脱氢酶活性提高的阿马多里酶的制作方法
本发明涉及一种脱氢酶活性提高的阿马多里酶(amadoriase)、氧化酶活性降低的阿马多里酶、脱氢酶活性提高且氧化酶活性降低的阿马多里酶、其基因和重组dna以及该阿马多里酶的制备方法。此外本发明涉及可有效用于作为糖尿病的诊断用酶、传感器、以及糖尿病标记物的测定试剂盒的阿马多里酶。
背景技术：
糖化蛋白是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶的方式形成共价键并通过阿马多里重排而产生的。作为蛋白质的氨基，可举出氨基末端的α氨基、蛋白质中赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白，已知有血液中的血红蛋白被糖化的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化的糖化白蛋白等。
这些生物体内产生的糖化蛋白中，作为在糖尿病的临床诊断领域用于糖尿病患者的诊断及症状管理的重要的血糖控制标记物，糖化血红蛋白(hba1c)越来越受到关注。血液中的hba1c浓度可反映过去一定期间的平均血糖值，其测定值在糖尿病症状的诊断及管理中已成为重要的指标。
作为快速简便的测定该hba1c的方法，提出有使用阿马多里酶的酶方法，即用蛋白酶等分解hba1c，对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(下面表示为“αfvh”)或者α-果糖基缬氨酸(下面表示为“αfv”)进行定量的方法(例如，参照专利文献1～7)。实际上，在从hba1c切出αfv的方法中，存在着受杂质等的影响很大，不能获得准确测定值的问题，出于获得更准确测定值的目的，特别是现在测定αfvh的方法已成为主流。
阿马多里酶催化如下反应：在氧存在下，将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽和过氧化氢。
阿马多里酶发现于细菌、酵母、真菌中，作为特别是对hba1c测定有用的具有对αfvh和/或αfv的酶活性的阿马多里酶，例如，报告有来源于锥毛壳(coniochaeta)属、正青霉(eupenicillium)属、棘壳孢(pyrenochaeta)属、节菱孢(arthrinium)属、弯孢(curvularia)属、新赤壳(neocosmospora)属、隐球菌(cryptococcus)属、暗球腔菌(phaeosphaeria)属、曲霉(aspergillus)属、裸孢壳(emericella)属、细基格孢(ulocladium)属、青霉(penicillium)属、镰刀菌((fusarium)属、achaetomiella属、无毛毛壳(achaetomium)属、梭孢壳(thielavia)属、毛壳(chaetomium)属、五谷麻孢壳(gelasinospora)属、小囊菌(microascus)属、小球腔菌(leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(ophiobolus)属、格孢腔菌(pleospora)属、闭毛孢壳(coniochaetidium)属、毕赤酵母(pichia)属、棒状杆菌(corynebacterium)属、土壤杆菌(agrobacterium)属、节杆菌(arthrobacter)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、6～15、非专利文献1～11)。予以说明，上述报告例中，阿马多里酶因文献不同而有被记载为酮胺氧化酶及果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等的情况。
阿马多里酶可以通过与过氧化物酶共轭，利用显色底物而用于测定样品中的糖化底物。现有的阿马多里酶在氧化糖化底物时，能够向氧分子传递电子。该活性称为氧化酶活性。如果降低酶的氧化酶活性并增加脱氢酶活性，则可以代替氧分子使用电子受体(电子媒介体)作为电子受体。通过代替氧分子而使用电子受体，能够不受氧气的影响进行测定。
公知文献中可见到公开了关于阿马多里酶的脱氢酶活性提高：例如，通过将来源于phaeosphaerianodorum的果糖基氨基酸氧化酶的56位天冬酰胺取代为丙氨酸，显示出相对于脱氢酶活性中αfv的vmax/km提高2.3倍(参照专利文献16)。但是，公开的突变体相对于氧化酶活性中αfv的vmax/km与野生型相比提高1.2倍，因此认为依然受到了氧气的影响。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/104203号
专利文献2：国际公开第2005/49857号
专利文献3：日本特开2001-95598号公报
专利文献4：日本特公平05-33997号公报
专利文献5：日本特开平11-127895号公报
专利文献6：国际公开第97/13872号
专利文献7：日本特开2011-229526号公报
专利文献8：日本特开2003-235585号公报
专利文献9：日本特开2004-275013号公报
专利文献10：日本特开2004-275063号公报
专利文献11：日本特开2010-35469号公报
专利文献12：日本特开2010-57474号公报
专利文献13：国际公开第2010/41715号
专利文献14：国际公开第2010/41419号
专利文献15：国际公开第2011/15325号
专利文献16：日本特表2013-500729号公报
非专利文献
非专利文献1：biochem.biophys.res.commun.311,104-11,2003
非专利文献2：biotechnol.bioeng.106,358-66,2010
非专利文献3：j.biosci.bioeng.102,241-3,2006
非专利文献4：eur.j.biochem.242,499-505,1996
非专利文献5：arch.microbiol.178,344-50,2002
非专利文献6：mar.biotechnol.6,625-32,2004
非专利文献7：biosci.biotechnol.biochem.59,487-91,1995
非专利文献8：appl.microbiol.biotechnol.74,813-819,2007
非专利文献9：biosci.biotechnol.biochem.66,1256-61,2002
非专利文献10：biosci.biotechnol.biochem.66,2323-29,2002
非专利文献11：biotechnol.letters27,27-32,2005
技术实现要素：
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供氧化酶活性降低、脱氢酶活性增强的阿马多里酶。此外本发明的目的还在于提供活性几乎不受溶解氧水平影响的阿马多里酶。
解决问题的技术方案
目前的现状是几乎没有公开的用于酶的氧化酶活性降低及赋予脱氢酶活性的信息，在这样的情况中，本发明人进行了反复专心研究，结果发现了对于来源于锥毛壳属的阿马多里酶，通过导入特定的氨基酸残基的取代，能够解决上述问题，从而完成了本发明。
即，本发明包含如下内容。
[1]一种阿马多里酶，其为氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率(ox/dh)与修饰前的阿马多里酶相比发生降低的修饰阿马多里酶，所述修饰阿马多里酶为如下的阿马多里酶：
(i)在将阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1中记载的氨基酸序列进行比对时，序列号1所示的氨基酸序列中选自由280位、267位、269位、54位和241位构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸被取代，且具有脱氢酶活性的阿马多里酶；
(ii)所述(i)的阿马多里酶中，序列号1所示的氨基酸序列中280位、267位、269位、54位和241位所对应位置以外的位置的1个或更多个氨基酸由被取代、缺失或添加的氨基酸序列组成，且具有脱氢酶活性的阿马多里酶；
(iii)所述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号1、序列号3、序列号6、序列号9、序列号10、序列号11、序列号44、序列号53或序列号67的氨基酸序列有70％以上的序列同源性，由序列号1的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列组成的同源性区域中的氨基酸序列与该阿马多里酶的对应位置的同源性区域中的氨基酸序列有90％以上的序列同源性，且具有脱氢酶活性的阿马多里酶；或者
(iv)所述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号1、序列号3、序列号6、序列号9、序列号10、序列号11、序列号44、序列号53或序列号67的氨基酸序列有80％以上的序列同源性，且具有脱氢酶活性的阿马多里酶。
[2]如1所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺构成的组的极性氨基酸；选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成的组的带电氨基酸；或者选自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组的氨基酸；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为选自由天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸或缬氨酸构成的组的氨基酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸或组氨酸构成的组的氨基酸。
[3]如2所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸。
[4]如3所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸。
[5]如3所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或丝氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺。
[6]如3所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或组氨酸；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸。
[7]如3所述的阿马多里酶，其为如下的阿马多里酶：
序列号1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺；
序列号1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸；或者
序列号1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸。
[8]如1～7中任意一项所述的阿马多里酶，其氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率(ox/dh)与修饰前的阿马多里酶(100％)相比，降低至小于80％。
[9]如1～8中任意一项所述的阿马多里酶，其中，所述阿马多里酶来源于锥毛壳(coniochaeta)属、正青霉(eupenicillium)属、棘壳孢(pyrenochaeta)属、节菱孢(arthrinium)属、弯孢(curvularia)属、新赤壳(neocosmospora)属、隐球菌(cryptococcus)属、暗球腔菌(phaeosphaeria)属、曲霉(aspergillus)属、裸孢壳(emericella)属、细基格孢(ulocladium)属、青霉(penicillium)属、镰刀菌(fusarium)属、achaetomiella属、无毛毛壳(achaetomium)属、梭孢壳(thielavia)属、毛壳(chaetomium)属、五谷麻孢壳(gelasinospora)属、小囊菌(microascus)属、小球腔菌(leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(ophiobolus)属、格孢腔菌(pleospora)属、闭毛孢壳(coniochaetidium)属、毕赤酵母(pichia)属、德巴利酵母(debaryomyces)属、棒状杆菌(corynebacterium)属、土壤杆菌(agrobacterium)属或节杆菌(arthrobacter)属。
[10]如1～9中任意一项所述的阿马多里酶，其具有序列号1、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7、序列号8、序列号9、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号44、序列号53或序列号67所示的氨基酸序列，并具有1～7中任意一项规定的氨基酸取代。
[11]如1～10中任意一项所述的阿马多里酶，在将阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述阿马多里酶在序列号1所示的氨基酸序列中选自由如下构成的组的位置所对应位置上进一步有1个以上的氨基酸取代或缺失，且具有脱氢酶活性，
(a)62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位和356位；
(b)262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和81位；以及
(c)羧基末端的435位、436位和437位缺失3个氨基酸残基。
[12]如11所述的阿马多里酶，在将阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述阿马多里酶在序列号1所示的氨基酸序列中选自由如下构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸进一步被取代为选自由如下构成的组的氨基酸或缺失，且具有脱氢酶活性，
(a)62位精氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、
63位亮氨酸所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸或丙氨酸、
102位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、
106位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸、
110位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为亮氨酸或酪氨酸、
113位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸、
355位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丝氨酸、
419位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、
68位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、
356位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为苏氨酸；
(b)262位天冬酰胺所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸、
257位缬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、
249位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
253位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
337位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
340位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸、
232位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
129位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
132位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
133位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、
44位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸、
256位甘氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
231位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸、
81位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；以及
(c)435位脯氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸所对应位置的羧基末端缺失3个氨基酸。
[13]一种hba1c测定试剂盒，其包含1～12中任意一项所述的阿马多里酶。
[14]一种酶电极，其包含1～12中任意一项所述的阿马多里酶。
[15]一种酶传感器，其具有如14所述的酶电极作为工作电极。
[16]一种hba1c的测定方法，其使用1～12中任意一项所述的阿马多里酶、如14所述的酶电极或15所述的酶传感器和电子媒介体。
本说明书包含了本申请的优先权文件日本专利申请号2014-217405的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够提供一种不易受氧气的影响，还可以作为高灵敏度测定的糖尿病诊断用酶，此外在糖尿病标记物测定用传感器中使用的优异的阿马多里酶，以及提供编码该酶的基因等。如果使用该阿马多里酶，则在氧气存在下也能够更准确地进行糖化血红蛋白的测定。
附图说明
图1-1是示例各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的同源性和相似氨基酸的图。除了co、et、py、ar、cc、nv之外，还比对了cn、pn、an、en、ul和pj。
图1-2是图1-1的续图。
图1-3是图1-2的续图。
图1-4是图1-3的续图。
图1-5是图1-4的续图。
图2表示阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性。图2是用于说明酶促反应的示意图，但并不限定酶的底物特异性等特性。
图3-1表示使用cfp―t7阿马多里酶的αfvh的电化学测定结果。
图3-2是图3-1的续图。
图4-1是使用cfp-t7―280q阿马多里酶的αfvh的电化学测定结果。
图4-2是图4-1的续图。
具体实施方式
下面，详细地说明本发明。
本发明的阿马多里酶可以将糖化蛋白、糖化肽作为底物。
(糖化蛋白、血红蛋白a1c)
本发明的糖化蛋白是指非酶糖化的蛋白质。糖化蛋白在生物体内、外均存在，作为在生物体内存在的例子，有血液中的糖化血红蛋白、糖化白蛋白等，在糖化血红蛋白中将血红蛋白的β链氨基末端的缬氨酸被糖化的糖化血红蛋白特别地称为血红蛋白a1c(hba1c)。作为在生物体外存在的例子，有蛋白质、肽与糖共存的液状调味料等饮料食品及输液等。
(糖化肽、果糖基肽)
本发明的糖化肽是指来源于糖化蛋白的非酶糖化的肽，包括肽被直接非酶糖化而成的肽、通过蛋白酶等分解糖化蛋白而结果产生的肽、构成糖化蛋白的(多)肽被糖化而成的肽。有时也将糖化肽称为果糖基肽。糖化蛋白中，作为受到糖化的肽侧的氨基，可举出氨基末端的α-氨基、肽内部的赖氨酸残基侧链的ε-氨基等，本发明的糖化肽更具体地是指α-糖化肽(α-果糖基肽)。α-糖化肽是从n末端的α-氨基酸被糖化的糖化蛋白通过某种手段，例如蛋白酶的限定分解等使其游离而形成的。例如，对象物的糖化蛋白为血红蛋白a1c(hba1c)时，该α-糖化肽是指从n末端被糖化的hba1c的β链切出的糖化的肽。由146残基的氨基酸构成的hba1c的β链也属于α-糖化肽(αf146p)。
一实施方式中本发明的阿马多里酶进行作用的测定物质(底物)为hba1c、更具体地为hba1c的β链。另一实施方式中本发明的阿马多里酶进行作用的测定物质为从hba1c的β链切出的α-糖化肽，例如为αfv～αf128p、αfv～αf64p、αfv～αf32p、αfv～αf16p；例如为αf6p(α-果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸)。另一实施方式中本发明的阿马多里酶进行作用的测定物质为αfvh(α-果糖基缬氨酰基组氨酸)或αfv(α-果糖基缬氨酸)。
(阿马多里酶)
阿马多里酶也称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等，是在氧存在下，催化亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽以及过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶广泛分布于自然界，可以通过探索起源于微生物、动物或植物的酶来获得。微生物中，例如，可以从丝状菌、酵母或细菌等中获得。
本发明阿马多里酶的一个实例是根据具有序列号1所示的氨基酸序列的来源于锥毛壳(coniochaeta)属的阿马多里酶、或者具有序列号6所示的氨基酸序列的来源于棒状弯孢(curvulariaclavata)的阿马多里酶而制作的脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体。
本发明阿马多里酶的一个实例是根据具有序列号3或序列号44所示的氨基酸序列的来源于土正青霉(eupenicilliumterrenum)的阿马多里酶而制作的、脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体。
本发明阿马多里酶的一个实例是根据具有序列号9所示的氨基酸序列的来源于phaeosphaerianodorum的阿马多里酶而制作的脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体。
本发明阿马多里酶的一个实例是根据具有序列号10或序列号序列号53所示的氨基酸序列的来源于构巢曲霉(aspergillusnidulans)的果糖基氨基酸氧化酶而制作的脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体。
本发明阿马多里酶的一个实例是根据具有序列号11或序列号67所示的氨基酸序列的来源于构巢裸孢壳(emericellanidulans)的果糖基肽氧化酶而制作的脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体。
作为这样的突变体的例子，可举出与序列号1、序列号3、序列号6、序列号9、序列号10、序列号11、序列号44、序列号53或序列号67有高序列同源性(例如，70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上)的氨基酸序列的阿马多里酶，以及在序列号1、序列号3、序列号6、序列号9、序列号10、序列号11、序列号44、序列号53或序列号67的氨基酸序列中，有1个至数个的氨基酸被修饰或突变、或者缺失、取代、添加和/或插入而成的氨基酸序列的阿马多里酶。
予以说明，本发明的阿马多里酶可以根据来源于例如正青霉(eupenicillium)属、棘壳孢(pyrenochaeta)属、节菱孢(arthrinium)属、弯孢(curvularia)属、新赤壳(neocosmospora)属、隐球菌(cryptococcus)属、暗球腔菌(phaeosphaeria)属、曲霉(aspergillus)属、裸孢壳(emericella)属、细基格孢(ulocladium)属、青霉(penicillium)属、镰刀菌(fusarium)属、achaetomiella属、无毛毛壳(achaetomium)属、梭孢壳(thielavia)属、毛壳(chaetomium)属、五谷麻孢壳(gelasinospora)属、小囊菌(microascus)属、小球腔菌(leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(ophiobolus)属、格孢腔菌(pleospora)属、闭毛孢壳(coniochaetidium)属、毕赤酵母(pichia)属、棒状杆菌(corynebacterium)属、土壤杆菌(agrobacterium)属、节杆菌(arthrobacter)属等生物种的阿马多里酶制作而成。这些中优选具有脱氢酶活性且/或氨基酸序列如上所述与序列号1具有高序列同源性的阿马多里酶。
氧化酶活性降低、脱氢酶活性提高的阿马多里酶的突变体(修饰体)可以通过在阿马多里酶的氨基酸序列中将至少1个的氨基酸残基进行取代或添加或缺失而得到。
(带来脱氢酶活性提高/氧化酶活性降低的取代)
作为带来脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代，可举出与序列号1所示的氨基酸序列中如下位置的氨基酸所对应位置的氨基酸取代。
(1)280位半胱氨酸的取代，例如被取代为选自由谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺构成的组的极性氨基酸；选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成的组的带电氨基酸；或者选自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组的氨基酸。
(2)267位苯丙氨酸的取代，例如被取代为选自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸构成的组的疏水性氨基酸残基。
(3)269位苯丙氨酸的取代，例如被取代为选自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸构成的组的疏水性氨基酸残基。
(4)54位天冬氨酸的取代，例如被取代为天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
(5)241位酪氨酸的取代，例如被取代为谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸或组氨酸。
本说明书为了方便，有时将谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺称为极性氨基酸。此外有时将天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸称为带电氨基酸。此外有时将丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸称为疏水性氨基酸。此外有时将甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸称为体积大的氨基酸。
本发明的脱氢酶活性提高/氧化酶活性降低的阿马多里酶的突变体可以是有至少1个上述氨基酸取代，也可以是有多个氨基酸取代。例如，有1、2、3、4或5个上述氨基酸取代。
其中，优选具有如下氨基酸位置所对应的氨基酸取代的脱氢酶活性提高且氧化酶活性降低的突变体。
(1)280位半胱氨酸的取代，例如被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸或天冬酰胺。
(2)267位苯丙氨酸的取代，例如被取代为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
(3)269位苯丙氨酸的取代，例如被取代为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
(4)54位天冬氨酸的取代，例如被取代为天冬酰胺、丙氨酸。
(5)241位酪氨酸的取代，例如被取代为谷氨酰胺、赖氨酸或谷氨酸。
本发明的阿马多里酶突变体可在序列号1所示的氨基酸序列中具有带来上述的脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代。而且，本发明的阿马多里酶突变体可以进一步在这些取代氨基酸以外的位置将1个或数个(例如1～15个、例如1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1～3个、特别优选为1个)的氨基酸进行缺失、插入、添加和/或取代。本发明进一步包含如下的阿马多里酶突变体，该阿马多里酶突变体具有带来上述的脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸的取代突变、提高底物特异性等脱氢酶活性提高以外性质的氨基酸的取代突变，相对于序列号1所示的氨基酸序列中除了所述取代的氨基酸以外的氨基酸部分的氨基酸序列，有70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的氨基酸序列同源性，具有阿马多里酶活性，脱氢酶活性被修改。
予以说明，具有序列号1所示的氨基酸序列的阿马多里酶是在国际公开2007/125779号中由保有称为pkk223-3-cfp-t7重组质粒(保藏编号：fermbp-10593)的大肠杆菌生产的来源于锥毛壳属的阿马多里酶(cfp-t7)，为申请人之前发现的热稳定性优异的修饰型阿马多里酶。该cfp-t7为相对于来源于天然型锥毛壳属的阿马多里酶，在272位、302位和388位依次导入人工突变而获得的三重突变体。
上述的氨基酸取代中，氨基酸位置表示序列号1所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置，在来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中，序列号1所示的氨基酸序列中的位置所对应位置的氨基酸被取代。关于“对应位置”的含义在后记述。
(进一步取代)
(关于使阿马多里酶的底物特异性发生变化的氨基酸取代)
本发明人以前报告过通过取代阿马多里酶的氨基酸残基能够使其底物特异性发生变化(例如参照国际公开2013/162035号并通过参照将其全部内容并入本说明书中)。本发明的阿马多里酶根据情况可以进一步有这类氨基酸取代。
作为使阿马多里酶的底物特异性发生变化的氨基酸取代，可举出序列号1所示的氨基酸序列中如下位置的氨基酸所对应位置的氨基酸取代。
(a)62位精氨酸
(b)63位亮氨酸
(c)102位谷氨酸
(d)106位天冬氨酸
(e)110位谷氨酰胺
(f)113位丙氨酸
(g)355位丙氨酸
(h)419位丙氨酸
(i)68位天冬氨酸
(j)356位丙氨酸
根据情况62位精氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。
根据情况(b)63位亮氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为组氨酸或丙氨酸。
根据情况(c)102位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸。
根据情况(d)106位天冬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。
根据情况(e)110位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸可以被取代为亮氨酸或酪氨酸。
根据情况(f)113位丙氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸或精氨酸。
根据情况(g)355位丙氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为丝氨酸。
根据情况(h)419位丙氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸。
根据情况(i)68位天冬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为天冬酰胺。
根据情况(j)356位丙氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为苏氨酸。
(关于使阿马多里酶的表面活性剂耐受性提高的氨基酸取代)
本发明人确认到通过取代阿马多里酶的氨基酸残基能够使其表面活性剂耐受性提高。例如参照日本特愿2013-221515号和pct/jp2014/071036号说明书。这些文献通过参照将其全部内容并入本说明书中。
作为使阿马多里酶的表面活性剂耐受性提高的氨基酸取代，可举出序列号1所示的氨基酸序列中如下位置的氨基酸所对应位置的氨基酸取代。
(i)262位天冬酰胺、
(ii)257位缬氨酸、
(iii)249位谷氨酸
(iv)253位谷氨酸、
(v)337位谷氨酰胺、
(vi)340位谷氨酸、
(vii)232位天冬氨酸、
(viii)129位天冬氨酸、
(ix)132位天冬氨酸、
(x)133位谷氨酸、
(xi)44位谷氨酸、
(xii)256位甘氨酸、
(xiii)231位谷氨酸、和
(xiv)81位谷氨酸、
根据情况262位天冬酰胺所对应位置的氨基酸可以被取代为组氨酸。
根据情况257位缬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸。
根据情况249位谷氨酸所对应位置的氨基酸以被取代为赖氨酸、精氨酸可。
根据情况253位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况337位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况340位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。
根据情况232位天冬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况129位天冬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况132位天冬氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况133位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸。
根据情况44位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。
根据情况256位甘氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况231位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
根据情况81位谷氨酸所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
(关于使阿马多里酶的热稳定性提高的氨基酸缺失)
本发明人以前报告过通过从阿马多里酶的羧基末端缺失3个氨基酸残基，能够使其热稳定性提高(参照国际公开第2013/100006号说明书并通过参照将其全部内容并入本说明书中)。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶除了上述的取代之外可以进一步缺失从羧基末端起的3个氨基酸残基。本说明书中有时将从羧基末端起的3个氨基酸残基缺失称为使热稳定性提高的缺失。
(编码阿马多里酶的基因的获得)
为了得到这些编码阿马多里酶的本发明基因(下面也仅称为“阿马多里酶基因”)，通常利用一般使用的基因克隆方法。例如，可以从具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体及各种细胞，利用常规方法例如，currentprotocolsinmolecularbiology(wileyinterscience，1989)记载的方法，提取染色体dna或mrna。还可以将mrna作为模板来合成cdna。使用这样得到的染色体dna或cdna，能够制作染色体dna或cdna文库。
接着，根据上述阿马多里酶的氨基酸序列，合成适当的探针dna，利用使用其从染色体dna或cdna文库中筛选阿马多里酶基因的方法；或者根据上述氨基酸序列，制作适当的引物dna，利用5’race法及3’race法等适当的聚合酶链反应(pcr法)，扩增包含编码阿马多里酶的目的基因片段的dna，连接这些dna片段，能够得到包含目标阿马多里酶基因全长的dna。
作为这样得到的编码阿马多里酶的基因的优选一例，可举出来源于锥毛壳属的阿马多里酶基因(日本特开2003-235585号公报)的例子等。
这些阿马多里酶基因从操作上优选按照常规方法连接到各种载体。例如，可举出将编码来源于锥毛壳属nisl9330株的阿马多里酶基因的dna插入到pkk223-3载体(gehealthcare公司制)中而得到的重组质粒pkk223-3-cfp(日本特开2003-235585号公报)。
(载体)
作为本发明中可使用的载体，并不限定为上述质粒，可以使用除上述以外的例如噬菌体、粘粒等本领域技术人员公知的任意载体。具体地优选例如pbluescriptiisk+(stratagene公司制)等。
(阿马多里酶基因的突变处理)
阿马多里酶基因的突变处理可以根据预期的突变形式，利用任何公知的方法来进行。即，可以广泛采用使阿马多里酶基因或者整合了该基因的重组dna与作为突变原的药剂进行接触/作用的方法；紫外线照射法；基因工程手段；或者运用蛋白质工程手段的方法等。
作为上述突变处理中使用的突变原的药剂，例如，可举出羟基胺、n-甲基-n’-硝基-n-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸或5-溴尿嘧啶等。
上述接触/作用的各条件可以采用与使用的药剂种类等相应的条件，只要是实际中在阿马多里酶基因中引起所期望的突变就没有特别限定。通常，优选在0.5～12m的上述药剂浓度，在20～80℃的反应温度下接触/作用10分钟以上、优选为10～180分钟，由此能够引起所期望的突变。在进行紫外线照射时，也可以按照如上所述的常规方法进行(现代化学，p24～30，1989年6月号)。
作为运用蛋白质工程手段的方法，一般采用作为位点特异性突变(site-specificmutagenesis)而已知的手段。例如，可举出kramer法(nucleicacidsres.，12，9441(1984)：methodsenzymol.，154，350(1987)：gene，37，73(1985))、eckstein法(nucleicacidsres.，13，8749(1985)：nucleicacidsres.，13，8765(1985)：nucleicacidsres，14，9679(1986))、kunkel法(proc.natl.acid.sci.u.s.a.，82，488(1985)：methodsenzymol.，154，367(1987))等。作为改变dna中的碱基序列的具体方法，例如可举出利用市售的试剂盒(transformermutagenesiskit，clonetech公司；exoiii/mungbeandeletionkit，stratagene公司制；quickchangesite-directedmutagenesiskit，stratagene公司制等)。
另外，也可以使用作为一般的pcr法(聚合酶链反应，polymerasechainreaction)而已知的手段(technique，1，11(1989))。予以说明，除了上述基因修饰法之外，也可以通过有机合成法或酶合成法来直接合成所期望的修饰阿马多里酶基因。
对通过上述方法得到的阿马多里酶基因的dna碱基序列进行确定或确认时，例如可以使用多毛细管dna分析系统ceq2000(beckmancoulter公司制)等来进行。
(转化/转导)
可通过常规方法将如上所述得到的阿马多里酶基因整合到噬菌体、粘粒、或者原核细胞或真核细胞的转化中使用的质粒等载体上，再通过常规方法对与各载体对应的宿主进行转化或转导。例如，可以使用得到的重组dna，对任意宿主进行转化或转导到这些宿主中而得到各菌株，例如属于埃希氏菌属的微生物，作为具体例为大肠杆菌k-12株、优选大肠杆菌jm109株、大肠杆菌dh5α株(均为宝生物工程株式会社制)及大肠杆菌b株，优选大肠杆菌bl21株(株式会社nippongene制)等。
(氨基酸序列的同源性或相似性)
氨基酸序列的同源性或相似性可以通过genetyxver.11(株式会社genetyx制)的最大匹配及同源性检索等程序或dnasispro(株式会社日立解决方案制)的最大匹配及多序列比对等程序进行计算。为了计算氨基酸序列同源性，在比对2个以上的阿马多里酶时，可以研究该2个以上的阿马多里酶中相同的氨基酸位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的相同区域。
另外，也可以研究2个以上的阿马多里酶中相似的氨基酸位置。例如使用clustalw能够比对多个氨基酸序列，此时，算法使用blosum62，在比对多个氨基酸序列时，有时将判断为相似的氨基酸称为相似氨基酸。本发明的突变体中，氨基酸取代可以由这类相似氨基酸间的取代而成的突变体。通过所述比对，对于多个氨基酸序列，可以研究氨基酸序列相同的区域和被相似氨基酸占据的位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的同源性区域(保守区域)。
本说明书中“同源性区域”是指在比对2个以上的阿马多里酶时，某一基准的阿马多里酶与比较对象的阿马多里酶的对应位置中氨基酸为由相同或相似氨基酸组成的区域，为由连续的3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上的氨基酸组成的区域。例如，图1中比对了全长氨基酸序列的序列同源性为74％以上的阿马多里酶。其中，以序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第10位～32位为由相同或相似氨基酸组成，因此属于同源性区域。同样以序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位能属于同源性区域。
优选的阿马多里酶的同源性区域是以序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，由第11位～32位、36～41位、50～52位、54～58位、84～86位、88～90位、145～150位、157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位、和405～410位的氨基酸序列组成的区域。
进一步优选的阿马多里酶的同源性区域是以序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，由第11～18位、20～32位、50～52位、54～58位、266～268位、270～273位、277～286位、和370～383位的氨基酸序列组成的区域。
本发明的阿马多里酶突变体在与有序列号1、序列号3、序列号6、序列号9、序列号10、序列号11、序列号44、序列号53或序列号67所示的氨基酸序列的阿马多里酶进行比对时，为有50％以上、例如60％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全长氨基酸序列同源性，并具有脱氢酶活性。进一步，本发明的阿马多里酶突变体的同源性区域中的氨基酸序列与序列号1中的同源性区域的氨基酸序列有75％以上、例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的序列同源性。
(氨基酸所对应位置的确定)
“氨基酸所对应的位置”是指序列号1所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的特定位置的氨基酸所对应的来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。
作为确定“氨基酸所对应的位置”的方法，例如可以通过利用lipman-pearson法等公知算法对氨基酸序列进行比较，对存在于各阿马多里酶的氨基酸序列中的保守氨基酸残基赋予最大的同源性来进行。通过用这样方法排列阿马多里酶的氨基酸序列，能够不管氨基酸序列中存在的插入、缺失，而确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列中序列中的位置。认为相同位置在三维结构中存在于同位置，能够推定具有与作为对象的阿马多里酶的特异性功能相关的相似效果。
图1-1、1-2、1-3、1-4、1-5示例了来源于各种公知的生物种的阿马多里酶序列。序列号1表示的氨基酸序列如最上列所示。图1中所示的各种序列均与序列号1的序列有70％以上的同源性并利用公知算法进行排列。图中示出了本发明的突变体中的突变点。由图1-1、1-2、1-3、1-4、1-5可知来源于锥毛壳(coniochaeta)属的阿马多里酶的氨基酸序列中的特定位置的氨基酸所对应的来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中位置。图1-1、1-2、1-3、1-4、1-5中示出了来源于锥毛壳属的阿马多里酶(序列号1)、来源于土正青霉(eupenicilliumterrenum)的阿马多里酶(序列号3)、来源于棘壳孢属(pyrenochaetasp.)的酮胺氧化酶(序列号4)、来源于节菱孢属(arthriniumsp.)的酮胺氧化酶(序列号5)、来源于棒状弯孢(curvulariaclavata)的酮胺氧化酶(序列号6)、来源于侵管新赤壳(neocosmosporavasinfecta)的酮胺氧化酶(序列号7)、来源于新型隐球菌(cryptococcusneoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号8)、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶(序列号9)、来源于构巢曲霉(aspergillusnidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号10)、来源于构巢裸孢壳(emericellanidulans)的果糖基肽氧化酶(序列号11)、来源于细基格孢属(ulocladiumsp.)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号12)和来源于微紫青霉(penicilliumjanthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(序列号13)的氨基酸序列。
(取代位置所对应的位置)
予以说明，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的280位半胱氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基(相当于位置的氨基酸残基)”的方法对氨基酸序列进行排列的图1-3来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为280位半胱氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为278位半胱氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为280位半胱氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为278位半胱氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为280位半胱氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为276位半胱氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为280位半胱氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为278位半胱氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的267位苯丙氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1-3来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为267位苯丙氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为265位苯丙氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为265位苯丙氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为263位苯丙氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为265位苯丙氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为267位苯丙氨酸。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的269位苯丙氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1中记载的氨基酸序列的269位苯丙氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1-3来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为269位苯丙氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为269位苯丙氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为269位苯丙氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为269位苯丙氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为265位苯丙氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为269位苯丙氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为269位异亮氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为267位苯丙氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为269位苯丙氨酸。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的54位天冬氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1中记载的氨基酸序列的54位天冬氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1-1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为54位天冬氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为53位天冬氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为53位天冬氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为54位天冬氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为54位天冬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的241位酪氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的241位酪氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1-3来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为241位苯丙氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为239位酪氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为241位酪氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为239位酪氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为241位酪氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为241位酪氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为237位酪氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为241位苯丙氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为241位苯丙氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为239位酪氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为241位苯丙氨酸。
(底物特异性修饰突变的对应位置)
予以说明，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的62位精氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的62位精氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的62位精氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于节菱孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为62位精氨酸；在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为62位丝氨酸；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为61位精氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为61位精氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的63位亮氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的63位亮氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的63位亮氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于节菱孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为63位亮氨酸；在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为63位异亮氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为62位亮氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的102位谷氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的102位谷氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的102位谷氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为102位谷氨酸；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于节菱孢属的酮胺氧化酶、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为102位赖氨酸；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶、来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为101位谷氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的106位天冬氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的106位天冬氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的106位天冬氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶中为106位天冬酰胺；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为106位天冬氨酸；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为106位丙氨酸；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为106位甘氨酸；在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为106位丝氨酸；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为105位赖氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为105位甘氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的110位谷氨酰胺所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的110位谷氨酰胺所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的110位谷氨酰胺所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为110位赖氨酸；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为110位丙氨酸；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为110位谷氨酰胺；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为110位谷氨酸；在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为110位丝氨酸；在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为110位甘氨酸；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为109位精氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为109位赖氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的113位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的113位丙氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的113位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为113位苏氨酸；在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为113位丙氨酸；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为113位赖氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶、来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为112位丝氨酸；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为113位天冬氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的355位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的355位丙氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的355位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶、来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为355位丙氨酸；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为353位丙氨酸；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为356位丙氨酸；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为355位丝氨酸；在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为351位丙氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的419位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的419位丙氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的419位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶中为419位甘氨酸；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为418位丙氨酸；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为421位丙氨酸；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为420位丙氨酸；在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为416位丝氨酸；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为419位丝氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为420位丙氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的68位天冬氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的68位天冬氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的68位天冬氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶、来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶、来源于节菱孢属的酮胺氧化酶、来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶、来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶、来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶、来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶、来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶、来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为68位天冬氨酸；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶和来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为67位天冬氨酸。
另外，本发明中“序列号1中记载的氨基酸序列的356位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的356位丙氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列并确定。
即，“序列号1中记载的氨基酸序列的356位丙氨酸所对应的位置”的氨基酸在来源于土正青霉的阿马多里酶中为356位天冬酰胺、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为354位丙氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为357位丙氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为354位丙氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为356位丙氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为356位天冬酰胺、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为352位丙氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为356位天冬酰胺、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为356位天冬酰胺、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为354位丙氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为356位天冬酰胺。
(表面活性剂耐受性提高突变的对应位置)
予以说明，本说明书中“序列号1中记载的氨基酸序列的44位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的44位谷氨酸所对应的氨基酸。由此，可以通过用上述确定“对应位置的氨基酸残基”的方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为44位赖氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为44位亮氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为43位脯氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为43位脯氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为44位脯氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为44位脯氨酸。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的81位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的81位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为81位天冬酰胺、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为81位谷氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为81位组氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为81位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为81位天冬酰胺、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为81位天冬酰胺、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为81位谷氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为80位天冬酰胺、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为80位天冬酰胺、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为81位谷氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为81位天冬酰胺。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的133位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1中记载的氨基酸序列的133位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为133位谷氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为133位谷氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为133位丙氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为133位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为133位丙氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为133位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为131位谷氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为132位谷氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为132位谷氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为133位赖氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为133位天冬氨酸。
另外，“序列号1中记载的氨基酸序列的253位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1中记载的氨基酸序列的253位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为253位丙氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为251位丙氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为253位谷氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为251位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为253位缬氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为253位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为249位精氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为253位丙氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为253位丙氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为251位谷氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为253位谷氨酰胺。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的256位甘氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的256位甘氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为256位天冬酰胺、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为254位天冬氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为256位甘氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为254位天冬酰胺、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为256位甘氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为256位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为252位天冬酰胺、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为256位天冬酰胺、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为256位天冬酰胺、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为254位天冬酰胺、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为256位天冬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的257位缬氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的257位缬氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为257位缬氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为255位苏氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为257位半胱氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为255位缬氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为257位半胱氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为257位半胱氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为253位丝氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为257位苏氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为257位苏氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为255位缬氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为257位缬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的262位天冬酰胺所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的262位天冬酰胺所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为262位天冬氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为260位天冬酰胺、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为262位组氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为260位天冬酰胺、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为262位组氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为262位天冬酰胺、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为258位天冬酰胺、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为262位天冬氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为262位天冬氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为260位天冬酰胺、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为262位天冬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的337位谷氨酰胺所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的337位谷氨酰胺所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为337位赖氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为335位赖氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为338位谷氨酰胺、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为335位苏氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为337位赖氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为337位赖氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为333位赖氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为337位天冬酰胺、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为337位天冬酰胺、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为335位苏氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为337位赖氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的340位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的340位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为340位谷氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为338位谷氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为341位谷氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为338位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为340位脯氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为340位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为336位赖氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为340位谷氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为340位谷氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为338位谷氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为340位谷氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的129位天冬氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的129位天冬氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为129位谷氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为129位天冬氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为129位天冬氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为129位天冬氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为129位天冬氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为129位丝氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为127位天冬氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为128位谷氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为128位谷氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为129位天冬氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为129位谷氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的132位天冬氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的132位天冬氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为132位天冬氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为132位天冬氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为132位天冬氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为132位天冬氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为132位谷氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为132位天冬氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为130位天冬氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为131位天冬氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为131位天冬氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为132位天冬氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为132位天冬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的231位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的231位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为231位谷氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为229位谷氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为231位谷氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为229位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为231位谷氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为231位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为227位组氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为231位谷氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为231位谷氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为229位谷氨酰胺、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为231位谷氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的232位天冬氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的232位天冬氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为232位天冬氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为230位天冬氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为232位谷氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为230位天冬氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为232位谷氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为232位甘氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为228位谷氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为232位谷氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为232位谷氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为230位天冬氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为232位天冬氨酸。
进一步，“序列号1中记载的氨基酸序列的249位谷氨酸所对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，序列号1的阿马多里酶的249位谷氨酸所对应的氨基酸。这也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为249位赖氨酸、在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为247位赖氨酸、在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为249位组氨酸、在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为247位谷氨酸、在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为249位谷氨酸、在来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为249位谷氨酸、在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为245位谷氨酸、在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为249位丙氨酸、在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为249位丙氨酸、在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为247位丝氨酸、在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为249位谷氨酰胺。
(热稳定性提高缺失的对应位置)
本说明书中“从序列号1记载的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”是指将阿马多里酶的氨基酸序列在与序列号1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，从序列号1中记载的氨基酸序列的羧基末端起的3个氨基酸残基。来源于锥毛壳属的阿马多里酶中该位置的3个残基序列由435位脯氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成，对应于这些位置的氨基酸序列也可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1来确定。
即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位组氨酸和437位亮氨酸组成；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由438位丙氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸组成；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由450位组氨酸、451位赖氨酸和452位亮氨酸组成；在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由438位丝氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸组成；在来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位天冬酰胺和437位亮氨酸组成；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨酸组成；在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨酸组成；在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由439位丙氨酸、440位赖氨酸和441位亮氨酸组成；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成。
(本发明阿马多里酶的生产)
在使用具有如上所述得到的阿马多里酶生产能力的菌株进行生成该阿马多里酶时，可以利用通常的固体培养法培养该菌株，在可能的范围内优选采用液体培养法进行培养。
另外，作为培养上述菌株的培养基，例如，可使用如下得到的培养基：在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆或者小麦麸的浸出液等一种以上的氮源中添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等一种以上的无机盐，根据需要进一步适当添加糖质原料、维生素等而成。
予以说明，培养基的初始ph值优选调整为ph7～9。
另外，培养可以采用任意的条件，例如，可以通过深层通气搅拌培养、振荡培养、静置培养等在20～42℃的培养温度、优选30℃左右的培养温度下实施4～24小时、进一步优选在30℃左右的培养温度下实施8～16小时。
培养结束后，由该培养物采集阿马多里酶可以使用通常的酶采集手段而得到。例如，可以通过常规方法对菌体实施超声波破坏处理、研磨处理等、或者使用溶菌酶等裂解酶提取该酶、或者在甲苯等存在下振荡或者放置进行溶菌，使该酶向菌体外排出。然后，过滤该溶液并进行离心分离等除去固体部分，根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐或硫酸锰等除去核酸后，向其中添加硫酸铵、乙醇、丙酮等并进行分离，采集沉淀物，从而得到阿马多里酶的粗酶。
为了由上述阿马多里酶的粗酶进一步得到阿马多里酶纯化酶标准品，例如，可适当选择使用sephadex、superdex或ultrogel等的凝胶过滤法；使用离子交换体的吸附溶出法；使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法；使用羟基磷灰石的吸附溶出法；蔗糖密度梯度离心法等沉降法；亲和层析法；使用分子筛膜或者中空纤维膜等的分离法等，或将这些方法组合实施，从而能够得到经纯化的阿马多里酶酶标准品。由此，能够得到所期望的脱氢酶活性提高的阿马多里酶。
本发明试剂盒所包含的阿马多里酶可以是来源于正青霉属、棘壳孢属、节菱孢属、弯孢属、新赤壳属、隐球菌属、暗球腔菌属、曲霉属、裸孢壳属、细基格孢属、青霉属、镰刀菌属、achaetomiella属、无毛毛壳属、梭孢壳属、毛壳属、五谷麻孢壳属、小囊菌属、小球腔菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、闭毛孢壳属、毕赤酵母菌属、棒状杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属等的天然的阿马多里酶或它们的突变体。这样的突变体在选自于序列号1所示的氨基酸序列的280位半胱氨酸、267位苯丙氨酸、269位苯丙氨酸、54位天冬氨酸、241位酪氨酸的位置的氨基酸所对应位置上有1个或1个以上的氨基酸取代。本领域技术人员可以通过例如后述的试验法等，容易地研究出某种阿马多里酶或其突变体是否能用于本发明的试剂盒，即是否具有所期望的脱氢酶活性。
(本发明阿马多里酶中的脱氢酶活性的提高)
通过如上所述的手段得到的本发明阿马多里酶的特征在于利用基因修饰等使其氨基酸序列产生突变，结果与修饰前的阿马多里酶相比，氧化酶活性降低、且/或脱氢酶活性提高。具体的特征在于与修饰前的阿马多里酶相比，相当于“脱氢酶活性”的“氧化酶活性”的比率降低。氧化酶活性是指在氧化底物时，向氧分子传递电子的活性。脱氢酶活性是指在氧化底物时，将氢(h-)传递到电子受体的活性。
在使用传感器的糖化血红蛋白的测定中，为了降低氧气的影响，希望氧化酶活性低。另一方面，从与底物的反应性角度出发，则优选脱氢酶的活性高。如果兼具考虑二者，在使用电子媒介体的糖化血红蛋白测定中，优选阿马多里酶的氧化酶活性(ox)与脱氢酶活性(dh)之比ox/dh为低，此外，优选阿马多里酶的氧化酶活性(ox)低且脱氢酶活性(dh)高。所以本说明书中为了方便起见，有时使用脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率dh/ox或者氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率ox/dh来表示阿马多里酶的特性。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性增强。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，氧化酶活性降低。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性与氧化酶活性之比ox/dh比低(dh/ox比高)。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，不仅脱氢酶活性增强，而且氧化酶活性降低。具体地，本发明的修饰阿马多里酶中的表示脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率dh/ox，与修饰前(1.0倍)相比，优选增强1.3倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、例如450倍以上。此外，本发明的修饰阿马多里酶中的表示氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率ox/dh，与修饰前(100％)相比，优选降低至小于90％、小于80％、小于75％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、0.5％、例如小于0.2％。
氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率可以使用公知的阿马多里酶测定法在任意条件下进行测定，并与修饰前的阿马多里酶进行比较。例如，在ph7.0时，用添加1mm的某种糖化底物例如添加αfv而测定的脱氢酶活性除以添加1mm的该糖化底物例如添加αfv而测定的氧化酶活性而求出比率，由此计算出氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率，从而能够将其在修饰前与修饰后的阿马多里酶中进行比较。
(高通量筛选)
为了获得功能性阿马多里酶突变体还可以将阿马多里酶用于高通量筛选。例如制作具有导入突变的阿马多里酶基因的转化或转导株的文库，可以将其用于基于微量滴定板的高通量筛选、或者可以将其用于基于液滴型微流体的超高通量筛选。作为例子，可举出构建编码突变的突变基因的组合文库，接着利用噬菌体展示技术(例如chem.rev.105(11)：4056-72,2005)、酵母展示技术(例如combchemhighthroughputscreen.2008；11(2)：127-34)、细菌展示技术(例如curropinstructbiol17：474-80,2007)等，对突变阿马多里酶的大群落进行筛选的方法。此外参照agrestietal,"ultrahigh-throughputscreeningindrop-basedmicrofluidicsfordirectedevolution"proceedingsofthenationalacademyofsciences107(9)：4004-4009(mar,2010)。关于可用于阿马多里酶突变筛选的超高通量筛选手段的该文献的记载通过参照并入本说明书中。例如可通过错配pcr法来构建文库。此外也可以使用饱和诱变，以本说明书所记载的位置或其所对应位置为目标导入突变来构建文库。利用文库转化电转化感受态eby-100细胞等适当的细胞，可获得约107个突变体。可将用该文库转化的酵母细胞接着用于细胞分选。也可以使用利用标准软光刻法制作的聚二甲基硅氧烷(pdms)微流体装置。可使用流动聚焦装置形成单分散的液滴。将含有个别突变体而形成的液滴用于适当的分选装置中。在分选细胞时可利用有无脱氢酶活性。突变导入和分选可以重复多次。
(阿马多里酶活性的测定方法)
阿马多里酶的活性具有氧化酶活性与脱氢酶活性，可以通过使用各种方法进行测定。作为一例，下面对本发明中使用的阿马多里酶活性的测定方法进行说明。
(阿马多里酶的氧化酶活性的测定方法)
作为本发明中阿马多里酶的氧化酶活性的测定方法，可举出测定由酶促反应而生成的过氧化氢量的方法、测定由酶促反应而消耗的氧量的方法等作为主要的测定方法。下面作为一例，示出测定过氧化氢量的方法。
下面除非另有说明，则在本发明中阿马多里酶的氧化酶活性测定中使用果糖基缬氨酸作为底物。予以说明，在一实施方式中，酶效价在使用果糖基缬氨酸为底物进行测定时，每分钟生成1μmol过氧化氢的酶量定为1u。果糖基缬氨酸等糖化氨基酸、以及果糖基缬氨酰基组氨酸等糖化肽可根据阪上等人的方法进行合成、纯化(参照日本特开2001-95598号)。予以说明，这是为了说明测定方法的方便，但本发明中使用的阿马多里酶的底物特异性绝不限于果糖基缬氨酸。
a.试剂的制备
(1)试剂1：pod-4-aa溶液
将4.0ku的过氧化酶(龟甲万株式会社制)、100mg的4-氨基安替比林(东京化成工业株式会社制)溶解于0.1m的磷酸钾缓冲液(ph7.0)中，定容至1l。
(2)试剂2：toos溶液
500mg的toos(n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲基苯胺钠、株式会社同仁化学研究所制)溶解于离子交换水中，定容至100ml。
(3)试剂3：底物溶液(30mm；终浓度1mm)
将果糖基缬氨酸83mg溶解于离子交换水中，定容至10ml。
b.测定法
混合2.7ml的试剂1，100μl的试剂2、和100μl的试剂3，在37℃下预加温5分钟。然后，加入100μl的酶液并充分混合后，利用分光光度计(u-3010，株式会社日立高新技术制)测定555nm处的吸光度。测定值为在555nm处1分钟后至3分钟后的每分钟的吸光度变化。予以说明，对照液除了加入100μl的离子交换水代替100μl的试剂3以外，与上述同样地制备。将在37℃下每分钟生成的过氧化氢的微摩尔数作为酶液中的活性单位(u)，并按照下述式计算。
活性(u/ml)＝{(δas-δa0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
δas：反应液每分钟的吸光度变化
δa0：对照液每分钟的吸光度变化
39.2：反应生成的醌亚胺的毫摩尔吸光系数(mm-1·cm-1)
0.5：每mol过氧化氢生成的醌亚胺色素的mol数
df：稀释系数。
(阿马多里酶的脱氢酶活性的测定方法)
作为本发明中阿马多里酶的脱氢酶活性的测定方法，可举出利用氧以外的电子媒介体作为电子受体，对氧化型电子媒介体的消耗量进行测定的方法、对由酶促反应得到的甲
下面除非另有说明，则在本发明中阿马多里酶的氧化酶活性测定中使用果糖基缬氨酸作为底物。予以说明，酶效价在使用果糖基缬氨酸为底物进行测定时，每分钟生成1μmol甲
c.试剂的制备
(4)试剂4：wst-3溶液
将700mg的wst-3(2-(4-碘苯)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二磺基苯)-2h-四氮唑单钠盐，株式会社同仁化学研究所制)溶解于离子交换水(ph7.0)中，定容至100ml。
(5)试剂5：甲氧基pms(mpms)溶液
将50mg的mpms(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐，株式会社同仁化学研究所制)溶解于离子交换水中，定容至10ml。
d.测定法
在541μl的95mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)中混和150μl的试剂4、9μl的试剂5和25μl的酶液，在37℃下预加温5分钟。然后，加入25μl的试剂3并充分混合后，利用分光光度计(u-3010，株式会社日立高新技术制)测定在433nm处的吸光度。测定值为在433nm处1分钟后至2分钟后的每分钟的吸光度变化。予以说明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的试剂3以外，与上述同样地制备。将在37℃下每分钟生成的wst-3的甲
活性(u/ml)＝{(δas-δa0)×0.75×df}÷(31×0.025)
δas：反应液每分钟的吸光度变化
δa0：对照液每分钟的吸光度变化
31：反应生成的wst-3的甲
df：稀释系数。
(测定试剂盒、传感器)
一实施方式中，本发明提供包含脱氢酶活性提高的本发明阿马多里酶的hba1c测定试剂盒及hba1c测定装置。该试剂盒或装置根据情况也可以含有电子媒介体。
一实施方式中，本发明提供包含脱氢酶活性提高的本发明阿马多里酶的固定酶电极。一实施方式中，脱氢酶活性提高的本发明阿马多里酶可以涂布、吸附或固定化于酶电极上。另一实施方式中，电子媒介体也可以涂布、吸附或固定化于电极上。作为电极可以使用碳素电极、铂、金、银、镍、钯等金属电极等。碳素电极时，作为材料可举出热解石墨(pg)、玻璃碳(gc)、碳糊、塑性成型炭(pfc)等。测定体系可以是二电极系也可以是三电极系，例如可在工作电极上固定酶。作为参比电极，可举出标准氢电极、可逆氢电极、银-氯化银电极(ag/agcl)、钯-氢电极、饱和甘汞电极等，从稳定性及再现性的角度出发，优选使用ag/agcl。
酶可通过交联、透析膜的包覆、包封到聚合物基质、使用光交联聚合物、使用导电性聚合物、使用氧化/还原聚合物等固定在电极上。此外也可以将酶与电子媒介体一起固定在聚合物中或者吸附固定在电极上，也可以组合这些手段。
本发明的阿马多里酶通过使用恒电位仪、恒电流仪等，可以适用于各种电化学测定手段。作为电化学测定法，可举出电流测定法、电势测定法、电量测定法等各种手段。例如通过电流测定法对被还原的媒介体被外加电压氧化时产生的电流值进行测定，由此可以计算样品中糖化底物的浓度。外加电压也根据媒介体及装置设定，例如可设为-1000～+1000mv(相对于ag/agcl)等。
糖化底物(例如αfvh)浓度的测定，例如可如下所述进行。恒温皿中放入缓冲液，保持一定温度。作为媒介体，可使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等。作为工作电极使用固定化本发明修饰型阿马多里酶的电极，并使用对电极(例如铂电极)和参比电极(例如ag/agcl电极)。向碳电极外加一定电压，电流稳定后，加入含有糖化底物(例如αfvh)的样品测定电流的增加。按照由标准浓度的糖化底物(例如αfvh)溶液制作的校准曲线，可以计算样品中的糖化底物(αfvh)浓度。
进一步，为了降低测定所需的溶液量，可使用印刷电极。此时，电极优选在绝缘基板上形成。具体地为理想地利用光刻技术、丝网印刷、凹版印刷、柔性版印刷等印刷技术在基板上形成电极。此外，作为绝缘基板的原材料，可举出硅、玻璃、陶瓷、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯等，更优选对各种溶剂及化学品耐受性强的材料。
一实施方式中，本发明提供包括该酶电极的传感器。
另一实施方式中，可利用本发明的酶电极，通过测定由酶促反应产生的电流，从而确定样品中的阿马多里化合物的浓度。作为一例，将酶电极作为工作电极，将其与对电极和参比电极一起使用。对电极可为例如铂电极，参比电极可为例如ag/agcl电极。保持一定温度，将电极插入含有媒介体的缓冲液中。对工作电极外加电压，添加样品后，测定电流变化。
本发明的测定方法、试剂盒、装置及用于传感器的媒介体(也称为人工电子媒介体、人工电子受体、电子媒介体)只要是从脱氢酶活性提高的本发明阿马多里酶接受电子则无特别限定。作为媒介体，醌类、吩嗪类、紫精类、细胞色素类、吩噁嗪类、吩噻嗪类、铁氰化物例如铁氰化钾、铁氧还蛋白类、二茂铁、锇配合物及其衍生物等，作为吩嗪化合物可举出例如pms、甲氧基pms，但并不限定于这些。
一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶的脱氢酶活性提高。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶的氧化酶活性降低。一实施方式中，本发明的修饰阿马多里酶的氧化酶活性/脱氢酶活性比(ox/dh比)降低。此外一实施方式中，本发明的修饰阿马多里酶的脱氢酶活性提高、且氧化酶活性降低。这样的本发明的修饰阿马多里酶的催化酶促反应不受、几乎不受或不易受氧气的影响。本发明的修饰阿马多里酶可以与现有的阿马多里酶用于相同的用途。此外，本发明的阿马多里酶可以用于样品中的糖化底物浓度的测定，这能有助于例如糖尿病的诊断。此外，本发明的阿马多里酶可以作为酶电极进行使用。这可以用于各种电化学的测定。此外，本发明的阿马多里酶可以作为酶传感器进行使用。此外，本发明的阿马多里酶可以用在糖尿病标记物的测定试剂盒中。但这是示例，本发明的修饰阿马多里酶的用途并不限于这些。
[实施例1]
(关于脱氢酶活性提高型突变)
(1)重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna的制备
将具有包含cfp-t7基因(序列号2)的重组体质粒的大肠杆菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株(参照国际公开2007/125779号)接种于lb-amp培养基[1％(w/v)bacto胰蛋白胨、0.5％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)nacl、50μg/ml氨苄青霉素]2.5ml中，在37℃下振荡培养20小时，得到培养物。
以7,000rpm对该培养物离心分离5分钟进行菌体收集而得到菌体。接着，使用qiagentip-100(qiagen公司制)从该菌体提取重组质粒pkk223-3-cfp-t7并纯化，得到2.5μg重组质粒pkk223-3-cfp-t7的dna。
(2)重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna的位点特异性修饰操作
以得到的重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，使用序列号14、15的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，按照下面的条件进行pcr反应。
即，加入10×kod-plus-缓冲液5μl、使dntp各为2mm制备而成的dntps混合溶液5μl、25mm的mgso4溶液2μl、50ng作为模板的pkk223-3-cfp-t7dna、上述合成寡核苷酸各15pmol、1u的kod-plus-，用灭菌水调整总体积为50μl。使用热循环仪(eppendorf公司制)对制备的反应液在94℃下孵育2分钟，接着，重复进行30次的“94℃，15秒”-“50℃，30秒”-“68℃，6分”的循环。
将一部分反应液用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，确认约6,000bp的dna得到特异性地扩增。这样得到的dna用限制性内切酶dpni(newenglandbiolabs公司制)处理，切断残存的模板dna后，转化大肠杆菌jm109，涂布于lb-amp琼脂培养基上。将生长的菌落接种于lb-amp培养基进行振荡培养，用与上述(1)同样的方法分离质粒dna。使用多毛细管dna分析系统appliedbiosystems3130xl基因分析仪(lifetechnologies公司制)确定该质粒中编码阿马多里酶的dna碱基序列，其结果，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280q)。
用同样的操作步骤，为了将序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸取代为丝氨酸，以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，使用序列号15、16的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与上述同样的条件下进行pcr反应、转化大肠杆菌jm109和确定生长菌落所保有的质粒dna中编码阿马多里酶的dna的碱基序列。其结果，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为丝氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280s)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、17的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为天冬氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280d)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、18的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为谷氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280e)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、19的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为甲硫氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280m)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、20的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280k)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、21的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280r)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、22的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为缬氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280v)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号15、23的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为天冬酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280n)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号24、25的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为酪氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-267y)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号26、27的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的269位苯丙氨酸被取代为酪氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-269y)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号28、29的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的54位天冬氨酸被取代为天冬酰胺被的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-54n)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号29、30的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的54位天冬氨酸被取代为丙氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-54a)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号31、32的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的241位酪氨酸被取代为谷氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-241e)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号32、33的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的241位酪氨酸被取代为谷氨酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-241q)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号32、34的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的241位酪氨酸被取代为赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-241k)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号35、36的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为组氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280h)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号35、37的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为苏氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-280t)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号38、39的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到保有编码序列号1中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为亮氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-267l)的大肠杆菌jm109株。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号38、40的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-267m)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号41、42的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的269位苯丙氨酸被取代为亮氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-269l)。
同样地以重组质粒pkk223-3-cfp-t7dna为模板，但使用序列号41、43的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的269位苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pkk223-3-cfp-t7-269m)。
pcr反应、转化和碱基序列确定均与上述同样地进行。
(3)各种修饰型阿马多里酶的生产
将保有由上述操作步骤得到的上述重组质粒的各大肠杆菌jm109株在添加有0.1mmiptg的lb-amp培养基3ml中在30℃下培养16小时。然后，用ph7.0的0.01m磷酸缓冲液洗涤各菌体，并进行超声波粉碎，以15000rpm离心分离10分钟，制备各粗酶液1.5ml。
(4)各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性评价
将这样制备的各粗酶液作为样品，按照上述的氧化酶活性测定法和脱氢酶活性测定法，对各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性进行评价。结果的一例如表1所示。
表1中，cfp-t7表示来源于大肠杆菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株的阿马多里酶。予以说明，本实施例中将来源于大肠杆菌jm109(pkk223-3-cfp-t7)株的阿马多里酶的cfp-t7作为突变原酶，因此表中记载的“氨基酸突变”的记载中cfp-t7未包含已经导入的各种突变点。表中，氧化酶活性(％)和脱氢酶活性(％)以原酶cfp-t7的氧化酶活性(u/ml)为100时的百分率来表示。此外，表中的ox/dh(％)表示为以原酶cfp-t7的ox/dh比为100时的百分率。
[表1]
如表1所示，可知在本实施例的条件下，cfp-t7的氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率ox/dh为26.0，受到很强的氧气的影响。对此，在通过位点特异性突变导入而得到的22个突变体中，全部是除去c280v的突变体，即，在cfp-t7的280位半胱氨酸至谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苏氨酸；267位苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸；269位苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸；54位天冬氨酸至天冬酰胺、丙氨酸；241位酪氨酸至谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸的各突变的阿马多里酶中，ox/dh均改善至19以下，明显地改善至10以下，更明显地改善至6以下，进一步明显的改善至3.7以下。特别是对于c280q、c280s、f267y、f267l、f267m、f269y、f269l、f269m、y241q，与cfp-t7相比，显示出不但脱氢酶活性提高，而且氧化酶活性也降低。因此，表明这些各突变点是使阿马多里酶的脱氢酶活性提高的突变点。
对于280位，由于被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、天冬酰胺得到良好的结果，因此认为被取代为相同极性氨基酸残基的苏氨酸也能得到同样的结果，该结果如上所述得到确认。
此外对于280位，由于被取代为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸得到良好的结果，因此认为被取代为相同带电氨基酸残基的组氨酸也能得到同样的结果，该结果如上所述得到确认。
此外对于280位，由于被取代为甲硫氨酸得到良好的结果，因此认为被取代为相同的大体积的氨基酸的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、以及脯氨酸也能得到同样的结果。
对于267位和269位，由于被取代为酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸得到良好的结果，因此认为被取代为相同疏水性氨基酸残基的异亮氨酸、色氨酸、以及缬氨酸、丙氨酸也能得到同样的结果。
对于54位，由于被取代为天冬酰胺得到良好的结果，因此认为被取代为相同极性氨基酸残基的谷氨酰胺也能得到同样的结果。此外，由于被取代为极性氨基酸残基得到良好的结果，因此认为被取代为带电氨基酸的组氨酸也能得到同样的结果。
此外对于54位，由于被取代为丙氨酸得到良好的结果，因此认为被取代为相同非极性且侧链较小的甘氨酸和缬氨酸也能得到同样的结果。
对于241位，由于被取代为谷氨酰胺得到良好的结果，因此认为被取代为相同极性氨基酸残基的天冬酰胺也能得到同样的结果。
此外对于241位，由于被取代为赖氨酸、谷氨酸得到良好的结果，因此认为被取代为相同带电氨基酸残基的精氨酸、天冬氨酸和组氨酸也能得到同样的结果。
[实施例2]
(cfp-t7、cfp-t7-280q的纯化)
使用在实施例1得到的cfp-t7和cfp-t7-280q的粗酶，使制备的粗酶液吸附于用20mm磷酸钾缓冲液(ph8.0)平衡的4ml的qsepharosefastflow树脂(gehealthcare公司制)上，接着用80ml的上述缓冲液洗涤树脂，接着用含有100mmnacl的20mm磷酸钾缓冲液(ph8.0)使吸附于树脂的蛋白溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分。
用amiconultra-15，30knmwl(millipore公司制)对得到的显示阿马多里酶活性的组分进行浓缩。然后，用含有150mmnacl的20mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)平衡的hiload26/60superdex200pg(gehealthcare公司制)中上样，用上述缓冲液使其溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分，得到野生型和修饰型阿马多里酶的纯化标准品。得到的纯化标准品通过sds-page的分析，确认纯化至单一的条带。
(氧化酶活性和脱氢酶活性评价)
对如上所述得到的纯化酶cfp-t7和cfp-t7-280q的氧化酶活性、脱氢酶活性进行评价。按照实施例1的氧化酶活性和脱氢酶活性测定方法进行评价。其中，使用的底物为30mm的αfvh，计算测定中使用的酶在280nm处的吸光度每1个的酶活性值(u/a280)。结果的一例如表2所示。表中的ox/dh(％)表示将原酶cfp-t7的ox/dh比作为100时的百分率。
[表2]
由表2可知，在本实施例的条件下，cfp-t7的氧化酶活性与脱氢酶活性的比率ox/dh为9.9，αfvh的测定中也受到很强的氧气的影响。与此相对，cfp-t7-280q的ox/dh为0.037，大幅得到改善。本发明的c280q突变体使氧化酶活性降低208倍，脱氢酶活性提高1.3倍。即，可以认为能够几乎不受氧气影响地测定αfvh。
[实施例3](各种阿马多里酶的位点特异性修饰操作)
(重组质粒pute100k’-efp-t5dna的制备)
序列号44是来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶(efp-t5)的修饰型酶的氨基酸序列，可以通过保有插入了编码序列号44的氨基酸序列的基因(序列号45)的重组质粒pute100k’-efp-t5的大肠杆菌进行生产(参照国际公开第2007/125779号公报)。将保有pute100k’-efp-t5的大肠杆菌jm109株按照“实施例1(1)重组质粒pk223-3-cfp-t7dna的制备”中记载的方法进行培养，提取并纯化pute100k’-efp-t5。
(向来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶基因导入点突变)
为了在efp-t5中导入底物特异性改善型突变，以重组质粒pute100k’-efp-t5为模板，使用序列号46、47的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与实施例同样的条件下进行pcr反应、转化大肠杆菌jm109和确定生长菌落所保有的质粒dna中编码efp-t5突变体的dna碱基序列。其结果，得到编码序列号44中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的efp-t5基因的重组质粒(pute100k’-efp-t5-280q)。
同样地以重组质粒pute100k’-efp-t5为模板，但使用序列号35、36的合成寡核苷酸，得到编码序列号1中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为丝氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pute100k’-efp-t5-280s)。
(重组质粒pet22b-pnfxdna的制备)
序列号9是来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶(pnfx)的氨基酸序列，可以通过保有插入了编码序列号9的氨基酸序列的基因(序列号49)的重组质粒pet22b－cnfx的大肠杆菌进行生产(参照国际公开第2013/162035号公报)。将保有pet22b-pnfx的大肠杆菌jm109株按照“实施例1(1)重组质粒pk223-3-cfp-t7dna的制备”中记载的方法进行培养，提取并纯化pet22b-pnfx。
(向来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶基因导入点突变)
为了在pnfx中导入底物特异性改善型突变，以如上所述制备的重组质粒pet22b-pnfx为模板，使用序列号50、51的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与实施例同样的条件下进行pcr反应、转化大肠杆菌jm109和确定生长菌落所保有的质粒dna中编码pnfx突变体的dna碱基序列。其结果，得到编码序列号9中记载的氨基酸序列的276位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的pnfx基因的重组质粒(pet22b-pnfx-276q)。
接着，与上述同样地以pet22b-pnfx为模板，使用序列号50、52的合成寡核苷酸，得到编码序列号9中记载的氨基酸序列的276位半胱氨酸被取代为丝氨酸的pnfx基因的重组质粒(pet22b-pnfx-276s)。
然后，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌bl21(de3)株，得到大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-pnfx-276q)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-pnfx-276s)株。
(重组质粒pet22b-anfxdna的制备)
序列号53是为了赋予果糖基肽氧化酶活性而将59位丝氨酸取代为甘氨酸的来源于构巢曲霉果糖基氨基酸氧化酶(anfx)的氨基酸序列，可以通过保有插入了编码序列号53的氨基酸序列的基因(序列号54)的重组质粒pet22b-anfx的大肠杆菌进行生产(参照国际公开第2012/018094号公报)。将保有pet22b-anfx的大肠杆菌jm109株按照“实施例1(1)重组质粒pk223-3-cfp-t7dna的制备”中记载的方法进行培养，提取并纯化pet22b-anfx。
(向来源于构巢曲霉的果糖基肽氧化酶基因导入点突变)
为了在anfx中导入底物特异性改善型突变，以重组质粒pet22b-anfx为模板，使用序列号55、56的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与实施例1同样的条件下进行pcr反应、转化大肠杆菌jm109和确定生长菌落所保有的质粒dna中编码anfx突变体的dna碱基序列。其结果，得到编码序列号53中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的anfx基因的重组质粒(pet22b-anfx-280q)。
接着，与上述同样地以pet22b-anfx为模板，使用序列号55，57的合成寡核苷酸，得到编码序列号53中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为丝氨酸的anfx基因的重组质粒(pet22b-anfx-280s)。
然后，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌bl21(de3)株，得到大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-anfx-280q)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-anfx-280s)株。
(重组质粒pkk223-3-ccfxdna的制备)
序列号6是来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶(ccfx)的氨基酸序列(国际公开第wo2004/104203号)。可以通过保有插入了编码序列号6的氨基酸序列的基因(序列号58)的重组质粒pkk223-3-ccfx的大肠杆菌进行生产(参照国际公开第2015/020200号公报)。将保有pkk223-3-ccfx的大肠杆菌jm109株按照“实施例1(1)重组质粒pk223-3-cfp-t7dna的制备”中记载的方法进行培养，提取并纯化pkk223-3-ccfx。
(向来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶基因导入点突变)
为了在ccfx中导入底物特异性改善型突变，以重组质粒pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号59、60的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与实施例1同样的条件下进行pcr反应、转化大肠杆菌jm109和确定生长菌落所保有的质粒dna中编码ccfx突变体的dna碱基序列。其结果，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的278位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-278q)。
接着，与上述同样地以pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号59，61的合成寡核苷酸，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的278位半胱氨酸被取代为丝氨酸的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-278s)。
接着，与上述同样地以pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号62，63的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的265位苯丙氨酸被取代为亮氨酸的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-265l)。
接着，与上述同样地以pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号62，64的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的265位苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-265m)。
接着，与上述同样地以pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号65，66的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为亮氨酸的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-267l)。
接着，与上述同样地以pkk223-3-ccfx为模板，使用序列号65，82的合成寡核苷酸，在进行pcr反应、dpni处理后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，得到编码序列号6中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的ccfx基因的重组质粒(pkk223-3-ccfx-267m)。
(向来源于构巢裸孢壳的酮胺氧化酶基因导入点突变)
序列号67是来源于构巢裸孢壳的糖化六肽氧化酶(en42fx)的氨基酸序列(国际公开第wo2015/005258号)。通过利用既定的基因片段的pcr全合成对cdna进行全合成而获得编码序列号67的氨基酸序列的基因(序列号68)(含有终止密码子taa)。接着，为了使获得的序列号69基因在大肠杆菌中表达，进行如下的操作步骤。首先，按照in-fusionhd克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.制)的操作手册，使用序列号69、70的合成寡核苷酸扩增包含序列号68基因的片段。同时，使用序列号71、72的合成寡核苷酸扩增包含pet22b的片段。接着，通过in-fusion反应将包含序列号68基因的片段亚克隆到包含pet22b的片段中，获得重组质粒pet22b-en42fx，在与上述同样的条件下转化大肠杆菌jm109株，得到大肠杆菌jm109(pet22b-en42fx)株。
为了在en42fx中导入底物特异性改善型突变，以重组质粒pet22b-en42fx为模板，使用序列号73、74的合成寡核苷酸、kod-plus-(东洋纺株式会社制)，在与实施例1同样的条件下进行pcr反应后，加入dpni处理过的dna2μl、ligationhighver.2(东洋纺株式会社制)5μl、5u/μl的t4多聚核苷酸激酶1μl，用灭菌水调整总体积为15μl，在16℃下反应1小时。然后，使用反应液转化大肠杆菌jm109，进行生长菌落所保有的质粒dna中编码en42fx突变体的dna碱基序列确定。其结果，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-280q)。
接着，与上述同样地以pet22b-en42fx为模板，使用序列号73、75的合成寡核苷酸，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的280位半胱氨酸被取代为丝氨酸的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-280s)。
接着，与上述同样地以pet22b-en42fx为模板，使用序列号76、77的合成寡核苷酸，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为亮氨酸的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-267l)。
接着，与上述同样地以pet22b-en42fx为模板，使用序列号76、78的合成寡核苷酸，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的267位苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-267m)。
接着，与上述同样地以pet22b-en42fx为模板，使用序列号79、80的合成寡核苷酸，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的269位异亮氨酸被取代为亮氨酸的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-269l)。
接着，与上述同样地以pet22b-en42fx为模板，使用序列号79、81的合成寡核苷酸，得到编码序列号67中记载的氨基酸序列的269位异亮氨酸被取代为甲硫氨酸的en42fx基因的重组质粒(pet22b-en42fx-269m)。
然后，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌bl21(de3)株，得到大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-280q)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-280s)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-267l)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-267m)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-269l)株、大肠杆菌bl21(de3)(pet22b-en42fx-269m)株。
(各种修饰型阿马多里酶的生产)
将保有由上述操作步骤得到的上述重组质粒的各大肠杆菌jm109株、或者大肠杆菌bl21(de3)株在添加有0.1mmiptg的lb-amp培养基3ml中在25℃下培养16小时。然后，用ph7.0的0.01m磷酸缓冲液洗涤各菌体，并进行超声波粉碎，以15000rpm离心分离10分钟，制备各粗酶液1.5ml。
(各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性评价)
将这样制备的各粗酶液作为样品，按照上述的氧化酶活性测定法和脱氢酶活性测定法，对各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性进行评价。结果如表3-7所示。表4、5、6中，氧化酶活性(％)与脱氢酶活性(％)表示为将各野生型酶或原酶的氧化酶活性(u/ml)作为100时的百分率。此外表3-7中的ox/dh(％)表示为将各野生型酶或原酶的ox/dh比作为100时的百分率。
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
如表3-7所示，将序列号1的阿马多里酶的280位半胱氨酸所对应位置的氨基酸残基取代为谷氨酰胺或丝氨酸的所有情形下，与氨基酸取代前的野生型酶相比，ox/dh值得到改善。这说明由前述的氨基酸取代带来的ox/dh改善效果与阿马多里酶的来源无关，均能得到发挥。
[实施例4]
(印刷电极的αfvh定量)
使用实施例2中得到的cfp-t7和cfp-t7-280q的纯化酶，进行由印刷电极测定的αfvh定量。具体地，在由碳的工作电极、银/氯化银的参比电极印刷而成的dep芯片电极(dep-ep-pp，圆形/碳/带阻水环；有限会社biodevicetechnology制)上，载置15μl溶解有如下的液体：终浓度3.75mm或7.5mm的mpms、终浓度约10mm的磷酸缓冲液(ph7.0)及相对于1mmαfvh的50mu的各种纯化酶液。然后，使用dep芯片专用连接器，连接到小型恒电位仪bdtministat100(有限会社biodevicetechnology制)。然后，外加+200mv(相对于ag/agcl)的电压，将规定浓度的αfvh溶液5μl载置于各自电极上进行反应，测定120秒后的电流值。绘制使用cfp-t7进行反应的各αfvh浓度中的电流响应值的结果如图3所示，绘制使用cfp-t7-280q进行反应的各αfvh浓度中的电流响应值的结果如图4所示。
图3-1、4-1显示了在添加3.75mm的mpms的体系中，cfp-t7-280q比cfp-t7更能高精度地对αfvh进行定量。此外，图3-2、4-2显示了在添加7.5mm的mpms体系中，cfp-t7-280q比cfp-t7更能高精度地对αfvh进行定量。
本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。
序列说明
序列号1cfp-t7的氨基酸序列
序列号2cfp-t7的基因序列
序列号3来源于土正青霉的阿马多里酶
序列号4来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶
序列号5来源于节菱孢属的酮胺氧化酶
序列号6来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶
序列号7来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶
序列号8来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶
序列号9来源于phaeosphaerianodorum的果糖基肽氧化酶
序列号10来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶
序列号11来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶
序列号12来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶
序列号13来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶
序列号14c280q-fw
序列号15c280q-rv
序列号16c280s-fw
序列号17c280d-fw
序列号18c280e-fw
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序列号20c280k-fw
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序列号22c280v-fw
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序列号30d54a-fw
序列号31y241e-fw
序列号32y241x-rv
序列号33y241q-fw
序列号34y241k-fw
序列号35cfp-t7c280xr
序列号36cfp-t7c280hf
序列号37cfp-t7c280tf
序列号38cfp-t7f267xr
序列号39cfp-t7f267lf
序列号40cfp-t7f267mf
序列号41cfp-t7f269xr
序列号42cfp-t7f269lf
序列号43cfp-t7f269mf
序列号44efp-t5蛋白
序列号45efp-t5基因
序列号46efpc280xr
序列号47efpc280qf
序列号48efpc280sf
序列号49pnfx基因
序列号50pnc276xr
序列号51pnc276qf
序列号52pnc276sr
序列号53anfx蛋白
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序列号55anc280xr
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序列号57anc280sf
序列号58ccfx基因
序列号59ccc278xr
序列号60ccc278qf
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序列号62ccf265xr
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序列号67en42fx蛋白
序列号68en42fx基因
序列号69in-fusionen42x插入片段
序列号70in-fusionen42x插入片段
序列号71in-fusionpet22b载体
序列号72in-fusionpet22b载体
序列号73enc280xr
序列号74enc280qf
序列号75enc280sf
序列号76enf267xr
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序列号78enf267mf
序列号79eni269xr
序列号80eni269lf
序列号81eni269mf
序列号82ccf267mf
序列表
<110>龟甲万株式会社
<120>脱氢酶活性提高的阿马多里酶
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<150>jp2014-217405
<151>2014-10-24
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<213>土正青霉（eupenicilliumterrenum）
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<213>棘壳孢属（pyrenochaetasp.）
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<213>节菱孢属（arthriniumsp.）
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<213>构巢裸孢壳（emericellanidulans）
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<213>细基格孢属（ulocladiumsp.）
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<211>27
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>15
gaagcgcgagaatcctgggaattcgtc27
<210>16
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>16
gtaataaaggtgagcgacgaattcccagga30
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<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
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gtaataaaggtggatgacgaattcccagga30
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<211>30
<212>dna
<213>人工的
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<212>dna
<213>人工的
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<211>30
<212>dna
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gtaataaaggtgaaagacgaattcccagga30
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<211>30
<212>dna
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gtaataaaggtgcgtgacgaattcccagga30
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<211>30
<212>dna
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gtaataaaggtggtggacgaattcccagga30
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gtaataaaggtgaacgacgaattcccagga30
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ggcgaatttggctatttcttcgaacctgat30
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ggcctcttcaggcgtcaactgaatatgagc30
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aaggcttgggtgcaggctcatattcagttg30
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<212>dna
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aaggcttgggtgaaagctcatattcagttg30
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cacctttattacaccaaactcatcaggctc30
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tgtaataaaggtgaccgacgagttcccagg30
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gccaaattcgccattatacacaactgggac30
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ttattctttgagcctgatgagtttggtgta30
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<212>dna
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atgttctttgagcctgatgagtttggtgta30
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<212>dna
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<220>
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<400>41
gaagaagccaaattcgccattatacacaac30
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<213>人工的
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<400>42
ttagagcctgatgagtttggtgtaataaag30
<210>43
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>43
atggagcctgatgagtttggtgtaataaag30
<210>44
<211>437
<212>prt
<213>土正青霉（eupenicilliumterrenum）
<400>44
metalahisserargalaserthrlysvalvalvalvalglyglygly
151015
glythrileglyserserthralaleuhisleuileargserglytyr
202530
thrproserasnilethrvalleuaspvaltyrlysthrproserleu
354045
glnseralaglyhisaspleuasnlysilemetglyileargleuarg
505560
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100105110
thrleuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnvaltrpleu
115120125
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130135140
glnvallysglytrplysglyleuphecysthraspglyglytrpleu
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alaalaalalysalaileasnalaileglyilepheleuglnasplys
165170175
glyvallyspheglypheglyaspalaglythrpheglnglnproleu
180185190
phealaalaaspglylysthrcysileglyleugluthrthraspgly
195200205
thrlystyrphealaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser
210215220
prothrleuvalaspleugluaspglncysvalserlysalatrpval
225230235240
phealahisileglnleuthrprolysglualaaspalatyrlysasn
245250255
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260265270
glutyrglyvalilelysvalcysaspglupheproglypheserarg
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phelysleuhisglnprotyrglyalaalaserprolysmetileser
290295300
valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrproaspala
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alaaspalaasnleuleuilecysgluhisprolystrplysasnphe
355360365
ileleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn
370375380
ileglylystyrvalvalgluleuleugluglyserleuserglnglu
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metalaglyalatrpargtrpargproglyglyaspalaleuargser
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argargglyalaproalalysaspleualaglumetproglytrplys
420425430
hisaspalahisleu
435
<210>45
<211>1314
<212>dna
<213>土正青霉（eupenicilliumterrenum）
<400>45
atggctcattcgcgtgcaagcaccaaagtcgtcgtggttgggggaggtggtacgatcggg60
tcttcgacggctctgcacttaatccgctctggatataccccctcaaatatcaccgtgctt120
gacgtatacaagaccccttcattgcaatctgcaggacatgatttgaacaagatcatgggc180
attcgattgcgcaacgggcctgacttgcagctttcgctggaatcactcgacatgtggcaa240
aacgatgagttgttcaagccattctttcaccaagtgggcatgattgattgttcgtcatcc300
aaagagggtattgaaaatcttcgacgaaaataccagaccctcctcgatgcgggcattggg360
ctggagaagacgaacgtttggctggaatctgaagatgagatcctcgccaaagcgccgaat420
ttcacgcgtgaacaagtcaaggggtggaaaggcttattttgcactgatggaggctggctt480
gctgcagccaaggctatcaatgcgatcggaattttcctccaggacaaaggtgtcaagttt540
ggctttggagatgctggtacctttcagcaacctctgttcgccgctgatggaaaaacttgc600
atcggacttgaaactacagacggaaccaagtactttgctgacaaggttgtcttggctgct660
ggtgcgtggagtcccaccttggtggatctagaagatcagtgtgtttcaaaggcctgggtt720
ttcgctcatattcaactcacacccaaagaagcggacgcgtacaagaatgtgcctgtggtc780
tatgatggtgaatatgggttctttttcgaacccgacgagtatggggtgatcaaagtctgt840
gacgagttccctggtttctctcgcttcaaactgcatcaaccgtacggggctgcatctccc900
aagatgatatccgtaccgcgatcacacgccaagcatcccacagatacctaccctgatgcc960
tccgaagtcaccatacgcaaagcgatcgcaaggttcctgccagaatttaaagacaaggag1020
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gaacacccgaagtggaagaatttcattctggccactggagatagcggacattccttcaag1140
ctgttgccaaacatcgggaaatacgtagttgagcttttagagggatctctatcgcaggaa1200
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ccggcaaaggatcttgctgagatgccgggatggaagcatgatgcacatttgtga1314
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<213>人工的
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<223>引物
<400>46
gactttgatcaccccatactcgtcgggctc30
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>47
ggtgatcaaagtccaggacgagttccctgg30
<210>48
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<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>48
ggtgatcaaagtcagtgacgagttccctgg30
<210>49
<211>1314
<212>dna
<213>phaeosphaerianodorum
<400>49
atggccccgtcgcgtgctaatacgtcggtcattgtggttggtggtggtggtacgattggc60
tcatctacggctctgcatctggtccgctcaggctataccccgtcgaacgtgacggttctg120
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gtctctctgcgtaatccggtggatctgcagctggctctggaagcgcgccaaatgtggaac240
gaagacgaactgttcaagaagtttttccataacaccggccgtctggattgcgcgcacggt300
gaaaaagatattgccgacctgaagagcggctatcaggctctggtggatgcgggtctggac360
gccacgaacgaatggctggatagtgaagacgaaatcctgaaacgtatgccgctgctgtcc420
cgcgatcaaattaaaggctggaaggcgatcttttcaaaagacggtggttggctggcagca480
gcaaaggcaattaatgcagttggtgaatatctgcgtgatcagggcgtccgcttcggtttt540
tacggcgccggttctttcaaagcaccgctgctggctgaaggcgtctgcatcggtgtcgaa600
accgtggatggcacgcgctattacgcagacaaagtggttctggctgcaggtgcatggtcg660
ccgaccctggttgaactgcatgaacagtgtgtgagcaaagcgtgggtttacggccacatt720
caactgacgccggaagaagccgcacgttataagaacagcccggtcgtgtacaatggcgat780
gtgggctttttctttgaaccgaacgaacatggcgttatcaaagtctgcgatgaatttccg840
ggttttacccgcttcaagatgcaccagccgtttggtgccaaagcaccgaagcgtattagt900
gtgccgcgctcccatgccaaacacccgaccgatacgatcccggatgcaagtgacgtttcc960
attcgtcgcgctatcgcgacctttatgccgcagttcaagaacaaaaagatgttcaaccaa1020
gcgatgtgctggtgtaccgatacggccgacgctgcgctgctgatttgtgaacatccggaa1080
tggaaaaactttgttctggcgaccggcgattcaggtcattcgttcaaactgctgccgaat1140
atcggcaagcacgttgtcgaactgctggagggtacgctggcagatgacctggcacacgca1200
tggcgttggcgtccgggtagtggtgatgcactgaaaagccgtcgctctgctccggcgaaa1260
gacctggctgatatgccgggctggaaccatgacaaaccgcgtgctaatctgtaa1314
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<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>50
gactttgataacgccatgttcgttcggttc30
<210>51
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>51
cgttatcaaagtccaggatgaatttccggg30
<210>52
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>52
cgttatcaaagtcagcgatgaatttccggg30
<210>53
<211>438
<212>prt
<213>构巢曲霉（aspergillusnidulans）
<400>53
metthrproargalaasnthrlysileilevalvalglyglyglygly
151015
thrmetglyserserthralaleuhisleuleuargalaglytyrthr
202530
proserasnilethrvalleuaspthrcysproileproseralagln
354045
seralaglytyraspleuasnlysilemetglyileargleuargasn
505560
lysproaspleuglnleuserleuglualaleuaspmettrplysasn
65707580
aspproleuphelysprophephehisasnvalglymetileaspval
859095
serserthrglugluglyilegluglyleuarglyslystyrglnser
100105110
leuleuaspalaglyileglyleuglulysthrasnphemetleuglu
115120125
sergluaspgluileleualalysalaprohisphethrglnglugln
130135140
ilelysglytrplysglyleuphecysglyaspglyglytrpleuala
145150155160
alaalalysalaileasnalaileglyglnpheleulysgluglngly
165170175
vallyspheglypheglyglyalaglythrphelyslysproleuphe
180185190
alaaspalahisglulysthrcysileglyvalgluthrvalaspgly
195200205
thrlystyrtyralaasplysvalvalleualaalaglyalatrpser
210215220
serthrleuvalaspleuglugluglncysvalserlysalatrpval
225230235240
phealahisileglnleuthrproalaglualaalaalatyrlysasn
245250255
thrprovaliletyraspglyasptyrglyphephephegluproasn
260265270
gluasnglyileilelysvalcysaspglupheproglyphethrhis
275280285
phelysmethisglnprotyrglyserproalaprolysproileser
290295300
valproargserhisalalyshisprothraspthrtyrprohisala
305310315320
sergluvalthrilelyslysalaileasnargpheleuproargphe
325330335
asnasplysgluleupheasnargalametcystrpcysthraspthr
340345350
alaaspalaasnleuleuvalcysgluhisproargtrplysglyphe
355360365
tyrleualathrglyaspserglyhisserphelysleuleuproasn
370375380
ileglylyshisvalvalgluleuleuglugluargleugluserval
385390395400
phelysaspalatrpargtrpargproglyserglyaspalaleulys
405410415
serargargalaalaproalalysaspleualaaspmetproglytrp
420425430
argasnglualalysmet
435
<210>54
<211>1317
<212>dna
<213>构巢曲霉（aspergillusnidulans）
<400>54
atgacgccccgagccaacaccaaaatcattgtcgtcggcggcggcggcacaatgggctcg60
tcgacagccctacacctcctgcgcgccggctacacgccgtccaacattacagtgctcgac120
acgtgccctatcccctccgcacagtctgcaggctacgacctgaacaaaatcatggggatc180
cgtctgcgcaacaagcctgatttacagctctctcttgaggcgctggacatgtggaaaaat240
gatcctctcttcaagccgtttttccacaatgttggaatgatcgacgtctcttcaacagag300
gaaggcatcgagggtcttcggaagaaataccagtctcttctcgacgcaggcattgggctc360
gagaagacgaatttcatgctggaaagtgaagacgagatcctggctaaagcgccgcatttc420
acgcaggagcagattaaaggctggaaaggcctgttctgtggcgacggcggctggctcgct480
gcagccaaagccatcaatgccattgggcagttcctcaaggaacagggcgtcaagtttgga540
ttcggcggcgccggcacgttcaaaaagccactcttcgccgatgcccacgagaagacgtgc600
atcggcgtcgagactgtagacggcacaaagtactacgccgacaaggtcgttctagcagct660
ggtgcctggagttcgacgttggtcgatctggaggagcagtgcgtttcaaaggcctgggtc720
tttgcccacatccaactgacgcccgctgaagcagccgcgtataagaacactcctgttata780
tacgacggtgactatgggtttttctttgagccgaatgaaaacggcatcataaaagtctgt840
gacgaattccctggcttcacgcatttcaaaatgcaccagccgtacggctcgccggcgccc900
aaacccatctctgtgcctcgttcccatgcgaagcaccccacagatacatacccgcacgcg960
tcggaggtcacgatcaaaaaggctatcaaccggttcctgccgaggttcaatgacaaggaa1020
ctgtttaacagggccatgtgctggtgcaccgataccgcggatgcaaatctgcttgtttgt1080
gagcatccacgctggaaggggttttatcttgcaacaggggacagtgggcattcgttcaag1140
ttgctgccgaatattggaaagcatgttgtcgagttattggaggagaggctggaaagtgtg1200
tttaaggatgcttggaggtggaggcctggcagtggggatgcattaaaaagtagacgggct1260
gcgcctgcgaaggacctggcggatatgccggggtggaggaatgaggcaaagatgtag1317
<210>55
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<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>55
gacttttatgatgccgttttcattcggctc30
<210>56
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>56
catcataaaagtccaggacgaattccctgg30
<210>57
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>57
catcataaaagtcagtgacgaattccctgg30
<210>58
<211>1323
<212>dna
<213>棒状弯孢（curvulariaclavata）
<400>58
atggccccgagtcgcgctaacacgagcgtcattgtggtgggtggtggtggcacgattggt60
tcctcaacggcactgcatctggtccgtagcggctataccccgtctaacattaccgtgctg120
gacacgtacccgatcccgagcgcccagtctgcaggcaacgatctgaataaaattatgggt180
atccgtctgcgcaacaaagttgatctgcagctgtcactggaagcccgtcaaatgtggcgc240
gaagatgacctgtttaaagaatacttccataacaccggccgtctggattgcgcacacggt300
gaagaaggtctggccgacctgcgccaggcttaccaagcgctgctggatgccaacgcaggt360
ctggaagaaaccacggaatggctggattcagaagacgaaattctgaagaaaatgccgctg420
ctggatcgtgaacagatcaaaggttggaaagccgtgtattcgcaagatggcggttggctg480
gcggccgcaaaagccattaatgcaatcggcgaatacctgcgcgcgcagggcgttaaattc540
ggttttggcggtgctggttcctttaaacagccgctgctggcagaaggcgtctgcattggt600
gtcgaaaccgtggatggcacgcgttattacgcggacaaagtggttctggctgcaggtgca660
tggagtccggtgctggttgatctggaagaccagtgtgtgtccaaagcgtgggtttatgcg720
catatccaactgaccccggaagaagccgcagaatataaaaacgtcccggtcgtgtacaat780
ggcgatgtgggctttttctttgaaccggacgaacatggcgttattaaagtctgcgatgaa840
tttccgggttttacccgcttcaaacagcaccaaccgtatggcgctaaagcgccgaaacgt900
atctcagtgccgcgttcggctgcaaaacacccgaccgatacgtacccggacgcgagtgaa960
aaatccattcgtaaagccatcgcaacctttctgccgaaattcacggaaaaagaactgttt1020
aatcgccatctgtgctggtgtaccgatacggccgacgccgcactgctgatgtgtgaacac1080
ccggaatggaaaaactttgttctggcgaccggcgatagcggtcatacgttcaaactgctg1140
ccgaatattggcaaacacgttgtcgaactgctggaaggtaccctggcagaagacctggct1200
catgcgtggcgttggcgtccgggtacgggtgatgcactgaaatctcgtcgcgctgcgccg1260
gcgaaagacctggcggatatgccgggctggaaacacgacgatgtggtgaaaagcaaactg1320
taa1323
<210>59
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>59
gactttaataacgccatgttcgtccggttc30
<210>60
<211>29
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<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>60
cgttattaaagtccaggatgaatttccgg29
<210>61
<211>29
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>61
cgttattaaagtcagcgatgaatttccgg29
<210>62
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>62
gcccacatcgccattgtacacgaccgggac30
<210>63
<211>30
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>63
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<220>
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