的螺旋形形式和圆形体和小菌落形式的主要比例的混合群组成)暴露于各种抗生素时，发现小集落形式对抗生素比自由生活螺旋形和圆形体对抗生素更耐受。达博霉素10μg/ml是一种对伯氏疏螺旋体存活菌具有高活性的药物(feng、wang、shi等人，2014)，杀死稳定期细胞(图17a，小图h)的所有浮游形式(螺旋体和圆形体)，但是只能部分杀死伯氏疏螺旋体菌的小菌落形式，如在小菌落中存在与一些绿色细胞(活细胞)混合的显着数量的红细胞(死细胞)所示(图17a，小图h)。另一种持久活性药物头孢哌酮(feng、wang、shi等人，2014)具有比达托霉素更弱的活性，因为它对浮游细胞具有一些活性(52％细胞是绿色细胞)，但对于小菌落形式几乎没有活性，其中大多数小集落细胞保持为绿色(活的)细胞(图17a，小图e)。相反的，多西环素对稳定期伯氏疏螺旋体存活菌具有最小的活性，其中约71％的自由活体浮游细胞(包括螺旋形和圆形体)未被多西环素杀死，如绿色(活)细胞所示(图17a，小图d、f和j)，但是小集落形式几乎全部存活(图17a，小图c、e和i)。这些研究结果表明，不同变体形式的体外(螺旋形、圆体形式和小菌落以增加的抗性顺序)对当前莱姆病抗生素以及甚至持久活性抗生素达托霉素和头孢哌酮具有不同的耐受性或耐药性，小菌落形式对抗生素耐受性最强。
药物组合对稳定期伯氏疏螺旋体维生素的作用：尽管达托霉素和头孢哌酮具有强的抗持久活性，但是它们在10μg/ml时杀死最具抗性的小菌落形式的持久性具有有限的活性(图17)。这些研究结果表明，如果对伯氏疏螺旋体单独使用，这些fda批准的持久性药物可能有限的潜力。为了鉴定更有效的药物组合杀死不同变异形式的伯氏疏螺旋体稳定期存留物，评估了81种药物组合，包括在10天龄的伯氏疏螺旋体培养物上的fda批准的药物，所述伯氏疏螺旋体培养物富含小菌落和10μg的圆形体/ml(接近或低于mic)。结果表明，一些药物组合确实比单独的药物更有效(表2)。其中，达托霉素突出显示其与其他药物组合时对稳定期伯氏疏螺旋体多发性硬化症具有最佳活性。
单独的达托霉素(10μg/ml)不能单独消除小菌落(图17a，小图g)，但是达托霉素与多西环素或β-内酰胺的组合对于伯氏疏螺旋体浮游生物滞留菌和对小菌落非常有效(表2，图17b)。然而，达托霉素与多西环素或头孢哌酮组合比单独使用这些药物或与没有达托霉素的药物组合(例如多西环素+头孢哌酮或甚至多西环素+头孢哌酮+磺胺甲恶唑)相比对小菌落形式产生更好的杀菌活性如更多的红细胞(死细胞)是在达托霉素药物组合后产生的(图17b，小图f、g、i、j、k和1)。然而，用作两种药物组合的一部分的达托霉素没有完全根除存留物的小菌落形式(图17b，小图f和g)。值得注意的是，作为使用多西环素和头孢哌酮的三种药物组合的一部分，达托霉素根除了仅有少量痕量红色(死亡)细胞的所有小菌落(图17b，小图h、i、j、k和1)，而其他含达托霉素的，使用头孢哌酮+羧苄青霉素或卡波霉素或氯法齐明的三种药物组合在治疗后仍然具有一些红色小菌落。
除了多西环素和β-内酰胺，一些临床药物，例如万古霉素、氧氟沙星、克拉霉素和羟氯喹，不推荐用于治疗莱姆病，其单独或与多西环素和头孢哌酮组合也对10天龄的稳定期伯氏疏螺旋体显示出一些弱的活性培养物。单独的利福平对于伯氏疏螺旋体耐药菌没有显着活性，但与多西环素、阿莫西林、头孢曲松或头孢哌酮组合对伯氏疏螺旋体菌的活性更高(表3)。在所有其他非达托霉素药物组合中，在杀死伯氏疏螺旋体滞留物中接近达托霉素药物组合的两种药物组合是dox+cefp或咪康唑或磺胺甲恶唑(表3)。此外，当与多西环素和头孢哌酮组合时，氯法齐明显示出对稳定期伯氏疏螺旋体多发性骨髓炎的良好活性(表3)。值得注意的是，羧苄青霉素、万古霉素、氧氟沙星、克拉霉素、替加环素、乳链菌肽和羟氯喹与多西环素联合时的活性仅略微增强多西环素活性和它们的抗持续活性，这不如当它们与达托霉素组合时有效(表3)。
抗生素治疗的伯氏疏螺旋体的亚种群：在先前的研究中，发现达托霉素以50μm(相当于81μg/ml，在人中达到高剂量)具有显着的抗持续活性，似乎可以杀死所有伯氏疏螺旋体，如通过pi染色的所有红细胞所示(图3d，feng、wang、shi等人，2014)。为了证实这些红细胞确实死亡，在新鲜bsk-h培养基中进行传代培养试验，发现实际上用50μm达托霉素处理的这些红细胞已经死亡，因为它们在传代培养试验中未能生长，如缺少任何15天传代培养后可见的绿色螺旋体(数据未显示)。已经建立了亚种群试验作为用于评估抗生素处理的细胞的生存力的可靠测定法，验证了对选择的抗生素或抗生素组合产生对抗持久性的最佳杀菌效果所获得的上述结果(参见图17)。
为此，将7天龄的稳定期伯氏疏螺旋体培养物与选定的抗生素和抗生素组合暴露7天，然后在新鲜的bsk-h培养基中传代培养7天或15天。显微镜计数显示无药物对照和用单一药物处理的样品在7天传代培养中生长。用两种药物组合治疗的样品生长较慢(表4)。然而，在7天传代培养后，所有三种药物组合，例如多西环素+达托霉素+头孢哌酮或smx或cfz没有显示任何生长迹象，因为没有观察到可见的螺旋形式，而其他药物组合在显微镜下都具有可见的绿色螺旋体。在15天传代培养后，对照样品中有约1×107个螺旋体，多西环素或阿莫西林处理的样品中有5×106个螺旋体(表4)。有趣的是，单独的达托霉素或两种药物组合多西环素+头孢哌酮和多西环素+达托霉素，或甚至三种药物组合多西环素+达托霉素+氯法齐明不能对伯氏疏螺旋体菌消毒，因为它们都在传代培养后具有可见的螺旋体生长(图18)。
然而，多西环素+达托霉素+磺胺甲恶唑能显著减少螺旋体的数目，在15天传代培养后可见非常少的螺旋体(图18h)。到目前为止，达托霉素与多西环素和头孢哌酮组合实现了最佳结果，其杀死了所有的没有观察到活菌的伯氏疏螺旋体的存留者(图18i)。这与用单独的其它药物或药物组合处理的样品相比，绿色/红色荧光减少和缺乏任何可行的绿色螺旋体来证明，所述样品都具有更高的绿色/红色荧光和可见的绿色螺旋菌(表4，图18)。重要的是，这种药物组合不仅可以消除浮游生物稳定期伯氏疏螺旋体的存留物(螺旋体和圆形体形式)，而且可以消除更具有抗性的生物膜样微生物群(表4，图18)。对用该药物组合处理的样品进行亚培养，即使在15天的传代培养后，通过显微镜检查(检测限＜105)也没有显示任何可检测生物体的信号(表4，图18i)。这些结果表明小菌落结构不被多西环素、阿莫西林、持久活性药物单独，两种药物组合或甚至三种药物组合消除，但可以通过多西环素、头孢哌酮和达托霉素的药物组合消除。
讨论
在目前公开的主题中，使用持久活性药物的第一次体外药物组合研究(feng、wang、shi等人，2014)与目前推荐的莱姆抗生素如多西环素或阿莫西林或其他抗生素，可以实现更有效地根除伯氏疏螺旋体滞留物。发现通过药物联合比单一抗生素杀灭伯氏疏螺旋体菌更有效，但杀菌活性取决于所使用的特定抗生素(表3)。有趣的是我们注意到，尽管持久的活性抗生素，例如脂肽达托霉素和β-内酰胺头孢哌酮本身，对于浮游螺旋体博氏疏螺旋体(螺旋体和圆形体)具有相当活性，但当它们当单独使用或甚至组合使用时(图17)，不能根除更耐药的小菌落。以前的研究表明，与多西环素和阿莫西林相比，噻唑烷、甲硝唑和替加环素对伯氏疏螺旋体圆形体和小菌落更有活性，但即使在高浓度的抗生素也不能完全杀死小菌落(sapi等人，2011)这些抗生素单独使用对伯氏疏螺旋体存留物的作用是有限的。尽管在该研究中替加环素与圆环体形式相比是最活跃的抗生素(sapi等人，2011)，但是我们发现替加环素本身不能非常有效地杀死生物膜样小菌落(表3)。
显著地，我们发现达托霉素与多西环素和头孢哌酮或羧苄青霉素的组合能够完全根除最具抗性的小菌落(图17)，并且通过传代培养研究进一步证实，其结果显示无任何生长(图18)。虽然各种药物组合显示改善的活性针对稳定期伯氏疏螺旋胃溃疡，达托霉素组合在对持续剂的药物组合中具有最佳活性(表3)。仅接近达托霉素组合的非达托霉素方案包含有头孢哌酮(图17，表3)。出人意料的是，其他抗生素，如磺胺甲恶唑、氯法齐明和咪康唑，也与多西环素和头孢哌酮组合对稳定期伯氏疏螺旋体多发性硬化症患者具有更多的活性。这些药物目前不用作用于临床治疗莱姆病的抗生素(cdc，治疗后莱姆病综合征，2014；hunfeld和brade，2006)。虽然磺胺药物在单独用于生长细菌时是抑菌的，但是它们可以在长期治疗期间杀死伯氏疏螺旋体的非生长的圆形体或聚集形式的小菌落。具有高抗持久活性的氯法齐明改善了与达托霉素或达托霉素加多西环素的组合(表3)，这可能是由于其多种作用机制，包括膜的不稳定，活性氧产生和结核分枝杆菌(xu等人，2012)。我们还发现当与多西环素和头孢哌酮组合时，咪康唑(咪唑抗真菌药物)对伯氏疏螺旋体耐药菌具有高活性(表2)。咪康唑已证实可以改变脂质膜的完整性(vandenbossche等人，1989)，因此可促进其他药物如多西环素和头孢哌酮的渗透，用于改善针对伯氏疏螺旋体菌的活性(表3)。
在本方法公开的主题或任何其它先前研究中，通过达托霉素+多西环素+头孢哌酮的三种药物组合完全根除任何单一、双重或甚至三种药物组合不能实现彻底根除伯氏疏螺旋体生物膜样小菌落。这三种药物组合能够实现这一显着活性的机制是值得评论。多西环素和头孢哌酮分别抑制蛋白质合成和细胞壁肽聚糖的合成(kersten等人，1995)不希望受任何一种特定理论束缚。可能需要杀死在伯氏疏螺旋体小菌落中存在的生长形式或者偶尔从小菌落恢复为生长形式，但是这些药物对圆形体或小菌落持续体本身的效果较差(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sapi等人，2011)。这种不可能性可能是因为药物渗透进入微集落结构，外排机制(brorson等人，2009；casjens，2000)，或减少了蛋白质或细胞壁合成的持久性造成的。达托霉素对伯氏疏螺旋体存留菌的高效性可能是由于其对膜破裂或去极化的作用，导致膜电位的损失和能量代谢的抑制(feng、wang、shi等人，2014；pogliano等人，2012)，这是持续存活所必需的(zhang，2014)。先前的研究表明，β-内酰胺加达托霉素的组合即使具有达托霉素抗性，但也增加革兰氏阳性感染的有效性(dhand等人，2011)。虽然传统上对革兰氏阳性生物体有活性的药物不被认为具有针对伯氏疏螺旋体的活性，但是体外研究先前已经记录了药物例如万古霉素的活性(hall等人，2014；dever等人，1993)不是替考拉宁或达托霉素，虽然这项研究进行检查的不是持续期而是对数期培养。尽管达托霉素不用于革兰氏阴性病原体，但是已经提出诸如粘菌素的药物由于外膜透化而改善聚阴离子脂肽活性(morris等人，1995)。无论如何，这些研究表明，杀死或抑制生长生物(多西环素和头孢哌酮)和非复制生物(达托霉素和头孢哌酮)的这些试剂的组合使用对于针对高度抗性小菌落的良好活性是重要的，这与使用药物靶向生长和非生长微生物群体改善持续性感染治疗的主题是一致的(zhang，2014)。
值得注意的是，在抗生素处理的伯氏疏螺旋体的亚种群研究中的短期培养不足以评估稳定根除持久期菌落。这通过用三种药物组合达托霉素+多西环素+头孢哌酮或smx或cfz处理的伯氏夜蛾存活细胞的7天传代培养物显示，其均不产生可检测水平的任何残余生长(表4)。然而，延长温育至15天的传代培养表明仅达托霉素、多西环素和头孢哌酮组合能够完全根除没有可检测的螺旋体的生物膜样微集落(图18i)。这些发现表明，可能需要在抗生素暴露后更长时间的孵育至15天或更长时间，以彻底评估稳定根除持续形式而不复发的药物组合。亚种群结果确认验证sybrgreeni/pi生存力测定，是一种有用的和更敏感的技术，用于评估药物治疗后的伯氏疏螺旋体滞留物或小菌落的可行性，以确定最佳的药物组合，以杀死更多的耐药性细菌。
伯氏疏螺旋体的年龄或遭受不利条件可以形成形态变体作为体外培养物。(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；alban等人，2000；sapi等人，2011；murgiaandcinco，2004)。这些变体的比例在培养条件下没有随时间被很好地表现出来。通过仔细测量，当随着对数期培养物生长至稳定期(7-10天)时，确定形态变体的百分比，形态变体从螺旋体逐渐变为圆形体形变为小菌落形式(图13)。虽然以前的研究报告显示，圆体形式或生物膜样小菌落形式是更耐抗生素(feng、wang、shi等人，2014；brorson等人，2009；sap等人，2011)，但它们的相对电阻未被充分研究。在这里，随着变体的形态从螺旋体变为圆形体，并且随着抗生素耐受性增加而变为小菌落形式，已经发现了层次结构或不同水平的稳定期伯氏疏螺旋体存留物的持久性水平(表2)。
在稳定期伯氏疏螺旋体培养物中持续频率高于对数期培养物的发现与其他细菌中的研究一致。然而，通过sybrgreeni/pi测定确定的伯氏螺旋菌对数期培养物(5-10％)和稳定期培养物(16-27％)中的持续频率似乎高于大肠杆菌(在对数期的0.001％至稳定期的1％)(keren等人，2004)。鉴于sybrgreeni/pi测定倾向于基于大肠杆菌数据(表2)将持续频率高估约5倍(表2)，转化的持续细胞频率为1-2％和3-5％的伯氏疏螺旋体对数期和稳定期培养物仍然表明与伯氏疏螺旋体的更高持续频率。这可以反映它们形成滞留物的能力，生物体的生长速度，当加入抗生素时的培养时间以及影响在传代培养期间携带的持留菌数量的稀释因子之间的差异。此外，已经发现持续频率根据所使用的抗生素而变化，更有效的抗生素头孢曲松具有比阿莫西林更低的持续频率(表2)，这与先前的研究一致(zhang，2014；lu和zhang，2007)。如果伯氏疏螺旋体菌株的高持续频率与抗生素疗法的顽固性相关，如何确定伯氏疏螺旋体菌株的持久性是否存在差异。
总之，已经发现，随着培养物从对数期到稳定期的老化，具有从螺旋形式到圆形体和小菌落形式的形态学变化，具有增加的抗生素耐受性的体外伯氏疏螺旋体的层级。根据通过sybrgreeni/碘化丙锭(pi)活力染色和显微镜计数测量的抗生素，使用大肠杆菌作为对照，对数期伯氏疏螺旋体培养物中的滞留频率范围为5.8-9.6％，但校正的对数期伯氏疏螺旋体持留菌株频率为1-2％。为了更有效地根除耐受多西环素或阿莫西林的这些持久形式菌落，使用来自fda批准的药物文库的先前鉴定的药物研究药物组合，所述药物文库具有针对伯氏疏螺旋体耐药的高活性。使用sybrgreen/pi生存力测定，含达托霉素的药物组合对杀死伯氏疏螺旋体是最有效的。在研究的组合中，当与多西环素加β-内酰胺(头孢哌酮或羧苄青霉素)或能量抑制剂(氯法齐明)一起使用时，达托霉素是对抗持久剂的最活跃方案中的常见元素。达托霉素加多西环素和头孢哌酮根除了伯氏疏螺旋体存活菌的最具抵抗力的小菌落形式，并且在继代培养后不产生活的螺旋体，表明这些持续形式的持久杀灭效果，这是任何其他两种或三种药物组合都不能实现的。如果持续性生物体或碎屑引起常规治疗不能解决的症状，这些发现可能对具有顽固持续症状或抗生素-难治性关节炎的莱姆病患者的治疗有影响。
实施例3
有效抗伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的fda批准的药物
材料和方法
菌株、培养基和培养物：从美国典型培养物保藏中心获得的伯氏疏螺旋体菌株b31。伯氏疏螺旋体在具有6％兔血清(sigma-aldrich，co)的bsk-h培养基(himedialaboratoriespvt.ltd)中培养。所有培养基通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。培养物在33℃无抗生素的条件下，在无菌的50ml密闭锥形管(bdbiosciences，california，usa)中进行孵育。
伯氏疏螺旋体的圆形体形式的诱导：为了诱导伯氏疏螺旋体的圆形体形式，伯氏疏螺旋体(1×105螺旋体/毫升)在bks-h培养基中不振荡培养6天。在孵育6天后，将终浓度为50μg/ml的阿莫西林加入到培养物中以进行圆形体形式的诱导。在33℃诱导72小时后，伯氏疏螺旋体的圆形体形式可通过显微的镜进行检查。将圆形体细胞(100μl)转移到96孔组织培养微孔反应板中以进行抗生素治疗效果评价。
显微镜技术：在配备微分干涉差(dic)和落射式荧光照明的nikoneclipsee800显微镜上检查样品，并用点滑块彩色相机记录。通过使用细菌计数室(hausserscientificpartnership，pa，usa)和dic显微镜的直接计数进行细胞增殖试验。采用sybrgreeni/pi荧光检测法(feng、wang、shi等人，2014)以测定伯氏疏螺旋体的生存力。存活的(绿色)伯氏疏螺旋体和死亡的(红色)伯氏疏螺旋体的比例通过使用细菌计数室和荧光显微镜进行计数而计算得到。
抗生素和fda药物库：多西环素、甲硝唑、头孢美唑、吡咯烷甲基四环素、磺胺氯哒嗪、青蒿素、头孢哌酮、达托霉素(sigma-aldrich)溶解在合适的溶剂(wikler和ferraro，2008)中以形成储备溶液。抗生素储备液通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。然后将储备液预稀释成500μm的预稀释储备液中并在-20℃下储存。
将jhcclfda批准的药物库(ricker等人，2011)中的每种药物制成10mm含有二甲基亚砜的储备溶液。将储备溶液排列在总数为24的96孔板中，留取每个板中的第一列和最后一列作为对照。将这些主板中的每种溶液用pbs稀释以制备500μm的预稀释工作储备板。将每个预稀释板中的第一列和最后一列设置为空白对照、多西环素对照和阿莫西林对照。将预稀释的药物储备板密封并在-20℃下储存。
抗生素敏感性试验：为了定性测定抗生素的效果，来自预稀释板或预稀释储备液的10μl的每一化合物(终浓度为50μm)被添加至96孔板中的圆形体形式或稳定期的伯氏疏螺旋体培养物中。将每一孔的最终体积调节至100μl。将孔板密封并置于33℃孵育箱中7天。sybrgreeni/pi荧光检测法的生存力测定被用于评估暴露于如前所述的抗生素后的活细胞和死细胞(feng、wang、shi等人，2014)。简言之，将10μl的sybrgreeni(10000×原液，invitrogen)与30μl碘化丙啶(pi，20mm，sigma-aldrich)在1.0ml无菌蒸馏水中混合。然后，在每一孔中加入10μl染色混合物并充分混合。将板在室温下暗处孵育15分钟，随后在485nm的激发波长和535nm(绿光发射)和635nm(红光发射)的荧光强度下，在酶标仪(hts7000plusbioassayreader，perkinelmerinc.，usa)中进行读板。采用最小二乘拟合分析、回归方程和回归曲线，获得活细菌和死细菌的百分比之间的关系，如绿色/红色荧光比所示。使用回归方程计算96孔板的每个孔中的活细胞的百分比。
结果
通过阿莫西林诱导伯氏疏螺旋体的圆形体形式：β-内酰胺抗生素是用于治疗莱姆病的最常用的前线药物，但有趣的是可以诱导伯氏疏螺旋体的螺旋体形成圆形体，其对莱姆抗生素具有抵抗力(brorson等人，2009；sapi等人，2011)。为了鉴定fda批准的药物针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的活性，评估了用于诱导圆形体形式的最佳条件。研究发现6天或更长时间的培养物完全不能被诱导成圆形体形式，甚至采用100μg/ml的阿莫西林也不行(图19d)。研究发现用于fda药物库筛选的圆形体的最佳生产条件为：用50μg/ml阿莫西林处理72小时的5天伯氏疏螺旋体培养物。显微镜检查显示，在上述诱导条件下，高达约96％的伯氏疏螺旋体的螺旋体形式可通过阿莫西林诱导成圆形体形式(图19a)。为了证实诱导的圆形体形式仍然存活，在新鲜bsk-h培养基中进行传代培养试验。通过离心分离收集圆形体(在500μl培养物中)，并用1ml新鲜bsk-h培养基进行冲洗，随后再悬浮于500μl新鲜bsk-h培养基中。然后，将50μl细胞悬浮液转移至1ml新鲜bsk-h培养基中，在33℃下传代培养5天。显微镜分析显示，在5天传代培养后，阿莫西林诱导的伯氏疏螺旋体的圆形体形式可在bsk-h培养基中恢复成螺旋体形式(高达95％)(图19)，这表明诱导圆形体形式以及耐受阿莫西林治疗是完全可行的。
为了比较伯氏疏螺旋体的圆形体形式与螺旋体形式的抗生素敏感性，在5天育龄的螺旋体形式上和阿莫西林诱导的伯氏疏螺旋体的圆形体形式上测试了常用的莱姆病抗生素多西环素、头孢呋辛和头孢曲松。结果显示，伯氏疏螺旋体的圆形体形式比螺旋体形式更耐受或抵抗抗生素(图20)。随后将阿莫西林诱导的圆形体形式用于如下所述的药物筛选。
筛选针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式有效的药物：在先前的研究中，开发了sybrgreeni/pi荧光检测法，其可作为用于对伯氏疏螺旋体的快速生存力评估的高通量筛选方法(feng，wang，shi等人，2014)。在本研究中，这种快速的sybrgreeni/pi荧光检测法通过使用fda批准的药物库用于鉴定具有针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的活性的药物。由于甲硝唑已显示出能够杀死伯氏疏螺旋体的圆形体形式(amant等人，2012)，甲硝唑和多西环素作为对照药物包括在筛选中。在初始筛选中，选择有效目标物，其残留活细胞比率低于阿莫西林对照的残留活细胞比率。选择目标化合物用于进一步的筛选，随后通过显微镜计数以验证筛选结果。通过sybrgreeni/pi荧光检测法的荧光显微镜计数进一步验证了有效药物的候选物(数据未显示)。在1582个fda批准的药物测试中，发现23种药物具有比多西环素更高的针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的活性(表5)。在23种目标物中的活性高于多西环素的11种药物，以递减的活性顺序，达托霉素、青蒿素、环丙沙星、磺胺醋酰、磺胺甲氧嗪、硝呋醛肟、磷霉素、金霉素、磺胺噻唑、氯法齐明和头孢甲肟，比已知的圆形体活性抗生素甲硝唑或或替硝唑具有更好的活性(表5)。抗疟疾药物青蒿素显示出针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的高活性。有趣的是，环丙沙星(残留活细胞为28％)在喹诺酮类药物左氧氟沙星41％，诺氟沙星41％和莫西沙星49％(未显示)中活性是最高的。此外，针对圆形体形式，金霉素、甲氯环素和吡咯烷甲基四环素的活性高于多西环素(残留活细胞为42％)(表5)。另一方面，一些细胞壁抑制剂，如万古霉素和大环内酯类抗生素卡波霉素，在以前的研究中对稳定期伯氏疏螺旋体有合理的活性(feng，wang，shi等人，2014)，其显示对伯氏疏螺旋体的圆形体形式相对较弱的活性，分别具有38％和43％的残留活细胞(数据未显示)。
表5.
a：来自采用fda批准的药物(50μm)处理7天的7天育龄培养物的伯氏疏螺旋体的圆形体形式；替硝唑下面的线以上的药物是指用于治疗莱姆病的抗生素；
b：根据通过sybrgreeni/pi荧光检测法获得的回归方程和绿色/红色荧光的比例来计算残留存活的伯氏疏螺旋体；
c：将选择的抗生素处理的样品，与作为对照的阿莫西林处理的样品相比，计算标准t-检验的p-值。
d：粗体表示针对圆形体形式具有比甲硝唑或替硝唑更好的活性的11种药物候选物，以递减的活性顺序。
圆形体活性抗生素的mic值：在先前的研究中，发现抗生素针对非生长持留菌的活性并不总是与其针对生长的伯氏疏螺旋体的活性相关(feng，wang，shi等人，2014)。因此，具有优异活性的青蒿素和环丙沙星的mic值通过使用sybrgreeni/pi荧光检测法和显微镜计数针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式进行测试。青蒿素的mic值可高达50～100μg/ml，这表明青蒿素针对生长的伯氏疏螺旋体的活性低得多，尽管其具有针对非生长的伯氏疏螺旋体的圆形体形式的高活性。相比之下，环丙沙星针对生长的伯氏疏螺旋体具有相当的活性，且具有低的mic值(0.8～1.6μg/ml)，这与先前的研究(kraiczy等人，2001)一致，这表明其针对生长的和非生长的伯氏疏螺旋体的圆形体形式具有相当的活性。
药物组合物对圆形体形式和稳定期的伯氏疏螺旋体持留菌的影响：在先前的研究中(feng，wang，shi等人，2014)，发现稳定期培养物富含形态变体，例如圆形体形式和生物膜样聚集的微集落形式。这些形态变体形式的伯氏疏螺旋体具有不同的抗生素敏感性(brorson等人，2009；sapi等人，2011)，最近的研究表明，与单一药物相比，药物组合物能更有效地杀灭伯氏疏螺旋体(feng等人，提交)。为了鉴定来自上述筛选的活性目标物中针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的最佳药物组合物，评估了一些活性目标物对对圆形体形式和稳定期的伯氏疏螺旋体培养物的影响，所述活性目标物包括青蒿素、头孢美唑和磺胺氯哒嗪与目前持留菌筛选中有希望的fda批准的药物达托霉素或头孢哌酮的组合物(feng，wang，shi等人，2014)，以及与目前的莱姆抗生素多西环素的组合物。结果显示，药物组合比这些药物中的任一单一药物均更有效(表6，图22)。总体上，对于测试药物或药物组合物，圆形体形式比10天育龄的富含更多的抗性小菌落形式的稳定期培养物更易受影响(表6)。值得注意的是，抗疟药物青蒿素与其他药物组合时突出表现为针对稳定期的伯氏疏螺旋体持留菌的最佳活性。例如，青蒿素与多西环素和头孢哌酮的组合针对稳定期的伯氏疏螺旋体持留菌显示出显著的活性(表6，图22o)。针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式，头孢甲肟和头孢美唑在测试的少数头孢菌素药物中是最有效的。此外，注意到当磺胺类药物磺胺氯哒嗪与达托霉素和多西环素组合时，显示针对伯氏疏螺旋体持留菌的显著的活性(图22n)。再者，磺胺氯哒嗪与多西环素和达托霉素的组合显示出针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的最佳活性(表6)。
表6.
采用10μg/ml的药物或其组合物处理圆形体形式和10日龄的稳定期(括号内)的伯氏疏螺旋体7天。根据通过前述的sybrgreeni/pi荧光检测法(feng，wang，shi等人，2014)获得的回归方程和绿色/红色荧光的比例来计算残留存活的伯氏疏螺旋体。使用直接显微镜计数来校正sybrgreeni/pi荧光检测方的结果。低于30％的残留存活率以粗体显示，以及没有达托霉素的最佳药物组合物用下划线表示。缩写：dox、多西环素；cefp、头孢哌酮；dap、达托霉素；cefm、头孢美唑；scp、磺胺氯哒嗪；art，青蒿素；nft、呋喃妥因。
为了证实药物组合物的结果，在如先前研究(feng等人，发表)中所述的新鲜bsk-h培养基中进行传代培养研究，发现无药物的圆形体对照和用单一药物处理的样品在10天的传代培养中生长(表7)。采用用两种药物的组合物处理的样品生长更慢(表7)。然而，在10天的传代培养后，三种药物的组合物，例如多西环素+达托霉素+头孢哌酮或青蒿素或磺胺氯哒嗪没有显示任何生长迹象，因为没有观察到任何可见的螺旋体，而其他药物组合物在显微镜下都具有可见的活螺旋体(数据未示出)。在20天的传代培养后，在对照样品中有约8×106个螺旋体，在多西环素处理的样品中有约5×106个螺旋体(表7)。单独的达托霉素或两种药物的组合物多西环素+头孢哌酮和多西环素+达托霉素不能对伯氏疏螺旋体持留菌的圆柱体形式进行灭菌，因为它们在20天的传代培养后均具有生长可见的螺旋体(图23)。然而，多西环素+达托霉素+青蒿素或磺胺氯哒嗪在20天的传代培养后螺旋体的数量显著减少，具有非常少的可见的螺旋体(图23)。达托霉素与多西环素和头孢哌酮的组物合仍显示具有最佳活性，其杀死所有伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式，在20天的传代培养后观察不到任何活的螺旋体(图23)。
表7.传代培养试验以评估药物处理的伯氏疏螺旋体a的圆形体形式的生存力
a：来自10μg/ml单一药物或药物组合物处理7天的阿莫西林诱导的伯氏疏螺旋体的圆形体形式(500μl))；然后，将50μl洗涤的细菌细胞在1ml新鲜bsk-h培养基中分别传代培养10天和20天，并通过显微镜检查；
b：缩写：dox、多西环素；cefp、头孢哌酮；dap、达托霉素；art，青蒿素；scp、磺胺氯哒嗪；
c：在sybrgreeni/pi荧光染色后，通过酶标仪获得绿色/红色荧光比，每个值是三次重复的平均值；
d：通过显微镜计数评价螺旋体的数量；
e：低于检测限，如通过显微镜所示的没有任何可见的螺旋体。
讨论
先前的体外和体内研究表明，作为持留菌形式的伯氏疏螺旋体的圆形体形式可以在不利条件下存活，包括体外抗生素暴露，并且在体内慢性莱姆神经型病内发现(brorson和brorson，1998；miklossy等人，2008)。如先前的研究所示(brorson和brorson，1997；murgia和cinco，2004；brorson和brorson，1998)，并且在这项研究中，伯氏疏螺旋体的圆形体形式仍然可以在适当的条件下，基于在传代培养中应力的消除，可再生并恢复到螺旋体形式。伯氏疏螺旋体的圆形体形式显示较低的代谢活性，并且耐受抗生素(brorson等人，2009；kersten等人，1995；barthold等人，2010)。虽然据报道甲硝唑、替硝唑和替加环素针对圆形体形式具有一定的活性，但它们不能完全根除这些持留菌形式(sapi等人，2011)。因此，没有可供使用的良好的针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的抗生素(brorson等人，2009；barthold等人，2010)。这些研究表明，使用当前的抗生素难以杀死伯氏疏螺旋体的圆形体形式。
在本研究中，这个问题的解决方式为：首先建立阿莫西林诱导伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式，然后以针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式筛选fda批准的药物库中的活性药物。针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式，11种候选药物被认为比甲硝唑或替硝唑具有更好的活性(表5)，对照药物是已知的针对圆形体形式具有活性的药物(sapi等人，2011；brorson和brorson，1999)。
在先前的研究中，鉴定了几种药物，其显示来自fda批准的药物库针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的优异活性(feng，wang，shi等人，2014)。针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的一些目标物在本筛选中针对圆形体形式也被鉴定，例如达托霉素、氯法齐明和磺胺类药物，这验证了先前发现的这些试剂对持留菌形式具有活性。重要的是，发现一些针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的活性抗生素，其在先前的药物筛选中并没有显示对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌具有良好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。这些活性抗生素包括青蒿素、环丙沙星、硝呋醛肟、磷霉素、替硝唑、氯碳头孢和百里香酚，其显示出针对圆形体形式的特异活性。这些候选药物是被fda批准的并用于治疗莱姆病以外的感染。
正如在先前的研究中(feng，wang，shi等人，2014)，达托霉素仍然是针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式最具活性的药物。达托霉素杀死大多数浮游的伯氏疏螺旋体的圆形体形式(图21d)。达托霉素可能优先作用于伯氏疏螺旋体的圆形体形式的膜，其与积极生长的螺旋体形式的膜不同，因此使其对持留菌形式特别有效。已知达托霉素能破坏膜结构并引起快速去极化，从而消耗可能是持留菌形式存活所需的膜能量。
这项研究的一个有趣发现是观察到的抗疟药青蒿素对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式具有优异的活性(图21e)。值得注意的是，与最常用的抗生素相比，青蒿素在具有高的mic值(50-100μg/ml)同时对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式具有优良的活性。青蒿素是一种常用的从植物黄花蒿(一种中药材)中分离的抗疟药物。青蒿素的作用机制尚不清楚。青蒿素的抗疟活性可能涉及通过来自由疟疾虫消化的血红蛋白的自由亚铁离子活化内过氧化化物(wells等人，2009)。然而，在伯氏疏螺旋体培养物中亚铁离子、血红蛋白含量很低，所以内过氧化物的活化可能不是青蒿素活性针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的主要机制。对酵母的研究指出，青蒿素损害膜结构，并引起线粒体膜的去极化(wang，huang等人，2010；li等人，2005)。在这方面，它可能是青蒿素具有类似的破坏细菌膜的作用机制以作为针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的依据。值得注意的是，青蒿素已被用于治疗莱姆病感染并发现是临床有效的。青蒿素的有效性的原因被解释为是由于其作用是针对巴贝虫的协同感染，但很可能，青蒿素的临床疗效至少部分是由于本文所述的针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的活性。
先前发现达托霉素与多西环素和头孢哌酮的组合物可最好地消除最耐药的小菌落形式的持留菌(feng等人，提交)。在本研究中，发现青蒿素是与多西环素和头孢哌酮的药物组合物中达托霉素的最佳替代物，并且对持留菌的圆形体形式显示出优异的活性(表6，图22m)。此外，具有复杂的抗菌活性(包括膜破裂和去极化)的脂溶性抗生素氯法齐明(vanrensburg等人，1992；cholo等人，2012)显示出对圆形体和稳定期持留菌均具有良好活性。基于对达托霉素、青蒿素和氯法齐明的这些发现，并且不希望受任何一个具体理论的束缚，提出膜破裂可能是杀灭伯氏疏螺旋体持留菌的较佳途径。
除了筛选药物中的名列前茅的目标物，许多磺胺类抗生素，如磺胺醋酰、磺胺甲氧嗪和磺胺喹恶啉，被发现对圆形体形式具有高活性(表5)。磺胺类抗生素在先前针对稳定期持留菌的药物筛选中也被鉴定，并且显示出低的mic值(＜0.2μg/ml)(feng，wang，shi等人，2014)。磺胺类药物抑制叶酸合成中所需的对氨基苯甲酸的利用，其导致合成dna、甲硫氨酸、甘氨酸和甲酰基甲硫酰基转移-rna所需的几种酶的阻断。值得注意的是，作为磺胺甲氧嗪类似物的磺胺氯哒嗪对稳定期伯氏疏螺旋体显示出良好的活性(残留活细胞为约38％)，并且当与达托霉素和多西环素组合时，显示出对稳定期伯氏疏螺旋体的显著活性(残留活细胞为约8％)(表6)。因此认为，进一步研究伯氏疏螺旋体的圆形体形式的代谢变化可帮助理解磺胺类药物针对伯氏疏螺旋体持留菌的作用机制。
除了先前发现的药物(feng，wang，zhang等人，2014)，在本研究中发现一些针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式具有极佳活性的新药物。作为氟喹诺酮的环丙沙星已经显示出针对体外伯氏疏螺旋体的活性，并且在72小时后可以用16μg/mlmbc(41.5μm)杀死接种物(kraiczy等人，2001)。目前已经公开了在其他喹诺酮类药物中，环丙沙星是针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的最具活性的氟喹诺酮，但是在先前筛选中，环丙沙星未被鉴定为具有针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的活性(feng，wang，shi等人，2014)，因为它未被记载在旧版本的fda药物库中。然而，单一的环丙沙星(50μm)在7天后不能完全杀死圆形体形式。这个结果表明，圆形体形式对抗生素的耐药性或耐受性都超过了繁殖的伯氏疏螺旋体。另一方面，在先前的药物筛选中，一些药物，例如硝呋醛肟和百里香酚在稳定期伯氏疏螺旋体上没有显示活性，但在本研究中对圆形体形式表现出良好的活性。这种针对圆形体形式的特异性活性与不同形态形式的生理学差异和/或这些药物与用于诱导用于药物筛选的圆形体形式的阿莫西林的协同活性相关。值得注意的是，金霉素比多西环素对圆形体形式更具活性，并且硝基呋喃衍生物硝呋醛肟比甲硝唑或替硝唑更具活性(表5)。这些发现可以表明在两种情况下所涉及的侧链可能已经赋予了对圆形体持留菌的额外活性。使用硝呋醛肟类似物的呋喃妥因(残留活细胞为39％)对稳定期伯氏疏螺旋体的药物组合试验显示呋喃妥因与头孢哌酮的组合比单独的每种药物更有效(表6)。同样，在圆形体形式的药物筛选中，天然抗菌的百里香酚与阿莫西林的组合显示出良好的活性(残留活细胞为34％)，但在先前的药物筛选中，单独的百里香酚不能在稳定期伯氏疏螺旋体上产生作用(残留活细胞为82％)。palaniappan等人报道百里香酚可以降低大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对氨苄青霉素和青霉素的抗性(2010)。百里香酚和β-内酰胺之间的这种协同活性可以解释其针对伯氏疏螺旋体的圆形体形式的活性。这些结果表明，药物组合物是一种抵抗伯氏疏螺旋体持留菌的有效方法。
然而，一些对稳定期伯氏疏螺旋体具有活性的药物，如β-内酰胺、万古霉素、链霉素和两性霉素b(feng，wang，shi等人，2014)表5)。然而，注意到两种头孢菌素，头孢甲肟和头孢美唑，对伯氏疏螺旋体的圆形体形式显示出良好的活性。在先前针对稳定期伯氏疏螺旋体的药物筛选中，头孢哌酮是用于杀死稳定期伯氏疏螺旋体的最佳头孢菌素，其也对圆形体形式(未示出)具有一定的活性。需要进一步研究以进一步探索这些头孢菌素的作用机制，这些头孢菌素具有针对伯氏疏螺旋体持留菌的活性，这可能涉及细胞壁合成之外的范围。万古霉素是作用于细胞壁而不是作用于细胞膜(如达托霉素)的糖肽抗生素。对于阿莫西林处理的圆形体，没有发现万古霉素的良好活性，尽管其在之前的药物筛选中对稳定期伯氏疏螺旋体显示出相对良好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。这可能是由于阿莫西林诱导的圆形体形式的细胞壁缺陷。
总之，这项研究代表了针对伯氏疏螺旋体持留菌的圆形体形式的第一个高通量药物筛选，并确定了许多fda批准的抗生素，其显示出对这种形式的优异活性。尽管药物对稳定期持留菌和圆形体形式的持留菌有一些重叠，但是一些有趣的药物候选物被鉴定为优先对圆形体形式的持留菌具有活性，包括青蒿素、环丙沙星、硝呋醛肟、磷霉素、金霉素以及一些第一次被发现对圆形体形式具有活性的磺胺类药物。这些圆形体形式的有效药物以适当的组合物形式可被用于消除持留现象，改善莱姆病持留形式的治疗，包括抗生素难治性莱姆关节炎和综合症。
实施例4
鉴定来自nci化合物收藏的针对伯氏疏螺旋体持留菌的具有高活性的新化合物
原料和方法
菌株、培养基和培养物：从美国典型培养物保藏中心获得的伯氏疏螺旋体菌株b31(atcc35210)。伯氏疏螺旋体在具有6％兔血清(sigma-aldrich)的bsk-h培养基(himedialaboratoriespvt.ltd.)中培养。所有培养基通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。培养物在33℃无抗生素的条件下，在无菌的50ml密闭锥形管(bdbiosciences，california，usa)中进行孵育。基于展示稳定期培养物的抗生素耐受性的先前研究，选择富含持留菌的7天育龄的稳定期伯氏疏螺旋体培养物用于在96孔微量滴定板中的药物筛选(feng，wang，shi等人，2014)。
显微镜技术：在配备微分干涉差(dic)和落射式荧光照明的zeissaxiolmagerm2显微镜上检查样品，并用hamamatsuorca-r2c10600相机记录。通过使用细菌计数室(hausserscientificpartnership，pa，usa)和dic显微镜的直接计数进行细胞增殖试验。采用如前所述的sybrgreeni/pi荧光检测法以测定伯氏疏螺旋体的生存力(feng、wang、shi等人，2014)。存活的(绿色)伯氏疏螺旋体和死亡的(红色)伯氏疏螺旋体的比例通过使用如前所述的细菌计数室和荧光显微镜的计数进行计算(feng、wang、shi等人，2014)。
抗生素和nci化学化合物库：抗生素包括从sigma-aldrich购买的多西环素、阿莫西林和达托霉素，其溶解在合适的溶剂(clinicalandlaboratorystandardsinstitute(临床实验室标准化研究所)，2007)中以形成储备溶液。所有的抗生素储备液通过0.2μm过滤器进行过滤灭菌。然后将储备液预稀释成500μm的预稀释储备液中并在-20℃下储存。
由多样性集v(moody等，1978)、机制多样性集ii(dtp-机制集信息，2015)和天然产物集iii(dtp-天然产物集信息，2015)组成的nci化合物库集，由nationalcancerinstitutedevelopmentaltherapeuticprogram′sopencompoundrepository(国家癌症研究所发展治疗程序的开放化合物库)提供。这些nci化合物库在96孔板中在含有二甲基亚砜的1mm储备溶液中制备，留取每个板中的第一列和最后一列用于对照，包括二甲基亚砜空白对照，多西环素对照和阿莫西林对照。将预稀释的药物板密封并储存在-20℃。
针对伯氏疏螺旋体稳定期持留菌的nci化合物库筛选：为了定性测定化合物对伯氏疏螺旋体持留菌的作用，将来自预稀释储备液中的每种化合物(5μl)加入96孔微量滴定板中的7天育龄的伯氏疏螺旋体稳定期培养物中。将每孔的最终体积调整至100μl以在药物筛选中实现50μm的最终药物库浓度。将板密封并置于33℃孵育箱中7天，此时细菌的生存力通过如先前研究中所述的sybrgreeni/pi荧光检测法来评估(feng，wang，zhang等人，2014)。在485nm的激发波长下，使用spectramaxm2酶标仪(moleculardevicesinc.，usa)对筛选平板的每个孔进行535nm(绿光发射)和635nm(红光发射)的荧光强度的测量。一些有效的候选物通过荧光显微镜进一步证实(feng，wang，zhang等人，2014)。
mic测定：使用标准微量稀释法测定在72小时孵育期后抑制伯氏疏螺旋体可见生长的最小抑制浓度(mic)(sapi等人，2011；deveret等人，1992；boerner等人，1995)。将伯氏疏螺旋体细胞(1×105)接种到每孔含有90μl新鲜bsk-h培养基的96孔微型板的每个孔中。将每种稀释的化合物(10μl)加入到培养物中。所有实验一式三份进行。将96孔板密封并置于33℃的孵育箱中5天(feng，wang，shi等人，2014)。使用如前所述的sybrgreeni/pi荧光检测法和细菌计数室在孵育后评估细胞增殖(feng，wang，shi等人，2014)。
介绍
为了确定能够更有效地杀死伯氏螺旋体持留菌的药物，目前已开发出使用sybrgreeni/碘化丙啶(pi)染色的新的活性检测(feng，wang，zhang等人，2014)，其可实现针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的fda批准的药物库筛选(feng，wang，zhang等人，2014)。采用这种高通量的检测，鉴定了许多有趣的候选药物，如达托霉素、氯法齐明、头孢哌酮、卡波霉素，其对体外伯氏疏螺旋体持留菌具有极好的活性(feng，wang，shi等人，2014)。在先前的研究中，在所有的候选药物中，发现达托霉素对伯氏疏螺旋体持留菌具有最高的活性。尽管达托霉素在50μm下几乎可以根除伯氏疏螺旋体持留菌，但此药物浓度在临床使用中是相当高的，此外，达托霉素通常被用于静脉注射，这不方便管理。
为了鉴定在杀死伯氏疏螺旋体持留菌方面，比达托霉素更有效的新的药物，在此实施例中，针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的新的药物筛选通过使用美国国家癌症研究所的化学库集进行(nci化合物库集)。此nci化合物库集有三个化合物库：多样性集iv化合物库(1593种化合物)、机制集ii库(816种化合物)和天然产物集iii库(117种化合物)，共有2526种化合物。这些化合物是基于250000多个天然产品和人工合成的化合物中的结构的多样性而选择的(openrepositorycollectionofsyntheticsandpurenaturalproducts(合成和纯天然产品的开放性保藏库)，2014)。通过筛选nci化合物库集，新的抗持留菌化合物被确定，此在先前的筛选中并未被发现(feng，wang，shi等人，2014)。这些新的持留菌活性目标物可用于莱姆病的治疗。
结果
筛选nci化合物库以鉴定针对静止期伯氏疏螺旋体具有活性的有效药物：在暴露于化合物库后，使用sybrgreeni/pi荧光检测法作为用于伯氏疏螺旋体快速生存力评估的高通量筛选方法(feng，wang，shi等人，2014)。基于先前的研究，一些红色染色的化合物造成了sybrgreeni/pi荧光检测法的干扰，这可能导致底色为红色并导致假阳性结果。因此，在本发明公开的主题中，进行显微计数筛选以检查sybrgreeni/pi荧光检测法中的目标化合物。
为了鉴定针对伯氏疏螺旋体持留菌具有活性的有效化合物，使用稳定期伯氏疏螺旋体作为筛选nci化合物库的持留菌模型。同时，将目前使用的莱姆病抗生素多西环素和阿莫西林作为对照药物。与先前的结果一致(feng，wang，shi等人，2014)，目前使用的莱姆抗生素对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的活性较差，与无药物对照中的93％活细胞相比，使用用两种抗生素处理的细菌分别仍有75％和76％的残留活细胞(表8)。
在所测试的nci化合物库集中的2526种化合物中，发现237种在初级筛选中针对伯氏疏螺旋体持留菌具有比多西环素和阿莫西林更高的的活性。通过使用sybrgreeni/pi生存力测定的显微镜计数来重新筛选这237个候选物。在通过显微镜的再筛选之后，前30种活性目标物在经过处理后具有小于50％的残留活细胞(表8，图24)。在这30种活性目标物中，发现22种化合物为机制集ii，9种化合物为多样性集iv，3种化合物为天然产物集iii。七尾霉素和更生霉素同时出现在机制集ii和天然产物集iii中，以及nsc311153和nsc637578同时出现在机制集ii和多样性集iv中。有趣的是，它们都是芳香族化合物。鉴定了几种临床使用的药物，其对稳定期伯氏螺旋体持留菌具有优异的活性。一些药物的抗持留菌活性显着高于前述的抗生素多西环素或阿莫西林，并且甚至比达托霉素更有活性，达托霉素是在先前研究中针对伯氏疏螺旋体持留菌的最佳抗生素(表8，图24)。6种蒽醌抗生素和化合物，道诺霉素3-肟、二甲基道诺霉素、柔红霉素、nsc299187、nsc363998和诺加霉素显示出针对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的最高活性(残留活细胞从6％至15％)。这6种化合物显示比达托霉素(18％残留活细胞)更高的活性。此外，另外5种蒽醌化合物，吡咯霉素、紫红霉素a，ncs316157，大黄素和nsc156516也显示出对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的良好活性(残留活细胞从21％至50％)。在6种蒽醌类化合物之后，派洛宁b，一种呫吨化合物强调其本身对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌具有良好的活性(残留活细胞为19％)。在30种活性化合物中，发现了7种含氮芳族化合物，nsc343783(残留活细胞为20％)、灵菌红素(残留活细胞为24％)、nsc637578、nsc678917、nsc118832、nsc617570和nsc96932。此外，毛壳色菌素，双萘-γ-吡喃酮化合物，显示良好的活性，其残留活细胞为22％。丝裂霉素，含氮丙啶的苯醌类抗肿瘤药物，显示相当好的活性，其残留活细胞为25％。三-1，4-萘醌，七尾霉素(残余活细胞为26％)，ncs659997和ncs224124对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌具有相对良好的活性。多肽抗生素更生霉素对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌也具有相对高的活性(残余活细胞为30％)。除了11种临床使用的药物(道诺霉素3-肟、二甲基道诺霉素、柔红霉素，诺加霉素，吡咯霉素，毛壳色菌素、灵菌红素、丝裂霉素、七尾霉素、更生霉素)外，还发现19种非药物化合物对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌具有不同水平的良好活性(表8，图24)。
表8.前30种对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌a具有良好活性的活性目标的活性
a：来自药物或化合物(50μm)处理7天的7天育龄的稳定期伯氏疏螺旋体培养物，此时细菌的生存力由如前所述的方法所确定(feng，wang，shi等人，2014)：
b：nsc编号是美国国家癌症研究所(nci)所提出的物质的数字编码；
c：根据如前所述的sybrgreeni/pi荧光检测法(feng，wang，shi等人，2014)获得的回归方程和绿色/红色荧光的比例来计算残留存活的伯氏疏螺旋体；
d：根据如前所述的荧光显微镜计数(feng，wang，shi等人，2014)测定残留存活的伯氏疏螺旋体。
mic值和抗持留活性之间的关系：据发现一些化合物带有良好的活性对抗非生长稳定期伯氏疏螺旋体持留菌(表8)，但是必须确定的是这些化合物的mic值对抗着伯氏疏螺旋体的生长(表9)。如先前研究中所述，使用标准微量稀释法测定mic值(feng，wang，shi，eta1.，2014)。研究发现三蒽环类抗生素，道诺霉素3-肟，柔红霉素和吡咯霉素，除了对抗稳定期伯氏疏螺旋体持留菌有良好的活性之外，也在低mic值(分别为＜0.36，0.36，0.36-0.72μg/ml)下对抗对数相生长伯氏疏螺旋体中有良好活性。另一种蒽醌化合物，nsc299187，虽然具有优秀的抗持久活性(残留活细胞13％)，但展示了较高mic值(3.26-6.52μg/ml)。同时值得注意的是灵菌红素(含氮芳环化合物)，丝裂霉素(含氮丙啶的苯醌)，萘诺霉素(1，4-萘醌)和更生霉素(多肽抗生素)在低mic值(分别为＜0.2，＜0.21，0.761.57，＜0.78μg/ml)下有很好的活性对抗复制伯氏疏螺旋体。在另一方面，pyroninb和chaetochromin对生长伯氏疏螺旋体在较高mic值下(分别为1.8-3.6，2.74-5.47μg/ml)效力较低，但具有优秀的抗持留活性。
表9.比较伯氏疏螺旋体的一些化合物的mic值和抗持留活性。
a.显示为残留活细胞百分比。
b.c的最大值来自于已发表的文献。
低药物浓度下抗持留活性的比较：虽然从具有50μm化合物筛的nci化合物库中获取高效的命中，但这种药物浓度对于体内实验可能太高。在以前的研究中，50μm的达托霉素显示出对抗稳定期伯氏疏螺旋体持留菌有强力的活性(feng，wang，shi，eta1.，2014)，但不能在较低浓度下杀死伯氏疏螺旋体持留菌中的小菌落，例如10μg/ml(fengetal.2015，inpress)。为了进一步比较命中化合物和达托霉素的活性，在20μm药物浓度下(大多数化合物为约10μg/ml，达托霉素为32μg/ml)，测试对抗稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的活性。随着药物浓度的降低，稳定期伯氏疏螺旋体的大部分残留活力百分比增加(表10，图25)，但五蒽环霉素，二甲基地霉素，ncs363998，诺加霉素，吡咯霉素和rhodomycina，在20μm下仍显示出对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的活性为50μm(表10，图25)。其它非蒽环类化合物在20μm下显示出比达托霉素更弱的活性。
表10.比较一些命中化合物在20μm和50μm下对稳定期伯氏疏螺旋体持留菌的活性
a.用药物处理7天的稳定期伯氏疏螺旋体培养物7天。
b.根据回归方程和通过sybrgreeni/pi测定获得的绿色/红色荧光比率计算的残留存活伯氏疏螺旋体。
c.通过落射荧光显微镜计算测定的残留活性伯氏疏螺旋体。
d.nsc编号是该物质提交给国家癌症研究所(nci)的数字标识符。
现有技术讨论
最近已经鉴定了许多有趣的候选药物，其对来自fda批准的药物库的非复制伯氏疏螺旋体持留菌具有优异的活性(feng，wang，shi，etal.，2014)。本研究的目的是使用nci化合物库的收集来鉴定对伯氏疏螺旋体持留菌具有高活性的新化合物。从三个nci化合物库的2526种化合物中，发现237种化合物比多菌灵或阿莫西林对伯氏疏螺旋体具有更高的活性，其中从通过显微镜再筛选确认了前30个活性命中。机械化合物库的使用有助于鉴定蒽醌类药物(蒽环类)，对伯氏疏螺旋体持留菌具有高活性。有趣的是，30种最具活性的化合物中超过三分之一具有蒽醌(也称为蒽二酮或二氧代蒽)结构。前6种活性化合物，道诺霉素3-肟，二甲基地霉素，道诺霉素(柔红霉素)，nsc299187，nsc363998和诺加霉素都是蒽醌衍生物，其特征在于3个芳香环与苯醌在中心连接在一起。以前，蒽环类抗生素多柔比星的抗持留活性被发现(feng，wang，shi，etal.，2014)，但它被错误地排除在活性药物之外，因为它干扰了sybrgreeni/pi染色。然而，通过显微镜仔细检查证实了红色蒽醌药物的抗持留活性，包括多柔比星。值得注意的是，并不是所有的红色蒽醌化合物都具有良好的抗持留活性。例如，ncs156516具有弱的抗持留活性并显示50％的残留活(绿色)细胞(图24)。因此，需要通过仔细的显微镜检查，使用低浓度的化合物和传代培养研究来评估化合物，具有红色和具有抗伯氏疏螺旋体持留菌活性。
值得注意的是，具有6-15％残留活细胞的前六种蒽醌化合物似乎甚至比达托霉素活性更高，达托霉素在sybrgreeni/pi生存力测定中具有18％的残留活细胞(表8)。然而，由于任何单一药物不可能杀死所有细菌群体，并且使用代理定位的生长和非生长持留菌的药物组合需要在体外和在持续感染期间更有效地杀死异质细菌群体(zhang，2014)，所以有必要评价蒽醌组合与目前的莱姆抗生素针对更耐药形式的伯氏疏螺旋体持留菌的功效包括包括小菌落和生物膜样生长。最近已显示，单独的达托霉素不能杀死凝集形式的伯氏疏螺旋体持留菌，例如例如小菌落或生物膜样结构，而达托霉素与多西环素和头孢哌酮的组合，在没有亚培养物的再生长下，能够完全根除更具抗性的小菌落或生物膜样结构(feng，etal.，2015，inpress)。因此，需要进一步的药物组合和亚培养研究以确认前六种蒽醌化合物是否确实比达托霉素在体内和体外对伯氏疏螺旋体持留菌更有活性。
醌是一类从链霉菌中分离的天然存在的酚类化合物，并且具有不同的医学用途，包括抗癌，抗疟药和轻泻药。蒽环类抗生素如道诺霉素，诺加霉素，吡咯霉素和紫红霉素a用于某些癌症的化疗，特别是几种特定类型的白血病(tanetal.，1967)。据报道，蒽环霉素药物对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，道诺霉素和多柔比星的mic分别为8-32μg/ml和0.12-0.5μg/ml(zhuetal.，2005)。道诺霉素对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌和大肠杆菌没有显示杀菌活性(moodyetal.，1978)。这项研究是第一个证明这类化合物对生长和非生长形式的革兰氏阴性伯氏疏螺旋体具有活性。然而，这类蒽醌化合物对伯氏疏螺旋体的作用机制尚不清楚，仍有待确定。蒽环类抗生素可通过插入dna/rna链的碱基对来抑制dna和rna合成(mizunoetal.，1975)。此外，蒽环类抗生素可以稳定拓扑异构酶ii复合物，并防止拓扑异构酶ii从其核酸底物解离，导致dna损伤和阻断dna转录和复制以及产生活性氧，其可能损伤线粒体并导致心脏毒性的副作用(jensenetal.，1993；pommieretal.，2010)。道诺霉素的糖部分在确定其抗癌活性中起关键作用(zhuetal.，2005)。在本研究中，发现具有糖结构的蒽环类抗生素和不具有糖结构的蒽醌化合物(ncs299187和ncs363998)都对伯氏疏螺旋体持留菌具有良好的活性。这些研究结果表明蒽醌药物的作用机制在真核生物和伯氏疏螺旋体持留菌中的抗癌活性可能不是相同的。需要进一步的研究来确定蒽环类抗生素对伯氏疏螺旋体持留菌的作用机制，阐述了该类化合物对于伯氏疏螺旋体持留菌的结构活性关系，并且还研究了利用这类化合物的强抗持留活性而对宿主细胞没有不利毒性的可能性。
除了蒽环类抗生素外，还发现一些1，4-萘醌，例如萘诺霉素，ncs659997和ncs224124，显示出类似于蒽醌的高度相似的分子结构。纳紫霉素可能干扰细菌细胞膜的功能并与细菌的呼吸链相互作用(hayashietal.，1982)，并且这种作用模式可以解释其对伯氏疏螺旋体持留菌的活性。
据发现，毛壳菌色素由几种毛壳菌产生的双-萘并吡喃酮，也显示出对稳定期伯氏疏螺旋体的高活性。双萘并吡喃具有广泛的生物活性，例如抑制线粒体中的atp合成，细胞增殖抑制，三酰基甘油合成抑制和抗微生物活性(luetal.，2014)。双萘并吡喃对各种细菌如金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和结核分枝杆菌具有活性，mic值范围为2至50μg/ml(luetal.，2014)。atp合成的抑制可以解释双萘并吡喃酮对伯氏疏螺旋体持留菌的活性。头孢菌素已显示抑制脂肪酸生物合成(campbellandcronan，2001)。脂肪酸合成可能在伯氏疏螺旋体持留菌的构造中起作用，并且需要未来的研究以证实这种可能性。
在这项研究中，发现一些抗生素化合物，如红藻毒素，丝裂霉素和更生霉素，对伯氏疏螺旋体持留菌具有合适的活性，尽管它们的活性(24-30％残留活细胞)不如达托霉素(18％残留活细胞)(表8)。洋甘菊苷是粘质沙雷氏菌的次级代谢产物，并且众所周知具有抗菌，抗真菌，抗原生动物，抗疟，免疫抑制和抗癌活性(williamsonetal.，2007)。丝裂霉素通过其氮丙啶官能团显示其作为dna交联剂的活性，并交联dna双螺旋的互补链以引起细菌细胞的死亡(szybalskiandiyer，1964；tomasz，1995)。丝裂霉素对伯氏疏螺旋体持留物的活性也可能是由于其dna交联活性。更生霉素是从土壤细菌链霉菌(hollstein，1974)分离的多肽抗肿瘤抗生素，并且已知结合dna并干扰dna复制(hollstein，1974)，并且还抑制rna转录(sobell，1985)。
此外，一些未研究的化合物，例如nsc343783和ncs311153，被发现在不同程度上对固定相伯氏疏螺旋体持留菌有效。这些新发现的有趣的化合物比当前的莱姆抗生素具有更多的抗持久活性，并且可以在将来作为引导进一步探索药物开发和用于细菌持久性的机制研究。总之，蒽环类化合物和抗生素连同一些其它化合物，包括岩藻红素，丝裂霉素，纳诺霉素和更生霉素，已经被鉴定为对伯氏疏螺旋体持留菌具有优异的活性。蒽环类/蒽醌类化合物对伯氏疏螺旋体持留菌的结构活性关系和作用机制应该在未来的研究中解决。以蒽环类/蒽醌类化合物和目前的莱姆抗生素在体外和动物模型中根除伯氏疏螺旋体持留菌的药物组合研究应该对改善莱姆病的治疗具有价值。
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