半连续培养方法与流程

本申请要求于2014年10月16日提交的美国临时申请No.62/064,668的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景

包括破囊壶菌(Thraustochytrid)种(species)在内的微生物的异养发酵是产生高价值油和生物质产物的有效方式。在某些培养条件下，微生物合成细胞内油，所述细胞内油可以被提取并用于生产生物燃料(生物柴油、生物喷射燃料等)和营养脂质(多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA、DPA)。微生物(例如，破囊壶菌种)的生物质因高PUFA和蛋白质含量而具有很高的营养价值，并且可以用作动物饲料的营养补充剂。

微生物发酵工艺主要以分批工艺或补料分批工艺进行。分批工艺通常涉及封闭系统培养，其中在特定条件(例如，营养物、温度、压力等)下使细胞在固定体积的营养物培养基中生长至发酵罐中的特定密度，收获，并按批处理。在典型的补料分批工艺中，将一种或更多种营养物供给或供应至发酵罐，它们在发酵罐中保留直至培养过程结束。当控制一种营养物(或多种营养物)的浓度影响所需产物的产量或活性时，补料分批培养工艺可优于分批培养工艺。这样的发酵工艺通常包括两个培养阶段：细胞增殖阶段，在此期间所有必需的营养物均可用于无限的培养物生长，随后是油积累阶段，在此期间关键的生长营养物(通常为氮)被有目的地限制在培养基中，同时提供过量的碳营养物并导入油合成。当达到目标细胞浓度和油含量时，停止发酵过程并收获富含油的生物质。然后必须对发酵罐容纳物(vessel)进行清洁、灭菌和用新鲜培养基重新分批，并且种子培养物(seed train)需要准备好用于再次接种生产容纳物(例如，分批/补料分批发酵之间的“周转”操作)。这样的周转操作通常耗时间和能量并且限制用于建成的生产工艺的生产容纳物的总可用操作时间。或者，可以采用连续方法培养微生物，其中将新鲜培养基连续加入发酵罐中，同时连续除去培养液以保持培养体积恒定。连续培养工艺可用于将微生物维持在特定的生长速率或生理稳态，但是可能难以在没有破坏的情况下维持并且通常用于研究目的，因为补料分批或分批培养倾向于提供更好的结果(例如，更高的产油率)，并且更易于用于大规模生产目的。

发明概述

本文提供了培养微生物的优化方法和采用半连续工艺产生油和促进延长的生物质产率的方法。所述方法包括提供在包含第一碳氮比的培养基中包含一种或更多种微生物的容器，培养所述微生物直至所述培养物达到阈值指标，收获一部分所述培养物同时维持所述容器中的大部分培养物，以及向包含含有所述微生物的大部分所述培养物的所述容器中加入包含第二碳氮比的新鲜培养基。

附图简述

图1是说明典型微生物S型生长曲线的图。在该工艺的后期但在培养物达到静止期(其可以通过S曲线上的最陡斜率指示)之前，即时生物质/油产率处于其最高水平。

图2是示出在半连续条件下生长的ONC-T18的总生物质(■)和油产率的图。图2中示出的高产率值远超过在典型分批或补料分批工艺下可获得的值。

图3是示出连续发酵方法对ONC-T18的作用的图。连续发酵导致不可持续的发酵、生物质减少和流出物中的葡萄糖浓度增加。发酵因管路堵塞而停止。

图4是示出在半连续条件下生长的ONC-T18的总生物质(■)和油产率的图。连续发酵导致不可持续的发酵和降低的生物质和油产率。

图5是示出在半连续和连续发酵下生长的ONC-T18的生物质产率的图。半连续发酵导致延长的生物质产率。

图6是示出在连续和半连续发酵条件下生长的ONC-T18的即时生物质产率(在给定时间点确定)的图。

图7是示出在连续和半连续发酵条件下生长的ONC-T18的即时油产率(在给定时间点确定)的图。

详述

本文提供了培养微生物的方法和通过半连续工艺生产油的方法。与典型的分批、连续和补料分批工艺相比，该方法导致更高的总体容积生物质和油产率。简而言之，在初始培养物(例如，种子培养物)中提供微生物，并使用补料分批发酵工艺生长至某一阈值参数，例如高细胞浓度和/或高油含量，此时氮源被限制在培养基中或在培养基中耗尽，碳源为零或接近零，并且生物质/油产率在给定微生物的最大范围内。收获一定体积(例如，工作体积的10％)的培养肉汤，并将相同体积的含有预定浓度的碳和氮营养物以及所有其他必需的矿物营养素的新鲜培养基加入到发酵罐中。在补料培养基(feeding medium)中使用的碳氮比是为了使培养物获得和维持高油含量。继续培养，培养物使用新提供的培养基产生额外的生物质和油。培养物生长直至达到阈值参数(例如，碳浓度降低到零或接近零)，并重复部分肉汤收获和新鲜培养基供应循环。使用这样的工艺，可以以半连续方式生产和收获含有高油含量的高密度生物质，并且该工艺的总持续时间比这样的微生物的任何分批或补料分批模式培养长得多。具有高油含量的高密度生物质的半连续收获显著减少发酵罐周转时间、最小化对发酵罐容纳物周转程序和灭菌程序的需要，因此降低操作成本，并且可导致生物质和油的非常高的总体积产率，远远超过可以通过典型的分批、连续或补料分批发酵方法所实现的该产率。

微生物

本文所述的方法包括从微生物群体中提取脂质。本文所述的微生物群体可以是藻类(例如微藻)、真菌(包括酵母)、细菌或原生生物。任选地，所述微生物包括破囊壶菌目(order Thraustochytriales)的破囊壶菌，更具体地，破囊壶菌属(Thraustochytrium)的破囊壶菌(Thraustochytriales)。任选地，所述微生物群体包括如美国专利No.5,340,594和5,340,742中所述的破囊壶菌，这两篇专利通过引用整体并入本文。所述微生物可以是破囊壶菌属种，例如如美国专利No.8,163,515中所述作为ATCC登录号PTA-6245(即，ONC-T18)保藏的破囊壶菌属种，其通过引用整体并入本文。因此，所述微生物可以具有与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多(例如，包括100％)同一的18s rRNA序列。

用于本文所述方法的微生物可产生多种脂质化合物。本文所用术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸酯、三酰基甘油、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，氧代类胡萝卜素)、烃和本领域普通技术人员已知的其它脂质。任选地，脂质化合物包括不饱和脂质。不饱和脂质可以包括多不饱和脂质(即，含有至少2个不饱和碳-碳键(例如，双键)的脂质)或高度不饱和脂质(即，含有4个或更多个不饱和碳-碳键的脂质)。不饱和脂质的实例包括ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(即，DHA)、二十碳五烯酸(即，EPA)和其它天然存在的不饱和、多不饱和和高度不饱和化合物。

工艺

本文提供了培养微生物的方法。该方法包括提供培养基中一种或更多种微生物的容器，所述培养基具有第一碳氮比；培养所述微生物直至所述培养物达到阈值指标；收获一部分所述培养物同时维持容器中的大部分培养物；以及向所述含有具有微生物的大部分培养物的容器中加入具有第二碳氮比的新鲜培养基。

该方法适用于大规模发酵以及小规模发酵。本文所使用的大规模发酵是指发酵罐中的发酵，其体积容量(即，工作体积)为至少约1,000L，为顶部空间留下足够的空间。小规模发酵通常指发酵罐中的发酵，其体积容量通常不超过约100L，例如5L、10L、50L或100L。本发明的补料分批发酵工艺的显著优点是其可以用于以5至10L发酵罐规模生产油，并且可扩展至任何体积，例如100L、150L、250L、500L、1000L或更多，而不限于此。

如通篇所讨论的，本文提供了培养微生物的方法，所述方法包括提供具有包含第一碳氮比的培养基中的一种或更多种微生物的容器。通常，培养基包括浓度为约5g/L至约200g/L的碳源，并且具有约1:1至约40:1的C:N(碳:氮)摩尔比。在所提供的方法中，第一碳氮摩尔比为30:1至60:1。任选地，第一碳氮摩尔比为40:1至50:1。如通篇更详细讨论的，碳源包括但不限于脂肪酸、脂质、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇和氨基糖。任选地，碳源是葡萄糖、果糖或甘油。如通篇更详细讨论的，氮源包括但不限于铵溶液、铵盐或胺盐、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。任选地，氮源是硫酸铵。

所提供的方法包括培养微生物直至培养物达到阈值指标。本文所用术语参数是指用于监测和控制微生物培养物的进程的指标或变量。这样的参数包括但不限于光密度(OD)、细胞浓度、二氧化碳产生速率、pH、溶解氧(DO)、时间、培养基中营养物的浓度、代谢副产物的积累、温度、生物质产率和油产率。如本领域普通技术人员将理解的并且基于本文提供的指导，预期使用任何合适的参数或参数的组合。任选地，所述参数是培养基中营养物的浓度。可以在培养基中测量的合适的营养物包括但不限于碳和氮。

所提供的方法包括收获一部分培养物同时维持容器中的大部分培养物。在所述方法中，所收获的部分包含约5％至约20％的培养物。任选地，所收获的部分包含约10％的培养物。

所提供的方法还包括向包含具有微生物的大部分培养物的容器中加入包含第二碳氮比的新鲜培养基。本文所用术语大部分是指50％或更多的包含微生物的培养物留在容器中而收获剩余部分的培养物。在所提供的方法中，第二碳氮比通常高于第一碳氮比。第二碳氮比的范围可以为约60:1至约95:1。任选地，第二碳氮比为约80:1至约90:1。如通篇更详细讨论的，碳源包括但不限于脂肪酸、脂质、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇和氨基糖。任选地，碳源是葡萄糖、果糖或甘油。如通篇更详细讨论的，氮源包括但不限于铵溶液、铵盐或胺盐、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。任选地，氮源是硫酸铵。

所提供的方法任选地包括重复以下步骤:(i)培养微生物直至培养物达到阈值指标；(ii)收获一部分所述培养物，同时维持容器中的大部分培养物；以及(iii)向包含含有微生物的大部分培养物的容器中加入具有第二碳氮比的新鲜培养基。这样，所提供的方法有利地允许培养物维持更长时间段，在此期间，培养物维持高水平的生物质和/或油产率。任选地，将培养物维持数小时、数天、数周或数月的时间段。任选地，将培养物维持至少150至500小时。例如，培养物可以维持至少250小时。任选地，将培养物维持一、二、三、四或五周。

所提供的方法允许培养物维持在高水平的生物质产率。本文所用术语“高水平的生物质产率”是指高于给定微生物的平均生物质产率的水平。通常，平均产率水平倾向于在40g/L-d或更低的范围内，即，0g/L-d至约40g/L-d，但可以根据微生物而变化。任选地，生物质产率包括60g/L-d至180g/L-d。任选地，生物质产率包括80g/L-d至130g/L-d。任选地，生物质产率包括90g/L-d至100g/L-d。本文所用术语“高”

所提供的方法还允许培养物维持在高水平的油产率。本文所用术语“高水平油产率”是指高于给定微生物的平均油产率的水平。通常，平均产率水平倾向于在25g/L-d或更低的范围内，即，0g/L-d至约25g/L-d，但可以根据微生物而变化。任选地，油产率包括35g/L-d至130g/L-d。任选地，油产率包括60g/L-d至90g/L-d。任选地，油产率包括70g/L-d至80g/L-d。因此，例如，微生物的培养物包含含有60％至85％油的生物质。任选地，微生物的培养物包含含有65％至75％油的生物质。

术语高、较高、增加、升高或提高是指高于对照的增加。术语低、较低、降低或减少是指低于对照水平的任何降低。举例来说，对照水平是在分批、补料分批或连续条件下生长的生物质和/或油产率水平。所提供的方法提供了比使用不同工艺(例如分批、补料分批或连续工艺)生长相同微生物时的水平高的生物质和/或油产率水平。生物质产率水平可以例如通过假设24小时周转时间包括在总工艺时间内来测定，在工艺的任意给定时间点的总生物质(X)产率可以计算为:X(克)/培养物体积(L)/时间(小时)*24(小时/天)，最终单位为g/L-天。在任意给定时间点的总油产率可以以类似的方式计算为:油(克)/培养物体积(升)/时间(小时)*24(小时/天)。

发酵

所提供的方法包括或可以与根据本领域已知的方法培养微生物的另外的步骤结合使用。例如，可以根据美国专利公开2009/0117194或2012/0244584中所述的方法培养破囊壶菌，例如，破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)，这两篇专利通过引用整体并入本文用于其中所使用的方法或组合物的每个步骤。微生物在生长培养基(也称为“培养基”)中生长。多种培养基中的任一种可适用于培养本文所述的微生物。任选地，培养基为微生物提供各种营养成分，包括碳源和氮源。

破囊壶菌培养物的培养基可以包括多种碳源中的任一种。碳源的实例包括脂肪酸、脂质、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇、氨基糖和任何种类的生物质或废物流。脂肪酸包括例如油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纤维素、半纤维素、果糖、葡萄糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸盐、m-肌醇(例如，来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，衍生自果胶)、L-岩藻糖(例如，衍生自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸(例如，衍生自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如，衍生自淀粉)和蔗糖(例如，来自糖蜜)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇和阿东糖醇。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。任选地，碳源是葡萄糖。如上所述，在所提供的方法中，碳源以高浓度(例如，至少200g/L)提供。

任选地，本文提供的微生物在增加目标化合物(例如，油或总脂肪酸(TFA)含量)的生物质和/或产量的条件下培养。例如，破囊壶菌通常在盐水培养基中培养。任选地，破囊壶菌可在具有约0.5g/L至约50.0g/L的盐浓度的培养基中培养。任选地，在具有约0.5g/L至约35g/L(例如，约18g/L至约35g/L)的盐浓度的培养基中培养破囊壶菌。任选地，本文所述的破囊壶菌可以在低盐条件下生长。例如，破囊壶菌可在具有约0.5g/L至约20g/L(例如，约0.5g/L至约15g/L)的盐浓度的培养基中培养。培养基任选地包括NaCl。任选地，培养基包括天然或人造海盐和/或人造海水。

培养基可以包括不含氯化物的钠盐作为钠源。适合用于本发明方法的非氯化物钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠及其混合物。参见，例如，美国专利No.5,340,742和6,607,900，其各自的全部内容通过引用并入本文。例如，总钠的很大一部分可以由非氯化物盐提供，使得培养基中总钠的小于约100％、75％、50％或25％由氯化钠提供。

任选地，培养基具有小于约3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L的氯化物浓度。例如，用于所提供的方法的培养基可以具有介于约60mg/L和120mg/L之间且包括约60mg/L和120mg/L的氯化物浓度。

破囊壶菌培养物的培养基可以包括多种氮源中的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，H₂O中的NH₄)、铵盐或胺盐(例如(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₃PO₄、NH₄NO₃、NH₄OOCH₂CH₃(NH₄Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。合适的培养基中氮源的浓度通常介于约1g/L至约25g/L之间，包括约1g/L和约25g/L。

培养基任选地包括磷酸盐，例如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和痕量营养物可以包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰氯化钙和EDTA。可以包括维生素例如盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素B12。

可使用酸或碱，在适当时，和/或使用氮源，将培养基的pH调节至3.0至10.0之间并且包括3.0和10.0。任选地，将培养基调节至如上限定的低pH。培养基可以是无菌的。

通常，用于培养微生物的培养基是液体培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以是固体培养基。除了如本文所讨论的碳和氮源之外，固体培养基还可以含有提供结构支持和/或使得培养基为固体形式的一种或更多种组分(例如，琼脂或琼脂糖)。

可以培养细胞一段时期。任选地，将细胞培养1天至60天之间的任何时间。任选地，将培养物维持数小时、数天、数周或数月的时间段。任选地，将培养物维持至少150至500小时。任选地，将培养物维持至少250小时。任选地，将培养物维持一、二、三、四或五周。培养任选在约4℃至约30℃、例如约18℃至约28℃的温度下进行。培养可以包括通气振荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、半连续培养、连续培养、辊式分批培养、波培养等。培养可以使用常规的搅拌-发酵罐、鼓泡塔发酵罐(分批或连续培养)、气升式发酵罐、波式发酵罐等进行。

培养物可以通过多种方法中的一种或更多种进行通气，包括振荡。任选地，振荡范围为约100rpm至约1000rpm，例如约350rpm至约600rpm或约100至约450rpm。任选地，在产生物质阶段期间和在产脂质阶段期间使用不同的振荡速度对培养物通气。替选地或另外地，振荡速度可根据培养容纳物的类型(例如，烧瓶的形状或大小)而变化。

可以根据涉及一种或更多种培养条件转换的方法通过培养细胞以获得更大量的所需化合物来增加所需脂质的产量。任选地，首先在使生物质最大化的条件下培养细胞，随后将一种或更多种培养条件转换为有利于脂质产率的条件。转换的条件可以包括氧浓度、C:N比、温度及其组合。任选地，进行两阶段培养，其中第一阶段有利于生物质产生(例如，使用高氧(例如，通常或相对于第二阶段)、低C:N比和环境温度)的条件，随后有利于脂质产生的第二阶段(例如，与第一阶段相比，其中氧减少、C:N比增加且温度降低)。与先前描述的方法相反，所提供的方法允许在高水平的油或脂质产生条件下维持培养长时间。

巴氏灭菌

任选地，将所得生物质巴氏灭菌以灭活存在于生物质中的非期望的物质。例如，可以将生物质巴氏灭菌以使化合物降解物质失活。生物质可以存在于发酵培养基中或从用于巴氏灭菌步骤的发酵培养基中分离。巴氏灭菌步骤可以通过将生物质和/或发酵培养基加热至高温来进行。例如，可以将生物质和/或发酵培养基加热至约50℃至约95℃(例如，约55℃至约90℃或约65℃至约80℃)的温度。任选地，可以将生物质和/或发酵培养基加热约30分钟至约120分钟(例如，约45分钟至约90分钟，或约55分钟至约75分钟)。巴氏灭菌可以使用本领域技术人员已知的合适的加热装置进行，例如通过直接蒸汽注射。

任选地，不进行巴氏灭菌步骤。换句话说，本文教导的方法任选地缺少巴氏灭菌步骤。

收获和洗涤

任选地，可以根据多种方法收获生物质，包括本领域技术人员目前已知的那些方法。例如，可以使用例如离心(例如，固体弹射离心机)或过滤(例如，交叉流过滤)从发酵培养基收集生物质，任选地使用沉淀剂来加速收集细胞生物质(例如，磷酸钠或氯化钙)。

任选地，用水洗涤生物质。任选地，生物质可以浓缩至高达约20％的固体。例如，生物质可以浓缩至约5％至约20％固体、约7.5％至约15％固体、或约固体至约20％固体或所述范围内的任意百分比。任选地，生物质可以浓缩至约20％固体或更少、约19％固体或更少、约18％固体或更少、约17％固体或更少、约16％固体或更少、约15％固体或更少、约14％固体或更少、约13％固体或更少、约12％固体或更少、约11％固体或更少、约10％固体或更少、约9％固体或更少、约8％固体或更少、约7％固体或更少、约6％固体或更少、约5％固体或更少、约4％固体或更少、约3％固体或更少、约2％固体或更少、或者约1％固体或更少。

分离和提取

所提供的方法任选地包括使用多种方法(包括本领域技术人员目前已知的那些)从生物质或微生物中分离多不饱和脂肪酸。例如，分离多不饱和脂肪酸的方法描述于美国专利No.8,163,515中，其全部内容通过引用并入本文。任选地，在分离多不饱和脂肪酸之前不对培养基灭菌。任选地，灭菌包括温度升高。任选地，由微生物产生并由所提供的方法分离的多不饱和脂肪酸是中链脂肪酸。任选地，一种或更多种多不饱和脂肪酸选自α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。

产物

包括多不饱和脂肪酸(PUFA)的油和根据本文所述的方法产生的其它脂质可以用于利用其生物学、营养或化学性质的多种应用中的任一种。因此，所提供的方法任选地包括从所收获的培养物分离油。任选地，油用于产生燃料，例如生物燃料。任选地，油可以用于药物、食品补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等。根据本文所述方法产生的脂质也可用作生产其它化合物的中间体。

举例来说，由使用所提供的方法培养的微生物产生的油可以包含脂肪酸。任选地，脂肪酸选自α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸及其组合。任选地，油包含甘油三酯。任选地，油包含选自棕榈酸(C16:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈油酸(C16:1(n-7))、顺式异油酸(C18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(C22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(C22:6(n-3))及其组合的脂肪酸。任选地，分离的脂肪酸中二十二碳六烯酸的浓度为总脂肪酸浓度的20％或更少。

任选地，根据本文所述方法产生的脂质可以掺入到最终产品(例如，食品或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物、燃料等)中。脂质可以掺入其中的合适的食品或饲料补充剂包括饮料如牛奶、水、运动饮品、能量饮品、茶和果汁；糖果例如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食品和饮料例如乳制品；加工食品例如软米(或粥)；婴儿配方奶粉；早餐谷物等。任选地，一种或更多种产生的脂质可以掺入到膳食补充剂中，例如维生素或多种维生素。任选地，根据本文所述方法产生的脂质可以包括在膳食补充剂中，并且任选地可以直接掺入食品或饲料(例如，食品补充剂)的组分中。

可以掺入通过本文所述的方法产生的脂质的饲料的实例包括宠物食品，例如猫食、狗食等；水族鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；养殖动物(包括在水产养殖中养殖的家畜和鱼类或甲壳类动物)的饲料。可以掺入根据本文所述方法产生的脂质的食品或饲料材料优选对于生物体(为预期接受者)是可口。这种食品或饲料材料可以具有目前已知的用于食品材料(例如，固体、液体、软质物(soft))的任何物理性质。

任选地，可以将一种或更多种所产生的化合物(例如，PUFA)掺入营养品或药物中。这样的营养品或药物的实例包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用试剂等。任选地，营养品或药物适于局部应用。剂型可包括例如胶囊、油、颗粒剂、浓缩颗粒剂(granula subtilae)、散剂(pulveres)、片剂、丸剂、锭剂等。

根据本文所述方法产生的油或脂质可以与任何各种其它试剂组合掺入本文所述的产品中。例如，这样的化合物可以与一种或更多种粘合剂或填料、螯合剂、颜料、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、香料、防腐剂等或其任意组合相组合。

公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集合组合和排列的具体引用，但是其分别在本文中特别涵盖和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括该方法的多种分子数目进行的多种修饰，除非相反地特别指出，否则该方法的各个组合和排列以及可能的修饰均被特别涵盖。同样，也特别涵盖和公开了这些的任何子集或组合。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多种另外的步骤，则应当理解，这些额外的步骤中的每一个均可以利用所公开的方法的任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集是特别涵盖的并且应当被认为是公开的。

如通篇所用，范围(例如1-10)和对约给定值(例如约1或约10)的引用包括所述一个或多个值(例如1和/或10)

本文引用的出版物和其引用的材料特别地通过引用整体并入本文。

以下实施例旨在进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，并且不旨在限制权利要求的范围。

实施例

用于生产生物质和油的半连续发酵

在微生物油生产领域中，异养黑暗发酵通常被认为在工艺效率和产物产率方面优于自养光养性微生物培养。然而，它常常受到较高的固定资本成本(构建基于容纳物的发酵设备的成本通常远高于开放池塘(open-pond)和跑道型(raceway)培养系统的资本成本)的阻碍。使用本文所述的这样的半连续生产工艺可以获得更高的总产率，同时降低操作成本(最小化生产发酵罐容纳物的周转程序和容纳物灭菌程序)。这意味着更好地利用固定资本投资(发酵罐和相关投资设备)和更高的年生产能力。

在补料分批微生物培养期间，培养细胞/油浓度遵循典型的微生物S形生长曲线(图1)，并且即时生物质/油产率在该工艺后期但在培养达到稳定期之前处于其最高水平，其可以由S曲线上最陡的斜率表示(图1)。然而，典型补料分批培养在培养物通过高即时产率阶段后不久停止，并且总体产率不能非常高，因为可以到达在高即时产率阶段之前，培养物花费大量的工艺时间通过较低的即时产率阶段。半连续工艺通过在高浓度下反复收获一定体积的培养肉汤(broth)同时提供新平衡的培养基从而使培养物以更高的速率重复产生生物质和油来利用培养物在高即时产率阶段期间生长和合成油的能力。

所提供的半连续工艺在培养物的峰产率水平延长生长和油产生。假设24小时周转时间包括在总工艺时间内，在工艺的任意给定时间点的总生物质(X)产率可以计算为:X(克)/培养物体积(L)/时间(小时)*24(小时/天)，最终单位为g/L-天。在任意给定时间点的总油产率可以以类似的方式计算为:油(克)/培养物体积(升)/时间(小时)*24(小时/天)。如在生物质和油生产率的总图中所见，在典型的补料分批工艺(由67小时的分界线指示)结束时，生物质和油产率分别仅为42g/L-d和28g/L-d(图2)。通过将所提供的半连续模式下的发酵延长至453小时(19天)，总生物质和油产率逐渐增加，并分别达到96g/L-d和72g/L-d的平台(图2)。这些高产率值远远超过典型的分批或补料分批工艺可实现的值。

简言之，首先采用补料分批发酵工艺使ONC-T18细胞生长至高细胞浓度和高油含量，此时预定氮源已在培养基中耗尽，碳源被控制在接近零的水平，并且即时体积生物质/油产率在其最大区域内。收获一定体积(10％)的培养肉汤，并向发酵罐中加入相同体积的含有预定浓度的碳和氮营养物以及所有其它必需的矿物质营养物的新鲜培养基，以代替收获的培养肉汤。补料培养基中的碳和氮也需要处于一定比例以便在培养物中获得和维持高油含量。对于图2，在对应于碳(C)氮(N)比为88:1(摩尔比)的补料培养基中分别使用300g/L和7.5g/L的葡萄糖和硫酸铵((NH4)2SO4)浓度。使用新提供的培养基继续培养，培养物产生更多的生物质和油。一旦碳源已经耗尽，重复部分肉汤收获和新鲜培养基供应循环。使用这种方法，可以半连续方式生产和收获含有高油含量的高密度生物质，并且该工艺的总持续时间可以比这些微生物的任何分批或补料分批培养模式长得多。

为了确定所提供的半连续方法是否优于连续发酵方法，在连续培养条件下使用88:1的C:N比使细胞生长。结果示于图3至7中。具体地，图3和4示出连续的发酵导致不可持续的发酵、生物质减少和流出物中葡萄糖浓度增加。发酵因管路堵塞而停止。图5、6和7示出在半连续和连续发酵条件下生长的ONC-T18的生物质或油产率的比较。半连续发酵导致更高的生物质和油产率，并允许培养物在高产率条件下维持更长时间段。实际上，在该实验中，连续发酵方法持续约160小时，比半连续发酵短。

序列表

<110> 玛拉可再生能源公司

<120> 半连续培养方法

<130> 095523-0960110 (010WO1)

<150> 62/064,668

<151> 2014-10-16

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60

gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120

atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180

gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240

gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300

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cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480

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acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380

gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440

catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500

cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560

agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620

cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680

tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723