用于对肉类、植物或植物部分进行病原体检测和病害治理的方法与流程

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发明背景

收获后的各种水果可能遭受病原体和病害发展。例如，在收获时，浆果(包括草莓)通常是手工采摘的并且遭受霉菌，并且因此随后会腐烂。

因此，仍然需要开发用于检测肉类、植物或植物部分上的病原体的方法。此外，如果感兴趣，检测病原体可以更好地对肉类、植物或植物部分进行病害治理。

发明概述

提供了用于检测感染肉类、植物或植物部分的病原体的方法。还提供了用于对肉类、植物或植物部分进行疾病预测和/或病害治理的方法。在一些实施例中，所提供的方法包括基于核酸的扩增。这种基于核酸的扩增方法的实例包括定量聚合酶链式反应(qPCR)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。

具体地，提供了用于检测葡萄孢菌(Botrytis)的寡核苷酸引物组的序列。在一个实施例中，所提供的引物组可用于RPA。

此外，提供了用于病害治理的、对葡萄孢菌检测具有不同敏感性的引物组合，以确定与葡萄孢菌感染相关的病害发展的风险水平。例如，可以提供由低度风险、中度风险和高度风险组成的三级风险水平。

还提供了对草莓花萼进行取样以用于葡萄孢菌检测的方法。

附图的简要说明

图1示出灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)核糖体IGS靶标的初始RPA引物筛选的代表性结果。解链曲线分析显示强的扩增引物对(R1F1)和在10拷贝的灰葡萄孢菌基因组DNA处的良好扩增。

图2A和图2B示出使用R1F1引物(图2A)或R1F6引物(图2B)的生物分析器(BioAnalyzer)分析的代表性照片。对于图2A，希望的扩增子是约120个碱基对。阴性对照显示没有背景希望的扩增子产物。在5个葡萄孢菌基因组DNA拷贝上观察到强的扩增。在10个葡萄孢菌基因组DNA拷贝上没有观察到显著的人工扩增，这显示出当与R1F6引物对相比时，R1F1引物对具有更高的敏感性。对于图2B，希望的扩增子是约148个碱基对。阴性对照显示没有背景希望的扩增子产物。在200-500个葡萄孢菌基因组DNA拷贝上观察到强的扩增。在50个葡萄孢菌基因组DNA拷贝上没有观察到扩增。

图3示出使用R1F1和R1F6的RPA反应产物的生物分析器分析的代表性照片。使用正向引物F1或F6进行反应。

图4示出随扩增时间变化的荧光。在不存在靶标DNA的情况下，仍然可以存在荧光增加。

图5示出R2F3引物对的RPA和PCR反应产物的电泳图。对广泛的产物(PCR)或多个产物(RPA)进行了鉴定。

图6示出R1F1和R1F3RPA反应扩增子的电泳图。在没有模板存在的情况下，存在多个人工扩增子。使用250个灰葡萄孢菌gDNA拷贝，特异性产生了希望的扩增子。

图7示出了用于概念验证实验的RPA反应产物的分析。阴性样品仅含有RPA预混合液和引物对。花萼#1和花萼#2样品显示来自两个单独制备的花萼的扩增产物。花萼+BC样品用于掺有完整葡萄孢菌孢子的花萼。仅含BC的样品仅含有葡萄孢菌孢子且没有花萼材料。

图8示出了为靶标1的RPA测定的开发而排序的引物。购买在下图中列出的引物作为所示序列的反向互补序列。

图9示出了为RPA反应排序的核糖体IGS引物。

发明的详细说明

除非另外规定，否则在本申请(包括说明书和权利要求书)中使用的下列术语具有下面给出的定义。必须指出，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。

提供了用于检测病原体(例如灰葡萄孢菌)的诊断试剂盒。这类诊断试剂盒可以由浆果价值链(例如草莓)中的用户/参与者使用，以便预测葡萄孢菌腐烂的风险。在一个实施例中，所提供的诊断试剂盒包括基于等温核酸的测试，例如重组酶聚合酶扩增(RPA)。

还提供了将样品上的葡萄孢菌量与腐败概率相关联的风险模型。在一个实施例中，所提供的诊断试剂盒可检测病原体的10至10,000个孢子；25至5,000个孢子；50至2,500个孢子；或100至1,000个孢子/草莓花萼。

在一个实施例中，所提供的诊断试剂盒能够检测病原体的存在或不存在。在另一个实施例中，所提供的诊断试剂盒还能够定量和/或半定量(例如多级风险水平系统)检测病原体。在进一步的实施例中，通过对基于等温核酸的测试(例如RPA)的不同敏感性的多个引物组的使用/组合能够实现定量和/或半定量检测的能力。

重组酶聚合酶扩增(RPA)先前已经披露在美国专利号7,485,428、7,666,598和7,763,427中，其内容从而通过引用以其全文并入本文。

在一个方面，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的方法。该方法包括

(a)提供肉类、植物或植物部分的样品；

(b)使用针对至少一个靶序列的多个寡核苷酸引物，对该样品进行基于核酸的扩增；并且

(c)确定来自该样品中至少一种病原体的存在或不存在。

在所提供的方法的一个实施例中，基于核酸的扩增包括定量聚合酶链式反应(qPCR)或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一个实施例中，该基于核酸的扩增包括等温核酸扩增。在进一步的实施例中，该基于核酸的扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：枝顶孢属(Acremonium spp.)、白锈菌属(Albugo spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、壳二孢属(Ascochyta spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、球二孢属(Botryodiplodia spp.)、葡萄座腔菌属(Botryospheria spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)、丝衣霉属(Byssochlamys spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、头孢霉属(Cephalosporium spp.)、长喙壳属(Ceratocystis spp.)、尾孢属(Cercospora spp.)、横节霉菌属(Chalara spp.)、枝孢属(Cladosporium spp)、刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporiopsis spp.)、柱孢属(Cylindrocarpon spp.)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces spp.)、间座壳属(Diaporthe spp.)、亚隔孢壳属(Didymella spp.)、色二孢属(Diplodia spp.)、小穴壳菌属(Dothiorella spp.)、痂囊腔菌属(Elsinoe spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、地丝菌属(Geotrichum spp.)、盘长孢属(Gloeosporium spp.)、小丛壳属(Glomerella spp.)、长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、球黑孢菌属(Khuskia spp.)、毛双孢属(Lasiodiplodia spp.)、大茎点菌属(Macrophoma spp.)、壳球孢属(Macrophomina spp.)、微座孢属(Microdochium spp.)、链核盘菌属(Monilinia spp.)、Monilochaethes属、毛霉菌属(Mucor spp.)、菌刺孢属(Mycocentrospora spp.)、球腔菌属(Mycosphaerella spp.)、丛赤壳属(Nectria spp.)、Neofabraea属、黑孢属(Nigrospora spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、霜疫霉属(Peronophythora spp.)、霜霉属(Peronospora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)、无柄盘菌属(Pezicula spp.)、星裂盘孢属(Phacidiopycnis spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、拟茎点霉属(Phomopsis spp.)、叶点霉属(Phyllosticta spp.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、蛇孢霉属(Polyscytalum spp.)、假尾孢属(Pseudocercospora spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)、腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、菌核属(Sclerotium spp.)、核盘菌属(Sclerotinia spp.)、壳针孢属(Septoria spp.)、痂圆孢属(Sphaceloma spp.)、球壳孢属(Sphaeropsis spp.)、灰斑病属(Stemphyllium spp.)、束梗孢属(Stilbella spp.)、根串珠霉属(Thielaviopsis spp.)、Thyronectria属、Trachysphaera属、单孢锈菌属(Uromyces spp.)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、黑星菌属(Venturia spp.)、轮枝菌属(Verticillium spp.)及其组合。在进一步的实施例中，该至少一种病原体包括灰葡萄孢菌。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：欧文氏菌属(Erwinia spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)、果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、利斯特菌属(Listeria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、弯曲菌属(Campylobacter spp.)、棒形杆菌属(Clavibacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属(Giardia spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)及其组合。

在另一个实施例中，植物或植物部分包括转基因植物或转基因植物部分。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、棉花、水稻、大豆和油菜。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：水果、蔬菜、苗圃、草皮和观赏作物。在进一步的实施例中，水果选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘类(包括橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚和其他柑橘)、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果(包括草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓、醋栗和其他类型的浆果)。在进一步的实施例中，蔬菜选自下组，该组由以下各项组成：番茄、马铃薯、甘薯、木薯、胡椒、甜椒、胡萝卜、芹菜、南瓜、茄子、卷心菜、花椰菜、西兰花、芦笋、蘑菇、洋葱、大蒜、韭葱和食荚菜豆。在进一步的实施例中，花或花部分选自下组，该组由以下各项组成：玫瑰、康乃馨、兰花、天竺葵、百合或其他观赏花卉。在进一步的实施例中，肉类选自食用牛、野牛、鸡、鹿、山羊、火鸡、猪、绵羊、鱼、贝类、软体动物或干腌肉制品的组。

在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果。在进一步的实施例中，植物或植物部分包括一种或多种浆果。在另一个进一步的实施例中，浆果选自下组，该组由以下各项组成：草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓及其组合。在进一步的实施例中，柑橘选自下组，该组由以下各项组成：橙子、柠檬、酸橙和葡萄柚。

在一个实施例中，该至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-13。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。

在另一个方面，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的方法。该方法包括

(a)提供肉类、植物或植物部分的样品；

(b)使用针对至少一个靶序列的多个寡核苷酸引物，对该样品进行基于核酸的扩增；并且

(c)基于多级风险系统，确定来自该样品的至少一种病原体的风险水平。

在所提供的方法的一个实施例中，该多级风险系统包括三个等级，该三个等级包括低度风险、中度风险和高度风险。在另一个实施例中，基于核酸的扩增包括定量聚合酶链式反应(qPCR)或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一个实施例中，基于核酸的扩增包括等温核酸扩增。在进一步的实施例中，基于核酸的扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：枝顶孢属(Acremonium spp.)、白锈菌属(Albugo spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、壳二孢属(Ascochyta spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、球二孢属(Botryodiplodia spp.)、葡萄座腔菌属(Botryospheria spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)、丝衣霉属(Byssochlamys spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、头孢霉属(Cephalosporium spp.)、长喙壳属(Ceratocystis spp.)、尾孢属(Cercospora spp.)、横节霉菌属(Chalara spp.)、枝孢属(Cladosporium spp)、刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporiopsis spp.)、柱孢属(Cylindrocarpon spp.)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces spp.)、间座壳属(Diaporthe spp.)、亚隔孢壳属(Didymella spp.)、色二孢属(Diplodia spp.)、小穴壳菌属(Dothiorella spp.)、痂囊腔菌属(Elsinoe spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、地丝菌属(Geotrichum spp.)、盘长孢属(Gloeosporium spp.)、小丛壳属(Glomerella spp.)、长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、球黑孢菌属(Khuskia spp.)、毛双孢属(Lasiodiplodia spp.)、大茎点菌属(Macrophoma spp.)、壳球孢属(Macrophomina spp.)、微座孢属(Microdochium spp.)、链核盘菌属(Monilinia spp.)、Monilochaethes属、毛霉菌属(Mucor spp.)、菌刺孢属(Mycocentrospora spp.)、球腔菌属(Mycosphaerella spp.)、丛赤壳属(Nectria spp.)、Neofabraea属、黑孢属(Nigrospora spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、霜疫霉属(Peronophythora spp.)、霜霉属(Peronospora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)、无柄盘菌属(Pezicula spp.)、星裂盘孢属(Phacidiopycnis spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、拟茎点霉属(Phomopsis spp.)、叶点霉属(Phyllosticta spp.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、蛇孢霉属(Polyscytalum spp.)、假尾孢属(Pseudocercospora spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)、腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、菌核属(Sclerotium spp.)、核盘菌属(Sclerotinia spp.)、壳针孢属(Septoria spp.)、痂圆孢属(Sphaceloma spp.)、球壳孢属(Sphaeropsis spp.)、灰斑病属(Stemphyllium spp.)、束梗孢属(Stilbella spp.)、根串珠霉属(Thielaviopsis spp.)、Thyronectria属、Trachysphaera属、单孢锈菌属(Uromyces spp.)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、黑星菌属(Venturia spp.)、轮枝菌属(Verticillium spp.)及其组合。在进一步的实施例中，该至少一种病原体包括灰葡萄孢菌。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：欧文氏菌属(Erwinia spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)、果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、利斯特菌属(Listeria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、弯曲菌属(Campylobacter spp.)、棒形杆菌属(Clavibacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属(Giardia spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)及其组合。

在另一个实施例中，植物或植物部分包括转基因植物或转基因植物部分。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、棉花、水稻、大豆和油菜。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：水果、蔬菜、苗圃、草皮和观赏作物。在进一步的实施例中，水果选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘类(包括橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚和其他柑橘)、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果(包括草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓、醋栗和其他类型的浆果)。在进一步的实施例中，蔬菜选自下组，该组由以下各项组成：番茄、马铃薯、甘薯、木薯、胡椒、甜椒、胡萝卜、芹菜、南瓜、茄子、卷心菜、花椰菜、西兰花、芦笋、蘑菇、洋葱、大蒜、韭葱和食荚菜豆。在进一步的实施例中，花或花部分选自下组，该组由以下各项组成：玫瑰、康乃馨、兰花、天竺葵、百合或其他观赏花卉。在进一步的实施例中，肉类选自食用牛、野牛、鸡、鹿、山羊、火鸡、猪、绵羊、鱼、贝类、软体动物或干腌肉制品的组。

在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果。在进一步的实施例中，植物或植物部分包括一种或多种浆果。在另一个进一步的实施例中，浆果选自下组，该组由以下各项组成：草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓及其组合。在进一步的实施例中，柑橘选自下组，该组由以下各项组成：橙子、柠檬、酸橙和葡萄柚。

在一个实施例中，该至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-13。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。

在另一个方面，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的方法。该方法包括

(a)提供肉类、植物或植物部分的样品；

(b)使用针对至少一个靶序列的多个寡核苷酸引物，对该样品进行基于核酸的扩增；并且

(c)确定该样品中至少一种病原体的孢子数目。

在所提供的方法的一个实施例中，该样品中的孢子数目为至少一种病原体的10至10,000个孢子；25至5,000个孢子；50至2,500个孢子；或100至1,000个孢子。在另一个实施例中，基于核酸的扩增包括定量聚合酶链式反应(qPCR)或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一个实施例中，基于核酸的扩增包括等温核酸扩增。在进一步的实施例中，基于核酸的扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：枝顶孢属(Acremonium spp.)、白锈菌属(Albugo spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、壳二孢属(Ascochyta spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、球二孢属(Botryodiplodia spp.)、葡萄座腔菌属(Botryospheria spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)、丝衣霉属(Byssochlamys spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、头孢霉属(Cephalosporium spp.)、长喙壳属(Ceratocystis spp.)、尾孢属(Cercospora spp.)、横节霉菌属(Chalara spp.)、枝孢属(Cladosporium spp)、刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporiopsis spp.)、柱孢属(Cylindrocarpon spp.)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces spp.)、间座壳属(Diaporthe spp.)、亚隔孢壳属(Didymella spp.)、色二孢属(Diplodia spp.)、小穴壳菌属(Dothiorella spp.)、痂囊腔菌属(Elsinoe spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、地丝菌属(Geotrichum spp.)、盘长孢属(Gloeosporium spp.)、小丛壳属(Glomerella spp.)、长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、球黑孢菌属(Khuskia spp.)、毛双孢属(Lasiodiplodia spp.)、大茎点菌属(Macrophoma spp.)、壳球孢属(Macrophomina spp.)、微座孢属(Microdochium spp.)、链核盘菌属(Monilinia spp.)、Monilochaethes属、毛霉菌属(Mucor spp.)、菌刺孢属(Mycocentrospora spp.)、球腔菌属(Mycosphaerella spp.)、丛赤壳属(Nectria spp.)、Neofabraea属、黑孢属(Nigrospora spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、霜疫霉属(Peronophythora spp.)、霜霉属(Peronospora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)、无柄盘菌属(Pezicula spp.)、星裂盘孢属(Phacidiopycnis spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、拟茎点霉属(Phomopsis spp.)、叶点霉属(Phyllosticta spp.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、蛇孢霉属(Polyscytalum spp.)、假尾孢属(Pseudocercospora spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)、腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、菌核属(Sclerotium spp.)、核盘菌属(Sclerotinia spp.)、壳针孢属(Septoria spp.)、痂圆孢属(Sphaceloma spp.)、球壳孢属(Sphaeropsis spp.)、灰斑病属(Stemphyllium spp.)、束梗孢属(Stilbella spp.)、根串珠霉属(Thielaviopsis spp.)、Thyronectria属、Trachysphaera属、单孢锈菌属(Uromyces spp.)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、黑星菌属(Venturia spp.)、轮枝菌属(Verticillium spp.)及其组合。在进一步的实施例中，该至少一种病原体包括灰葡萄孢菌。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：欧文氏菌属(Erwinia spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)、果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、利斯特菌属(Listeria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、弯曲菌属(Campylobacter spp.)、棒形杆菌属(Clavibacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属(Giardia spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)及其组合。

在另一个实施例中，植物或植物部分包括转基因植物或转基因植物部分。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、棉花、水稻、大豆和油菜。在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：水果、蔬菜、苗圃、草皮和观赏作物。在进一步的实施例中，水果选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘类(包括橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚和其他柑橘)、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果(包括草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓、醋栗和其他类型的浆果)。在进一步的实施例中，蔬菜选自下组，该组由以下各项组成：番茄、马铃薯、甘薯、木薯、胡椒、甜椒、胡萝卜、芹菜、南瓜、茄子、卷心菜、花椰菜、西兰花、芦笋、蘑菇、洋葱、大蒜、韭葱和食荚菜豆。在进一步的实施例中，花或花部分选自下组，该组由以下各项组成：玫瑰、康乃馨、兰花、天竺葵、百合或其他观赏花卉。在进一步的实施例中，肉类选自食用牛、野牛、鸡、鹿、山羊、火鸡、猪、绵羊、鱼、贝类、软体动物或干腌肉制品的组。

在另一个实施例中，植物或植物部分选自下组，该组由以下各项组成：香蕉、菠萝、柑橘、葡萄、西瓜、哈密瓜、甜瓜和其他瓜类、苹果、桃、梨、樱桃、猕猴桃、芒果、油桃、番石榴、番木瓜、柿子、李子、石榴、鳄梨、无花果、以及浆果。在进一步的实施例中，植物或植物部分包括一种或多种浆果。在另一个进一步的实施例中，浆果选自下组，该组由以下各项组成：草莓、蓝莓、覆盆子、黑莓、蔓越莓及其组合。在进一步的实施例中，柑橘选自下组，该组由以下各项组成：橙子、柠檬、酸橙和葡萄柚。

在一个实施例中，该至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-13。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。

在另一个实施例中，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括多个寡核苷酸引物，该多个寡核苷酸引物包括选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。

在另一个实施例中，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括多个寡核苷酸引物，该多个寡核苷酸引物包括选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。

在另一个实施例中，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括多个寡核苷酸引物，该多个寡核苷酸引物包括选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。在另一个方面，提供了用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的寡核苷酸引物的组合，其中这些引物具有不同的敏感性，以便检测至少一个靶序列。在一个实施例中，该至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-13。在另一个实施例中，寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。在另一个实施例中，寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。在另一个实施例中，寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。

在另一个方面，提供了从草莓花萼取样用于检测至少一种感染肉类、植物或植物部分的病原体的方法。该方法包括

(a)从草莓中除去花萼；

(b)使除去的花萼均质化，并且

(c)使用针对至少一个靶序列的多个寡核苷酸引物，对该样品进行基于核酸的扩增。

在所提供的方法的一个实施例中，基于核酸的扩增包括定量聚合酶链式反应(qPCR)或重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一个实施例中，基于核酸的扩增包括等温核酸扩增。在进一步的实施例中，基于核酸的扩增包括重组酶聚合酶扩增(RPA)。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：枝顶孢属(Acremonium spp.)、白锈菌属(Albugo spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、壳二孢属(Ascochyta spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、球二孢属(Botryodiplodia spp.)、葡萄座腔菌属(Botryospheria spp.)、葡萄孢属(Botrytis spp.)、丝衣霉属(Byssochlamys spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、头孢霉属(Cephalosporium spp.)、长喙壳属(Ceratocystis spp.)、尾孢属(Cercospora spp.)、横节霉菌属(Chalara spp.)、枝孢属(Cladosporium spp)、刺盘孢属(Colletotrichum spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporiopsis spp.)、柱孢属(Cylindrocarpon spp.)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces spp.)、间座壳属(Diaporthe spp.)、亚隔孢壳属(Didymella spp.)、色二孢属(Diplodia spp.)、小穴壳菌属(Dothiorella spp.)、痂囊腔菌属(Elsinoe spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、地丝菌属(Geotrichum spp.)、盘长孢属(Gloeosporium spp.)、小丛壳属(Glomerella spp.)、长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、球黑孢菌属(Khuskia spp.)、毛双孢属(Lasiodiplodia spp.)、大茎点菌属(Macrophoma spp.)、壳球孢属(Macrophomina spp.)、微座孢属(Microdochium spp.)、链核盘菌属(Monilinia spp.)、Monilochaethes属、毛霉菌属(Mucor spp.)、菌刺孢属(Mycocentrospora spp.)、球腔菌属(Mycosphaerella spp.)、丛赤壳属(Nectria spp.)、Neofabraea属、黑孢属(Nigrospora spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、霜疫霉属(Peronophythora spp.)、霜霉属(Peronospora spp.)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)、无柄盘菌属(Pezicula spp.)、星裂盘孢属(Phacidiopycnis spp.)、茎点霉属(Phoma spp.)、拟茎点霉属(Phomopsis spp.)、叶点霉属(Phyllosticta spp.)、疫霉属(Phytophthora spp.)、蛇孢霉属(Polyscytalum spp.)、假尾孢属(Pseudocercospora spp.)、梨孢属(Pyricularia spp.)、腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、菌核属(Sclerotium spp.)、核盘菌属(Sclerotinia spp.)、壳针孢属(Septoria spp.)、痂圆孢属(Sphaceloma spp.)、球壳孢属(Sphaeropsis spp.)、灰斑病属(Stemphyllium spp.)、束梗孢属(Stilbella spp.)、根串珠霉属(Thielaviopsis spp.)、Thyronectria属、Trachysphaera属、单孢锈菌属(Uromyces spp.)、黑粉菌属(Ustilago spp.)、黑星菌属(Venturia spp.)、轮枝菌属(Verticillium spp.)及其组合。在进一步的实施例中，该至少一种病原体包括灰葡萄孢菌。

在另一个实施例中，该至少一种病原体选自下组，该组由以下各项组成：欧文氏菌属(Erwinia spp.)、泛菌属(Pantoea spp.)、果胶杆菌属(Pectobacterium spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)、埃希氏杆菌属(Escherichia spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、利斯特菌属(Listeria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、念珠菌属(Candida spp.)、德巴利酵母属(Debaryomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、弯曲菌属(Campylobacter spp.)、棒形杆菌属(Clavibacter spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属(Giardia spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)及其组合。

在一个实施例中，该至少一个靶序列选自SEQ ID NO:1-13。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:14-29的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:30-45的至少一个序列。在另一个实施例中，该多个寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:46-61的至少一个序列。

本领域技术人员应理解，基于所提供的披露内容可以存在某些变型。因此，为了说明本发明的目的而给出以下实例，并且这些实例不应被解释为限制本发明或权利要求书的范围。

实例

实例1-鉴定有利的基因靶标以用于检测灰葡萄孢菌

计算分析已公开的灰葡萄孢菌(BC)基因组(T.4和B05.10)以确定最高拷贝数区域来促进基于敏感DNA的诊断(见表1)的开发，其中在多个学术出版物中已经分析了核糖体IGS、微管蛋白和角质酶基因。最高拷贝数靶标包含约40个拷贝/基因组。靶标之一，BC靶标3被鉴定为编码5S核糖体RNA。将每个基因靶标的序列列为SEQ ID NO:1-13。开发定量实时PCR(qPCR)测定以验证计算预测。

将qPCR的引物列于表2中，其中将dsDNA结合的荧光探针、EvaGreen染料用于qPCR。EvaGreen染料是SYBR绿色染料的优势版本，并且可以用于SYBR绿色测定。使用凯杰公司植物DNA提取试剂盒(Qiagen Plant DNeasy kit)分离葡萄孢菌gDNA。

对于每个qPCR反应，将以下试剂混合在一起：

1.8μL正向引物(50μM)

1.8μL反向引物(50μM)

5.0μL 20x EvaGreen染料

50μL的无Amperase的TaqMan快速预混合液(TaqMan Fast Master-mix)(2x)

31.4μL H₂O

将葡萄孢菌gDNA(10ng/μL)依次10倍连续稀释至1pg/μL(24个拷贝/μL)的浓度。对于每个反应，向孔中添加2μL的适当稀释的模板gDNA，接着添加18μL的上述制备的反应混合物。然后将板在2200RCF下离心5分钟。扩增反应在应用生物系统公司StepOne Plus型(Applied Biosystems StepOne Plus)实时PCR系统(加利福尼亚州，福斯特市(Foster City，CA))上进行。循环条件为95℃变性20秒，在95℃下持续3秒和在60℃下持续30秒的40个循环。

假定微管蛋白基因作为单拷贝存在，C_T值可以转化为每个基因组的拷贝。这一假设得到葡萄孢菌和其他相关真菌基因组生物信息学知识的有力支持。使用以下等式计算每个基因组的拷贝：

基于表3所示的实验结果，靶标按以下顺序排列：核糖体IGS>(BC靶标1和BC靶标3)>(BC靶标7和BC靶标8)>(BC靶标5、BC靶标6和BC靶标9)>微管蛋白>BC靶标4。

核糖体IGS、BC靶标1和BC靶标3似乎是高拷贝数的基因。BC靶标7和BC靶标8每个基因组出现低2-3倍的拷贝。在这些实验中，BC靶标5、BC靶标6和BC靶标9比其他在初始qPCR实验中选择的靶标表现更差。因此，选择BC靶标1用于进一步分析。

实例2-设计和评价用于扩增灰葡萄孢菌靶标1的RPA引物组

选择来自实例1的BC靶标1用于开发引物组，该引物组用于在重组酶聚合酶扩增(RPA)中使用。每个葡萄孢菌基因组有约25个拷贝的BC靶标1，并且该序列对RPA具有有利的GC含量(％40)。BC靶标1遗传元件是245个碱基，其给出了相对于BC靶标3筛选更大量引物的一些空间。

不存在已知的计算机软件或模型用于开发RPA的引物组。为了开发引物组，必须对每个靶标进行相对大量的筛选。进行葡萄孢菌基因组中BC靶标1序列的多重序列比对以确定用于RPA扩增的最佳区域。该BC靶标1遗传元件存在于基因组中的许多相似但不相同的拷贝中。它提供设计用于BC靶标1的最保守区域的引物。因此，针对BC靶标1遗传元件的最保守区域选择八个正向引物(F1-F8)和八个反向引物(R1-R8)(SEQ ID NO:30-45)。

然后，除了添加1x EvaGreen染料之外，使用RPA筛选引物。扩增反应在应用生物系统公司StepOne Plus型(Applied Biosystems StepOne Plus)实时PCR系统上进行。通过EvaGreen染料与由RPA反应产生的双链DNA的结合而增加荧光来监测扩增。

在不存在靶标DNA的情况下，荧光的增加促进了溶解曲线的分析，以确定是否产生希望的扩增子。在存在和不存在靶标DNA的情况下，对每个引物对进行解链曲线分析，以确定靶标DNA对解链曲线的依赖性效应。假设如果发生特异性扩增，则在靶标DNA的存在下，在解链曲线中将存在尖锐的单峰。

在存在或不存在靶标DNA的情况下，大多数筛选的引物对在解链曲线上没有显示出差异。BC靶标1的R2F3引物对在初始筛选中显示最佳的总体性能。然后在生物分析器上分析反应产物。在某些情况下，可以在生物分析器中鉴定多种反应产物。

实例3-设计和评价用于扩增灰葡萄孢菌核糖体基因间隔区的RPA引物组

所选的BC靶标1可以在某些情况下产生多种扩增产物。因为核糖体IGS靶标在qPCR测定中表现最好，并且在文献中有先例说明这是检测葡萄孢菌的敏感靶标，所以还选择核糖体基因间隔区(IGS)用于进一步开发。设计引物并将其列于SEQ ID NO:46-61中。首先用EvaGreen染料和解链曲线分析策略来筛选引物。初始筛选结果显示在图1中。对于该特定筛选，每个反应使用约250个拷贝的灰葡萄孢菌基因组DNA。

R1F1和R1F3引物对显示强的扩增和良好的敏感性。在生物分析器上分析R1F1和R1F3引物对的产物。使用这些引物对的RPA反应显示：在电泳图中有预期大小的单个扩增子的产生。R1F1引物对的特异性和敏感性进一步通过在生物分析器上的系列稀释和反应产物的分析来表征。较低敏感性的引物对R1F6也以类似的方式进一步表征(见图2A和图2B)

R1F1引物对显示出比R1F6引物对显著更好的敏感性。R1F1引物对在5个基因组拷贝中显示出希望的扩增子的显著扩增。R1F6引物对仅在100个基因组拷贝或更高时显示出可比较的扩增。

这些实验结果证明可以产生对相同靶标具有不同敏感性的引物对。如图3所示，该引物对R1F1可用于检测浓度低至5-10个拷贝下的葡萄孢菌基因组DNA，而R1F6引物对可用于检测大于100个拷贝。

实例4-用于在草莓花萼上检测灰葡萄孢菌的体内实验

选择草莓的花萼用于体内实验以检测灰葡萄孢菌。因此，手工除去花萼，然后通过研磨或刮擦在塑料袋内部进行均质化。在均质化之前，可以将花萼样品掺入葡萄孢菌孢子、葡萄孢菌基因组DNA或水。对于一些样品，在均质化前将约5-10毫克的葡萄孢菌孢子添加到花萼中。在塑料袋中均质化后，将1微升的花萼匀浆转移到50微升的RPA预混合液[含有至少一个引物对(例如R1F1)和RPA碱性缓冲液]中。将反应在三十九摄氏度下孵育二十分钟，并且然后在生物分析器上分析产物。花萼匀浆出现绿色并且非常黏的材料。

生物分析器结果显示掺入葡萄孢菌孢子或葡萄孢菌基因组DNA的样品的阳性信号。阴性对照反应(其仅含有RPA混合物，并且没有添加含任何花萼)显示没有扩增的迹象。没有掺入葡萄孢菌的一些花萼样品显示出希望的扩增子，这表明了这些样品已经感染了葡萄孢菌。花萼#2与阴性对照紧密匹配，这表明了草莓未被感染。仅含有葡萄孢菌孢子而无花萼的阳性对照显示出希望的扩增子的强扩增。

序列表

SEQ ID NO:1 BC_靶标1_41-45个_匹配_/_基因组

AGGAAAGGATAGTGTGTGAACGGAGTGAATAACTTCAATTCAATTACCACTGTAATATAGCAACTATAATAAAGCCCTAAGCGAATGCGAAAGAGAGTAGCTCTTTCTGTAAGCCTTTATAAGGCTTACTACTTTCGATACGTAGCTAGCTCTTTAGACAGAATACAATTAGACATACAGGACCTACGATATTCGTGGGTGCTACGTCTTCCGTATCCTTCTCGTACCAACAGATAGTGAGGTTG

SEQ ID NO:2 BC_靶标7_20-25个_匹配_/_基因组

TGTTACGACGGATTAGTAACAGGCTGTAGAATCACCAACGTATAGGCTATAATGGTATTATAGGCCTCAGTGATTCAGCTGCAGTATACCGGGGGATACTAGGCATCCAAGGAAAGCCTTAGGTATATATATAGTATTAATTATAGAATATTCTAAAAGTATAGGATACAGTTTTTAGA

SEQ ID NO:3 BC_靶标3_38-40个_匹配_/_基因组_5S_核糖体_RNA

TCTGACACATACGACCATAGACTGAAGAGAATTGGGCATCCCGTCCGCTCTGCCATACACAAGCTTCAGATCGGTGGATTAGTAGTTGGGTGGGTGACCACCAGCGAATCCCCACTGTTGTATGTTTCTTTTC

SEQ ID NO:4 BC_靶标4_20-21个_匹配_/_基因组

AATTTAGAACTGTTGGTTTCACCATGGGGATGGTGAATTCAATATAGTACTATGGTTCACACTGTTGTAATATTGCTTAAGGTTCTAAAAGCTAAGACTACGAAACGTATTGCTGTAGTGCCGAAAGGCGCTAGCACAAGCGCTAGCACGGTCACATGATCACTATCCCGACAAGAACCATCACTGTCCTCACA

SEQ ID NO:5 BC_靶标5_4-20个_匹配_/_基因组

TAAGTTGAGTACCCCACTTTCGGACCACCCCTCTTTTGGACCACCTAAAAATATATATATATATGAATTTTAAACTTCAATAACTCAACCACTATTCAACTTCAATACAATCCCCTGTAGTGTCAGTTTCATAAATACTATCAGAGTCTTTTATCTCAATTTCCCGATCACCAGCTTCAATTTGAGCTTGATATATAGCTTCTATCCCTGCAAACCTCGAATTTGGACTAGTTTTTACCATCCTTCTTTTTTTAGGTATAATCTCTTCTAATTTTTGCTCCAATTGCTTTATTCGTTTCTTGGACTGTACAAGTTCATAGTCCTTAGCATCAAATCCTTTTTGAATCTTTCGAAAAAGCAGCCGGCGAGTTGGAATATCGGTCTCATCAACTTTCTCCATTATATCAGCATATTTTCGAATATCACTTCCTTTTTGAGGGGTTTTCCATGCAATAAAAGATGAATGTATTTCCTCCAT

SEQ ID NO:6 BC_靶标6_5-24个_匹配_/_基因组

TAAGTTGAGTACCCCACTTTCGGACCACCCCTCTTTTGGACCACCTAAAATCTTACCCCATTTTAAGCACTACCTCCCAACTTCATCTTTAATAAATCAACAACCACATATTCAATTGATATAAGATTTTAATATATTATCAATTAAGCTATAACAAAGCCTTATACTGAAGATAATATTGCTGCAGCACTTTTTGCAATTGCAGAAGGCATGTCTATATATAAGGCTTACTCAGAATATGATATTCCCCACACCACTTTATACAACTATATAAATAGCCACCTTTCACATAAAAAAGATACACAAAACCTATAGAAGATAGCTCCTATATAGGAGAGAGCTTTAGCAAATTGGATTTTAATACAGAAAGCCCTAAAAACTAGCCCTATCTATTATCAAATACAAAAATTAGGAAAGTCCATTCTCAACCTCGAAAGAGATGATTTATTTTTGAACAAGCGATGGATATATAGTTTTTTGAAAAGAAACCTAGAAATTAAAACTAAAAGGCAATATAAAATCAATAATGCCTATATCAATAATACAATTACCAAAATTATAAGCAAGTTCTTTGAAAAATTAGATTTACTAAC

SEQ ID NO:7 BC_靶标8_8-18个_匹配_/_基因组

AGGGTTGGCTTGTGTCACGGCGCCAACTACATGTTCTGTAGTTGCCTTCGTGCCTTAGGCACGGACTACTAGCGTGCCCTGCTTCCTATAAGTAGGGCCTCACTCTTCCATAGCTCTTCCACCCTTATGGTACAATATACGTCTTTACCCGTGCCTTGACAGTTTGTACCATCTT

SEQ ID NO:8 BC_靶标9_13-18个_匹配_/_基因组

TAATAATTTAATCTTCTTATTGTAAAAGAGTAGAAGGTGGTAATGGTCACACAAGAAAAGCCTTCGCATATATCAAGCATAGAGCAAGTGGCTACACGTAGTAAAATGGGGTGAATCACTATATTGCGATAGCGAGGTGAGGGAGGCGGTAAGAGCTGGGCACTCAATTCTTCAGGAGACAACTTTAGAAGGTAGAAAATTCGATGATATTTTTAGGTCTACAGAAGTGAAGCTATAAATACTAAATGTTGATAACACGTGATCCCAGAGTCACGTGTTTTCACTCTCACATTATCGATTGGAA

SEQ ID NO:9 BC_靶标10_26-27个_匹配_/_基因组

ATCACTCACTTACTTCACTTTCAATTTATTCTTCAATCAGAAGCTTTACCACTATACCATGCCATACAGATTGTACTATTTATATACATTATCTACCTAGCTTTGATTTATATATTCATATTCAATTCAATTACTAATCGAATTCAATATAAATAAAGTATTCATCATCTTAAACTAGAATTCAAGAATTTCACTAAGTCCCTTTGGAATAAAAATTTCTAATCATTTACAAAAGAAAAAGCCCCCTAATCAATACTTTAAAAACGCTTTTTTCAATACATTATAAAAATATTGAATATTTTCTGGGGCTGATAAAGCGGCCACTTCGTCAATCGCGGATTCTGCCACCACAGGGGGTATATATACTAC

SEQ ID NO:10 BC_靶标11_8-14个_匹配_/_基因组

GGTTTATCAGATCAGTGAGTGGGTCATATCAGTGAATGGGTCATTTGAAAATACATCAAAATTAGGCCTTTTTCAATATTCATATTTTAATAGCTAATCATTATTTTGAAAAAAGAAAAGAATTTTCAATAACAATAAGAAATTAGCTTCTTATAAATTTAGTTTTTTTTAT

SEQ ID NO:11 BC_IGS_1

TGGTTCGACTGTAGTCCCTAGGAACGCCCTCTGAGTGTCCTAGGAATGCCCCCGGTGAGCCCTTGGTCTAAAGCCGTATAGGTGACTAGTTAACCCCATATAGTTTGTGCGAGTACACACACTACTACCGGTGAGCAGGCTGTAATTTCAATGTGCAGAATCTGTCCCCGGTGAGCGCAGGTCACCTTGCAATGAGTGGACAGCATGTTTGAAATGCGATTAATTGTTGCTCCCGGTGAGCCCACTAAATAATTCTGGGAGTTGGCCATCTCATATTTCATCCCCGGTGAGCCCAAGATA

SEQ ID NO:12 BC_微管蛋白基因

ACATCAGATATCTATTCCTCGCCCTCAATTGGGACCTCCTCTTCGTACTCCTCCTCTCCCTCAGAGATCGAGGCATCCTGGTATTGTTGATACTCGGAAACCAAATCGTTCATGTTGGACTCAGCCTCAGTGAACTCCATCTCGTCCATACCTTCACCAGTGTACCAATGCAAGAAAGCCTTTCTTCTGAACATAGCAGTGAATTGATCACCGACACGCTTGAAAAGTTCTTGGATGGATGTCGAGTTACCAACGAAGGTGGAGGACATCTTGAGACCACGGGGAGGAATGGAGCAAAGGGCGGTTTGGACGTTGTTAGGGATCCACTCAACGAAGTAGGATGAGTTCTTGTTTTGGACGTTGCGCATTTGGTCCTCAACCTCCTTCATGGAAACCTTACCACGGCTACAGAAAGTTAGTTTCTACAAGATTTTGGCAGATTGATTACAGGGCAAACTTACAAAATGGCAGAGCATGTCAAGTAACGACCGTTACGGAAATCGGAAGCGGCCATCATGTTCTTAGGGTCGTACATTTGTTGAGTCAACTCTGGAACGGTGACAGCACGGAAAGAGTGTGCGCCACGACTGGTCAAAGGAGCAAATCCAACCATGAAGAAATGGAGACGGGGGAATGGAACCATGTTAACAGCCAACTTTCGGAGATCTGAGTTAAGTTGACCAGGGAAACGGAGACAGGTGGTAACACCGGACATGACGGCGGAAACCAAGTGGTTAAGATCTCCGTAAGATGGGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCATGCAAATATCGTAAAGAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTCGCGTCAGAGTTCTCAACCAATTGATGGACAGAGAGAGTTGCGTTATATGGCTCGACAACGGTATCGGAAACCTTTGGCGATGGGACGACGGAGAAGGTAGCCATCATACG

SEQ ID NO:13 BC_角质酶

AAAAGAATCTCAACTTAAATGGAAATTCATTCTGAGCTGATACTCGTTGCCGTCACATAAAATATAAAGTGATTGACATCGAGAAAGTTTCTCAATCTACCTAGTTTGCATCGCTTTGAGCAACTCATCACTCCGGCTCGGCAGATGTTAGCTCGAATGAAAGATTTGATGGTAGGCTTTCCTGTCGAATTTGCCAGTTGAATTTGCCAGTATGGTGTGAATGCGCTGTATGTTCTAGCGACGCCTAATACTAGATGTCTAAGATGTCTAGTAGTAGCTCGACGCCGTGACATGCCGTCACCATGAAATTTGCTGAGTTTGGTTGTATAAAGAAGAGGGAAAGGAATGAAAACCAATACACGGAGAGAAATAGTATAAAGATTGGATTGAATGGAAAGTGTTTACTTCCTCTGCGTTAACTCTAGTTTCCGGATAGTACCGCGGGATCTTGCTGGGCAGGCATGAGCTATGTGGAGCTTCAAGCTTTCTCAATATGGGGTAGCCTTATGTCCCTTCCCTTGTCCTTGCTGTCGATCTCACCATTTTCCATTTCTCTTCACCTCTTTCTCCTCCGTGATTCAACCACACCTCTTAGAATCTTTAATGCCTCGGCAGTTGAAGACATACACGGGCCTCGTCAATTATCGCACATTGTACTACTCACCAACTTAATGAAATACTGGCATCTAAACACGGTATTCAAAAGATGCGAGATGTACAGACAGACACTCGCAGGTCATGACAAATTCCCCGTCGGACTTCCACATTGGAATTTTGAGAGTCCAAGCAAAAAAGTTACAATGGTGTTATGTTGCATCACAATCAAATCTTCCTTACTTTTTCTCCACACAGCCACCACCATCCTCCTTATGCTTCTTTCATCCTTAACGTTTCAAAAAGTCGGATTCATCTGAAAAAGTT

SEQ ID NO:14 BC靶标1_F1

CCTAAGCGAATGCGAAAGAG

SEQ ID NO:15 BC靶标1_R1

CGAGAAGGATACGGAAGACG

SEQ ID NO:16 BC_靶标7_F1

CAGGCTGTAGAATCACCAACG

SEQ ID NO:17 BC_靶标7_R1

CTAAGGCTTTCCTTGGATGC

SEQ ID NO:18 BC_靶标3_F1

CTGAAGAGAATTGGGCATCC

SEQ ID NO:19 BC_靶标3_R1

CATACAACAGTGGGGATTCG

SEQ ID NO:20 BC_靶标4_F1

CACCATGGGGATGGTGAAT

SEQ ID NO:21 BC_靶标4_R1

TTCGGCACTACAGCAATACG

SEQ ID NO:22 BC_靶标5_F1

CCCTCTTTTGGACCACCTAA

SEQ ID NO:23 BC_靶标5_R1

CTGGTGATCGGGAAATTGAG

SEQ ID NO:24 BC_靶标6_F1

AAGCACTACCTCCCAACTTCA

SEQ ID NO:25 BC_靶标6_R1

GCAATTGCAAAAAGTGCTG

SEQ ID NO:26 BC_靶标8_F1

CTACTAGCGTGCCCTGCTTC

SEQ ID NO:27 BC_靶标8_R1

AAGGCACGGGTAAAGACGTA

SEQ ID NO:28 BC_靶标9_F1

CATAGAGCAAGTGGCTACACG

SEQ ID NO:29 BC_靶标9_R1

TTGAGTGCCCAGCTCTTACC

SEQ ID NO:30 靶标1_TDX_1F

AAGCCCTAAGCGAATGCGAAAGAGACTAGCTCTTT

SEQ ID NO:31 靶标1_TDX_2F

TARTAAAGCCCTAAGCGAATGCGAAAGAGACTAGC

SEQ ID NO:32 靶标1_TDX_3F

WACTGTARTAAAGCCCTAAGCGAATGCGAAAGAGA

SEQ ID NO:33 靶标1_TDX_4F

ATAGCWACTGTARTAAAGCCCTAAGCGAATGCGAA

SEQ ID NO:34 靶标1_TDX_5F

GTAATATAGCWACTGTARTAAAGCCCTAAGCGAAT

SEQ ID NO:35 靶标1_TDX_6F

CCACTGTAATATAGCWACTGTARTAAAGCCCTAAG

SEQ ID NO:36 靶标1_TDX_7F

AATTACCACTGTAATATAGCWACTGTARTAAAGCC

SEQ ID NO:37 靶标1_TDX_8F

AATTCAATTACCACTGTAATATAGCWACTGTARTAA

SEQ ID NO:38 靶标1_TDX_1R

GTTGGTACGAGAAGGATACGGAAGACGTAGCACCC

SEQ ID NO:39 靶标1_TDX_2R

TACGAGAAGGATACGGAAGACGTAGCACCCACGAA

SEQ ID NO:40 靶标1_TDX_3R

GAAGGATACGGAAGACGTAGCACCCACGAATWKCG

SEQ ID NO:41 靶标1_TDX_4R

ATACGGAAGACGTAGCACCCACGAATWKCGTAGGT

SEQ ID NO:42 靶标1_TDX_5R

GAAGACGTAGCACCCACGAATWKCGTAGGTCCTGT

SEQ ID NO:43 靶标1_TDX_6R

CGTAGCACCCACGAATWKCGTAGGTCCTGTATGTC

SEQ ID NO:44 靶标1_TDX_7R

CACCCACGAATWKCGTAGGTCCTGTATGTCTAATT

SEQ ID NO:45 靶标1_TDX_8R

ACGAATWKCGTAGGTCCTGTATGTCTAATTGTATT

SEQ ID NO:46 核糖体_IGS_TDx_1F

CGGTGAGCAGGCTGTAATTTCAATGTGCAGAATCT

SEQ ID NO:47 核糖体_IGS_TDx_2F

ACTACCGGTGAGCAGGCTGTAATTTCAATGTGCAG

SEQ ID NO:48 核糖体_IGS_TDx_3F

ACACTACTACCGGTGAGCAGGCTGTAATTTCAATG

SEQ ID NO:49 核糖体_IGS_TDx_4F

TACACACACTACTACCGGTGAGCAGGCTGTAATTT

SEQ ID NO:50 核糖体_IGS_TDx_5F

GCGAGTACACACACTACTACCGGTGAGCAGGCTGT

SEQ ID NO:51 核糖体_IGS_TDx_6F

TTTGTGCGAGTACACACACTACTACCGGTGAGCAG

SEQ ID NO:52 核糖体_IGS_TDx_7F

TATAGTTTGTGCGAGTACACACACTACTACCGGTG

SEQ ID NO:53 核糖体_IGS_TDx_8F

CCCCATATAGTTTGTGCGAGTACACACACTACTAC

SEQ ID NO:54 核糖体_IGS_TDx_1R

GTGGGCTCACCGGGAGCAACAATTAATCGCATTTC

SEQ ID NO:55 核糖体_IGS_TDx_2R

ATTTAGTGGGCTCACCGGGAGCAACAATTAATCGC

SEQ ID NO:56 核糖体_IGS_TDx_3R

GAATTATTTAGTGGGCTCACCGGGAGCAACAATTA

SEQ ID NO:57 核糖体_IGS_TDx_4R

TCCCAGAATTATTTAGTGGGCTCACCGGGAGCAAC

SEQ ID NO:58 核糖体_IGS_TDx_5R

CCAACTCCCAGAATTATTTAGTGGGCTCACCGGGA

SEQ ID NO:59 核糖体_IGS_TDx_6R

GATGGCCAACTCCCAGAATTATTTAGTGGGCTCAC

SEQ ID NO:60 核糖体_IGS_TDx_7R

TATGAGATGGCCAACTCCCAGAATTATTTAGTGGG

SEQ ID NO:61 核糖体_IGS_TDx_8R

TGAAATATGAGATGGCCAACTCCCAGAATTATTTA

序列表

<110> 阿格洛法士公司（Agrofresh Inc.）

W·T·比森四世（BEESON, William T. IV）

D·麦克莱恩（MACLEAN, Daniel）

C·科恩（COEN, Christina）

<120> 用于对肉类、植物或植物部分进行病原体检测和病害治理的方法

<130> 67766-242181

<150> 62/049080

<151> 2014-09-11

<160> 61

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 245

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标1_41-45个_匹配_/_基因组

<400> 1

aggaaaggat agtgtgtgaa cggagtgaat aacttcaatt caattaccac tgtaatatag 60

caactataat aaagccctaa gcgaatgcga aagagagtag ctctttctgt aagcctttat 120

aaggcttact actttcgata cgtagctagc tctttagaca gaatacaatt agacatacag 180

gacctacgat attcgtgggt gctacgtctt ccgtatcctt ctcgtaccaa cagatagtga 240

ggttg 245

<210> 2

<211> 179

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标7_20-25个_匹配_/_基因组

<400> 2

tgttacgacg gattagtaac aggctgtaga atcaccaacg tataggctat aatggtatta 60

taggcctcag tgattcagct gcagtatacc gggggatact aggcatccaa ggaaagcctt 120

aggtatatat atagtattaa ttatagaata ttctaaaagt ataggataca gtttttaga 179

<210> 3

<211> 133

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标3_38-40个_匹配_/_基因组_5S_核糖体_RNA

<400> 3

tctgacacat acgaccatag actgaagaga attgggcatc ccgtccgctc tgccatacac 60

aagcttcaga tcggtggatt agtagttggg tgggtgacca ccagcgaatc cccactgttg 120

tatgtttctt ttc 133

<210> 4

<211> 194

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标4_20-21个_匹配_/_基因组

<400> 4

aatttagaac tgttggtttc accatgggga tggtgaattc aatatagtac tatggttcac 60

actgttgtaa tattgcttaa ggttctaaaa gctaagacta cgaaacgtat tgctgtagtg 120

ccgaaaggcg ctagcacaag cgctagcacg gtcacatgat cactatcccg acaagaacca 180

tcactgtcct caca 194

<210> 5

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标5_4-20个_匹配_/_基因组

<400> 5

taagttgagt accccacttt cggaccaccc ctcttttgga ccacctaaaa atatatatat 60

atatgaattt taaacttcaa taactcaacc actattcaac ttcaatacaa tcccctgtag 120

tgtcagtttc ataaatacta tcagagtctt ttatctcaat ttcccgatca ccagcttcaa 180

tttgagcttg atatatagct tctatccctg caaacctcga atttggacta gtttttacca 240

tccttctttt tttaggtata atctcttcta atttttgctc caattgcttt attcgtttct 300

tggactgtac aagttcatag tccttagcat caaatccttt ttgaatcttt cgaaaaagca 360

gccggcgagt tggaatatcg gtctcatcaa ctttctccat tatatcagca tattttcgaa 420

tatcacttcc tttttgaggg gttttccatg caataaaaga tgaatgtatt tcctccat 478

<210> 6

<211> 593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标6_5-24个_匹配_/_基因组

<400> 6

taagttgagt accccacttt cggaccaccc ctcttttgga ccacctaaaa tcttacccca 60

ttttaagcac tacctcccaa cttcatcttt aataaatcaa caaccacata ttcaattgat 120

ataagatttt aatatattat caattaagct ataacaaagc cttatactga agataatatt 180

gctgcagcac tttttgcaat tgcagaaggc atgtctatat ataaggctta ctcagaatat 240

gatattcccc acaccacttt atacaactat ataaatagcc acctttcaca taaaaaagat 300

acacaaaacc tatagaagat agctcctata taggagagag ctttagcaaa ttggatttta 360

atacagaaag ccctaaaaac tagccctatc tattatcaaa tacaaaaatt aggaaagtcc 420

attctcaacc tcgaaagaga tgatttattt ttgaacaagc gatggatata tagttttttg 480

aaaagaaacc tagaaattaa aactaaaagg caatataaaa tcaataatgc ctatatcaat 540

aatacaatta ccaaaattat aagcaagttc tttgaaaaat tagatttact aac 593

<210> 7

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标8_8-18个_匹配_/_基因组

<400> 7

agggttggct tgtgtcacgg cgccaactac atgttctgta gttgccttcg tgccttaggc 60

acggactact agcgtgccct gcttcctata agtagggcct cactcttcca tagctcttcc 120

acccttatgg tacaatatac gtctttaccc gtgccttgac agtttgtacc atctt 175

<210> 8

<211> 304

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标9_13-18个_匹配_/_基因组

<400> 8

taataattta atcttcttat tgtaaaagag tagaaggtgg taatggtcac acaagaaaag 60

ccttcgcata tatcaagcat agagcaagtg gctacacgta gtaaaatggg gtgaatcact 120

atattgcgat agcgaggtga gggaggcggt aagagctggg cactcaattc ttcaggagac 180

aactttagaa ggtagaaaat tcgatgatat ttttaggtct acagaagtga agctataaat 240

actaaatgtt gataacacgt gatcccagag tcacgtgttt tcactctcac attatcgatt 300

ggaa 304

<210> 9

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标10_26-27个_匹配_/_基因组

<400> 9

atcactcact tacttcactt tcaatttatt cttcaatcag aagctttacc actataccat 60

gccatacaga ttgtactatt tatatacatt atctacctag ctttgattta tatattcata 120

ttcaattcaa ttactaatcg aattcaatat aaataaagta ttcatcatct taaactagaa 180

ttcaagaatt tcactaagtc cctttggaat aaaaatttct aatcatttac aaaagaaaaa 240

gccccctaat caatacttta aaaacgcttt tttcaataca ttataaaaat attgaatatt 300

ttctggggct gataaagcgg ccacttcgtc aatcgcggat tctgccacca cagggggtat 360

atatactac 369

<210> 10

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标11_8-14个_匹配_/_基因组

<400> 10

ggtttatcag atcagtgagt gggtcatatc agtgaatggg tcatttgaaa atacatcaaa 60

attaggcctt tttcaatatt catattttaa tagctaatca ttattttgaa aaaagaaaag 120

aattttcaat aacaataaga aattagcttc ttataaattt agtttttttt at 172

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_IGS_1

<400> 11

tggttcgact gtagtcccta ggaacgccct ctgagtgtcc taggaatgcc cccggtgagc 60

ccttggtcta aagccgtata ggtgactagt taaccccata tagtttgtgc gagtacacac 120

actactaccg gtgagcaggc tgtaatttca atgtgcagaa tctgtccccg gtgagcgcag 180

gtcaccttgc aatgagtgga cagcatgttt gaaatgcgat taattgttgc tcccggtgag 240

cccactaaat aattctggga gttggccatc tcatatttca tccccggtga gcccaagata 300

<210> 12

<211> 928

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_微管蛋白基因

<400> 12

acatcagata tctattcctc gccctcaatt gggacctcct cttcgtactc ctcctctccc 60

tcagagatcg aggcatcctg gtattgttga tactcggaaa ccaaatcgtt catgttggac 120

tcagcctcag tgaactccat ctcgtccata ccttcaccag tgtaccaatg caagaaagcc 180

tttcttctga acatagcagt gaattgatca ccgacacgct tgaaaagttc ttggatggat 240

gtcgagttac caacgaaggt ggaggacatc ttgagaccac ggggaggaat ggagcaaagg 300

gcggtttgga cgttgttagg gatccactca acgaagtagg atgagttctt gttttggacg 360

ttgcgcattt ggtcctcaac ctccttcatg gaaaccttac cacggctaca gaaagttagt 420

ttctacaaga ttttggcaga ttgattacag ggcaaactta caaaatggca gagcatgtca 480

agtaacgacc gttacggaaa tcggaagcgg ccatcatgtt cttagggtcg tacatttgtt 540

gagtcaactc tggaacggtg acagcacgga aagagtgtgc gccacgactg gtcaaaggag 600

caaatccaac catgaagaaa tggagacggg ggaatggaac catgttaaca gccaactttc 660

ggagatctga gttaagttga ccagggaaac ggagacaggt ggtaacaccg gacatgacgg 720

cggaaaccaa gtggttaaga tctccgtaag atgggttgct gagcttcaag gttctcatgc 780

aaatatcgta aagagcctcg ttatcgatac agaaggtcgc gtcagagttc tcaaccaatt 840

gatggacaga gagagttgcg ttatatggct cgacaacggt atcggaaacc tttggcgatg 900

ggacgacgga gaaggtagcc atcatacg 928

<210> 13

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_角质酶

<400> 13

aaaagaatct caacttaaat ggaaattcat tctgagctga tactcgttgc cgtcacataa 60

aatataaagt gattgacatc gagaaagttt ctcaatctac ctagtttgca tcgctttgag 120

caactcatca ctccggctcg gcagatgtta gctcgaatga aagatttgat ggtaggcttt 180

cctgtcgaat ttgccagttg aatttgccag tatggtgtga atgcgctgta tgttctagcg 240

acgcctaata ctagatgtct aagatgtcta gtagtagctc gacgccgtga catgccgtca 300

ccatgaaatt tgctgagttt ggttgtataa agaagaggga aaggaatgaa aaccaataca 360

cggagagaaa tagtataaag attggattga atggaaagtg tttacttcct ctgcgttaac 420

tctagtttcc ggatagtacc gcgggatctt gctgggcagg catgagctat gtggagcttc 480

aagctttctc aatatggggt agccttatgt cccttccctt gtccttgctg tcgatctcac 540

cattttccat ttctcttcac ctctttctcc tccgtgattc aaccacacct cttagaatct 600

ttaatgcctc ggcagttgaa gacatacacg ggcctcgtca attatcgcac attgtactac 660

tcaccaactt aatgaaatac tggcatctaa acacggtatt caaaagatgc gagatgtaca 720

gacagacact cgcaggtcat gacaaattcc ccgtcggact tccacattgg aattttgaga 780

gtccaagcaa aaaagttaca atggtgttat gttgcatcac aatcaaatct tccttacttt 840

ttctccacac agccaccacc atcctcctta tgcttctttc atccttaacg tttcaaaaag 900

tcggattcat ctgaaaaagt t 921

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标1_F1

<400> 14

cctaagcgaa tgcgaaagag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标1_R1

<400> 15

cgagaaggat acggaagacg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标7_F1

<400> 16

caggctgtag aatcaccaac g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标7_R1

<400> 17

ctaaggcttt ccttggatgc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标3_F1

<400> 18

ctgaagagaa ttgggcatcc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标3_R1

<400> 19

catacaacag tggggattcg 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标4_F1

<400> 20

caccatgggg atggtgaat 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标4_R1

<400> 21

ttcggcacta cagcaatacg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标5_F1

<400> 22

ccctcttttg gaccacctaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标5_R1

<400> 23

ctggtgatcg ggaaattgag 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标6_F1

<400> 24

aagcactacc tcccaacttc a 21

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标6_R1

<400> 25

gcaattgcaa aaagtgctg 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标8_F1

<400> 26

ctactagcgt gccctgcttc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标8_R1

<400> 27

aaggcacggg taaagacgta 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标9_F1

<400> 28

catagagcaa gtggctacac g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BC_靶标9_R1

<400> 29

ttgagtgccc agctcttacc 20

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_1F

<400> 30

aagccctaag cgaatgcgaa agagactagc tcttt 35

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_2F

<400> 31

tartaaagcc ctaagcgaat gcgaaagaga ctagc 35

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_3F

<400> 32

wactgtarta aagccctaag cgaatgcgaa agaga 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_4F

<400> 33

atagcwactg tartaaagcc ctaagcgaat gcgaa 35

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_5F

<400> 34

gtaatatagc wactgtarta aagccctaag cgaat 35

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_6F

<400> 35

ccactgtaat atagcwactg tartaaagcc ctaag 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_7F

<400> 36

aattaccact gtaatatagc wactgtarta aagcc 35

<210> 37

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_8F

<400> 37

aattcaatta ccactgtaat atagcwactg tartaa 36

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_1R

<400> 38

gttggtacga gaaggatacg gaagacgtag caccc 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_2R

<400> 39

tacgagaagg atacggaaga cgtagcaccc acgaa 35

<210> 40

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_3R

<400> 40

gaaggatacg gaagacgtag cacccacgaa twkcg 35

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_4R

<400> 41

atacggaaga cgtagcaccc acgaatwkcg taggt 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_5R

<400> 42

gaagacgtag cacccacgaa twkcgtaggt cctgt 35

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_6R

<400> 43

cgtagcaccc acgaatwkcg taggtcctgt atgtc 35

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_7R

<400> 44

cacccacgaa twkcgtaggt cctgtatgtc taatt 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶标1_TDX_8R

<400> 45

acgaatwkcg taggtcctgt atgtctaatt gtatt 35

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_1F

<400> 46

cggtgagcag gctgtaattt caatgtgcag aatct 35

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_2F

<400> 47

actaccggtg agcaggctgt aatttcaatg tgcag 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_3F

<400> 48

acactactac cggtgagcag gctgtaattt caatg 35

<210> 49

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_4F

<400> 49

tacacacact actaccggtg agcaggctgt aattt 35

<210> 50

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_5F

<400> 50

gcgagtacac acactactac cggtgagcag gctgt 35

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_6F

<400> 51

tttgtgcgag tacacacact actaccggtg agcag 35

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_7F

<400> 52

tatagtttgt gcgagtacac acactactac cggtg 35

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_8F

<400> 53

ccccatatag tttgtgcgag tacacacact actac 35

<210> 54

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_1R

<400> 54

gtgggctcac cgggagcaac aattaatcgc atttc 35

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_2R

<400> 55

atttagtggg ctcaccggga gcaacaatta atcgc 35

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_3R

<400> 56

gaattattta gtgggctcac cgggagcaac aatta 35

<210> 57

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_4R

<400> 57

tcccagaatt atttagtggg ctcaccggga gcaac 35

<210> 58

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_5R

<400> 58

ccaactccca gaattattta gtgggctcac cggga 35

<210> 59

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_6R

<400> 59

gatggccaac tcccagaatt atttagtggg ctcac 35

<210> 60

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_7R

<400> 60

tatgagatgg ccaactccca gaattattta gtggg 35

<210> 61

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核糖体_IGS_TDx_8R

<400> 61

tgaaatatga gatggccaac tcccagaatt attta 35