源自基于龙舌兰的烈酒的能量饮品和其他营养辅助物的制作方法

相关申请

本申请要求2014年9月16日提交的美国临时申请序列号62/071,179和2015年7月10日提交的美国临时申请序列号62/231,592的权益，这些申请的内容以引用的方式整体纳入本发明。

本发明涉及基于龙舌兰的烈酒，特别是各种特奎拉龙占兰酒(tequila)的非酒精版本，其可用于通过这些饮品中所含单胺氧化酶(mao)抑制剂来治疗多种疾病。

背景技术：

有大量的关于来自龙占兰蒸馏烈酒的制备的文献。例如，在《特奎拉龙舌兰酒加工和风味》(tequilaprocessingandflavor)，pedroa.vazquez-landaverde和miriamg.rodriguez-olvera，centrodeinvestigaciónencienciaaplicadaytecnologfaavanzadadelinstitutopolitécniconacionalunidadquerretaro，cerroblanco141colinasdelcimatario，queretaro，qro.，mexico76090；2012americanchemicalsociety；万维网上//pubs.acs.org，公开日期(网络)2012年7月16日|doi：10.1021|bk-2012-1104.ch015在葡萄酒和其他酒精类饮料“flavorchemistryofwineandotheralcoholicbeverages”中qian，m.，等；acssymposiumseries；americanchemicalsociety：washington，dc，2012，中提供了从龙舌兰仙人掌制备特奎拉龙舌兰酒的详细描述，其对处理龙舌兰原料、发酵、蒸馏和陈化描述的公开内容通过引用的方式纳入本发明。简言之，龙舌兰仙人掌(agavecactus)的茎被加热以使得复合糖水解，并切碎和碾碎以释放糖浆。随后用水稀释糖浆以提供用于接种酵母的适合稀释液。发酵后，对发酵培养物进行蒸馏以获得馏出物。馏出物作为许多不同品牌的特奎拉龙舌兰酒售卖。然而，馏出物可以在包装和售卖前进行陈化。

上述参考来源中所示的具体描述如下：

将剥掉叶的成熟龙舌兰(称为“pifia”)切成两半，四分之一或更多，以易于在106-116℃在烘箱(48小时)或高压釜(12小时)中烘烤。这种热处理的目的是水解复合糖如菊粉和淀粉，获得葡萄糖和果糖以更容易发酵。糖主要导致乙醇形成，许多其他化合物来自该底物的发酵。通过pifias的热处理导致形成了化合物，主要是美拉德相关的，如呋喃，吡喃，醛，氮化合物和硫化合物。最丰富的美拉德化合物是甲基-2-糠酸酯，2，3-二羟基-3，5-二氢-6-甲基-4(h)-吡喃-4-酮和5-羟甲基糠醛。吡嗪也是来自美拉德反应的重要化合物组。发现最丰富的吡嗪是2，5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪。

在烘烤步骤期间产生其它热相关分解产物。在烘烤的pifias中已经发现短碳链和长碳链的游离脂肪酸，这可能是由于酰基甘油的水解，β-环卟啉和β-大马酮可能是类胡萝卜素的降解产物，而4-甲基-5-(2-羟乙基)-噻唑是氨基酸硫胺素的分解产物。像对甲酚和4-乙基苯酚的酚类是酚酸的分解产物。

一旦烘烤了pifias，将其移至破碎磨和碾碎机，在其中它们释放含高浓度糖和大部分化合物的所有糖浆。经常洗去所得的龙舌兰糊状物以改善糖的提取。

毫无疑问，发酵是龙舌兰加工中最重要和最复杂的阶段。以水稀释100％龙占兰或混合糖浆至达到12-14°brix(80-100g/l糖)。发酵在30℃的恒温罐中发生，但是有些过程在室温下进行，所述室温根据一年的季节可能会发生变化。发酵完全依赖酵母菌和较小程度上乳酸和乙酸细菌的代谢。在龙舌兰酱中已经发现许多酵母菌菌株，其中最重要的是酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和非洲克勒克酵母(kloeckeraafricana)。酵母菌代谢碳水化合物，氨基酸，脂肪酸和其他有机化合物，将其转化为乙醇，甘油，二氧化碳，并在较少程度上转化成醛，酮，高级醇，有机酸和酯，这被称为“发酵副产物”或“同类物”。通过酮酸(2-氧代酸)降解氨基酸形成高级醇，由于其类似麦芽口感和灼口的味道也称为“杂醇”。最重要的是1-丙醇，2-甲基-1-丙醇，2-甲基丁醇，3-甲基丁醇和2-苯基乙醇，后者具有类似玫瑰的香气。酵母细胞内的脂肪酸的合成主要形成具有偶数个数的4至18个碳原子的饱和直链脂肪酸，而具有奇数碳数和不饱和度的低水平脂肪酸的出现取决于发酵条件。脂肪酸可与醇结合形成酯。

发酵在30至35℃下进行18至24小时。35℃的处理温度比30℃产生更多的挥发性化合物。也已经观察到，在发酵期间补充氮源可以改变通过酵母菌导致的化合物形成，尽管效果根据所用的氮源而不同。通过加入20种氨基酸的混合物，非洲克勒克酵母(kloeckeraafricana)菌株k1能够产生和耐受较高的乙醇浓度，同时某些酯，醇，乙醛和α-松油醇的产生增加。当使用酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)时必须补充硫酸钠和氨基酸，戊醇和异丁醇的浓度降低，而丙醇和乙醛增加。

一旦发酵结束，醇含量达到约15％v/v，则是进行蒸馏的时间。将发酵的糊状物在铜釜或不锈钢釜中在78-80℃加热，从而实现酒精的蒸发。蒸气在冷却的盘管中冷凝，并收集馏出物。第一馏出物达到～25％v/v的酒精浓度，并且需要也称为精馏的第二次蒸馏，以达到～55％v/v的乙醇。然后用水将液体调节至38-40％v/v酒精。由于大多数化合物是挥发性的，因此在蒸馏期间其随乙醇一起蒸发。在蒸馏过程中可以分离不同的挥发物馏分或“分馏成分”。开头分馏成分包含高挥发性化合物，如乙醛和乙酸乙酯，而尾分馏成分则有较高沸点的化学物质，如长链脂肪酸的乙酯。由于这两个馏分都是不希望的，其可以与核心分馏成分分开。尽管甲醇沸点低，但是在尾分馏成分得到甲醇。在尾馏馏分中也蒸馏出乳酸乙酯，乙酸和糠醛。异丁基和异戊醇作为开头产物，在核心分馏成分中发现正丙醇，苯乙醇表现出尾分馏成分产物性质。

热在蒸馏期间对化合物产生起重要作用。因此，可能发生一些分解反应，发生醛，酮，呋喃，硫化合物，吡嗪和酚的形成。

用水调节至40％乙醇含量的精馏馏出物可以在橡木桶中陈化2个月至3年。醛蒸发和/或形成乙缩醛。通过在木桶中陈化，挥发性化合物如香草醛，愈创木酚，丁子香酚，甲酚和其它酚类物质从木材迁移到馏出物，从而使风味变得复杂。乙酸酯不仅在发酵过程中，而且也在陈化过程中形成。已有报道，酯可以随后在陈化过程中通过高浓度的脂肪酸与乙醇酯化而形成。

前面的描述在如上述参考文献中所发现。已经鉴定了由其制备的为龙舌兰提取物和/或烈酒成分的多种多样化合物；然而，根据申请人的知识，人们尚未理解通常作为特奎拉龙舌兰酒销售的或其他源自龙舌兰的饮料含有mao抑制活性。如已知的，mao抑制剂可用作情绪提升剂，抗抑郁药和各种其他疾病，包括帕金森病的治疗，由这些饮料的无酒精组分组成的非酒精“能量饮料”可用于这些上下文情况。

技术实现要素：

如上所述，本发明利用了由龙舌兰提取物制备的烈酒中mao抑制剂的存在。mao抑制剂可以最初存在于提取物中或在发酵期间形成或在蒸馏或陈化期间形成，以及上述情况的组合。特别地，申请人已经表明，通过施加真空来从这些商业上可获得的烈酒中除去酒精破坏了至少一些mao抑制活性。因此，本发明的组合物必须通过保留这些挥发性组分的方法从这些烈酒制备。这些方法包括反渗透，离心柱和其它不会导致挥发性化合物损失的方法。

因此，在一个方面，本发明涉及通过对源自龙舌兰的酒精饮料施以反渗透或其它保留挥发性组分的方法来制备的组合物。在一个实施方式中，源自龙占兰的酒精饮料已通过以下方式制备：加热龙舌兰仙人掌的茎以使得复合糖水解；切碎和碾碎加热的茎以释放糖浆；用水将所述糖浆稀释至12-14brix水平并接种酵母菌；对接种后的稀释糖浆进行发酵以获得发酵产物；蒸馏发酵产物以获得馏出物。

本发明也涉及通过给需要该治疗的对象施用有效量的本发明组合物来治疗以mao过度活动为特征的病症的方法。这在抑郁症或帕金森病的情况下尤为重要。

此外，本发明涉及在乙醇存在下检测mao抑制活性的方法。显著量的乙醇会干扰该检测。因此，不考虑酒精存在的标准检测将提供误导的结果。

因此，在另一方面，本发明涉及在乙醇存在下检测mao抑制剂的方法，该方法包括向检测中中加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和乙醇脱氢酶。更详细来说，该检测包括向待分析的样品中加入底物有效量的犬尿胺二氢溴酸盐以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和乙醇脱氢酶；加入maoa或maob；在37℃下孵育：用强碱终止反应并以310nm的激发波长和405nm的发射波长评估结果。

附图说明

图1显示了按以标准商业检测试剂盒评估的，不同年数的特奎拉龙舌兰酒中mao抑制活性的评估结果。

图2显示了使用犬尿胺作为底物评估各种品牌和年数特奎拉龙舌兰酒的mao抑制活性的结果。

图3显示了将特奎拉龙舌兰酒分离成各种馏分后，使用犬尿胺作为底物的mao抑制检测的结果。

图4是显示基于犬尿胺检测的各种柱馏分的mao抑制活性的图。

图5显示已施以反渗透的特奎拉龙舌兰酒样品中mao抑制检测的结果，并将浓缩物中的活性与滤液中的活性进行比较。

发明实施方式

由龙占兰植物提取物制成的酒精饮料的无酒精形式的是本发明的主题。这些酒精饮料包括普奎龙舌兰酒(pulque)，特奎拉龙舌兰酒，梅兹卡龙舌兰酒(mezcal)，索托龙舌兰酒(sotol)，巴卡诺拉龙舌兰酒(bacanora)或其他由源自龙舌兰植物的糖制成的发酵物。在本发明中，酒精在其它挥发性化合物被保留的条件下被除去。

这些组合物具有单胺氧化酶(mao)抑制性质，并由此可用作情绪提升剂，抗抑郁药或某些疾病如帕金森病的治疗。本发明还涉及通过在酒精存在下评估mao活性，分级和制备或混合不同提取物以选择所需生理刺激剂或抗抑郁作用以用作能量饮料和/或情绪提升剂的方法。在本发明的分级/评价工具方面，不同的基于龙舌兰的饮料接受每种形式的mao，a+b的单胺氧化酶(mao)抑制分级，其表示为相对于不存在抑制剂的对照物的抑制百分比。实施例6显示了对于梅兹卡龙舌兰酒(mescal)，特奎拉龙舌兰酒，巴卡诺拉龙舌兰酒，索托龙舌兰酒和奎普龙舌兰酒分级的实例。实施例7显示了当分析通过反渗透获得的馏分时的类似结果。

如本文所示，可以直接分析各种源自龙舌兰的饮料中其maoa和maob抑制剂的含量。这使得可以有评级系统，其中特定饮料的结果可以包括在标签上。例如，各种饮料可以在基于其与其他品牌相同饮料相比的含量的等级上来分级。评级可以是针对maoa和maob的抑制剂的组合或者独立地针对每种。因此，对于1-10的等级，10是最佳评级，1是最差，与相同检测中的竞争品牌所显示的40％抑制相比，显示80％的maoa抑制的饮料可以给予9，相比较低活性饮料为5。可以设计抑制与特定等级的相关性，以向消费者提供有帮助的信息。所使用的等级或所选择的评级当然不一定是1-10，而是可以任意选择其他等级，如a-f。

用于测量抑制百分比的mao检测法接受具有高浓度乙醇的样品。本发明的检测方法对于准确测量mao活性的抑制是必要的，并且必须耐受有大于40％乙醇的样品，其是待分级的对象样品的主要成分。蒸馏龙占兰烈酒通常遇到的酒精范围为普奎龙舌兰酒的6％到某些特奎拉龙占兰酒和梅兹卡龙舌兰酒的约60％，但更常见是会有40％酒精(80标准酒精度)的样品。由于某些(但不是全部)来自基于龙舌兰饮料的mao抑制剂的挥发性，特别重要的是不要在减压下或通过在大气压下蒸馏从样品中蒸发乙醇。

本发明的组合物可以用作食品添加剂和/或包含在食品或药物中，或用于治疗抑郁症，帕金森病或一般不适。组合物也可用作咖啡或脱咖啡因产品中的辅助剂或替代品。组合物可以与药学上或营养上可接受的两种或更多种载体，赋形剂和/或稀释剂混合。因此，一般来说，本发明的组合物可以包含在果汁或其他软饮料如可乐或水果味苏打水中，或者可以直接食用。组合物还可以包括在食品中，如未煮的液体，例如沙拉酱，并与沙拉的固体组分一起食用。要食用或施予受试者的组合物的量高度依赖于待治疗疾病性质以及被确定为组合物本身中的mao抑制剂的浓度。可用于各种医学适应症的mao抑制剂的水平是本领域已知的，并且可以遵循这些指南。对作为食品补充剂的用途，这是营养学家或其他从业者的判断问题。

因此，本发明包括含有本发明组合物的食品和饮料，本发明组合物的量能有效具有所需的生理效应。

从饮料起始材料中除去乙醇的一个成功的方法是反渗透(ro)。有大约100道尔顿分子量截留的ro膜将乙醇与微生物或蒸馏期间形成的mao的抑制剂或可能天然存在于起始材料中的抑制剂分离。在不使用真空或蒸馏的情况下完成mao抑制剂的分离。因此，本发明组合物可以例如通过用蒸馏水将0.75升特奎拉龙舌兰酒(或其他蒸馏龙舌兰饮料)稀释至7.5-75升的体积来制备，稀释体积取决于最终所需的乙醇浓度。例如，将0.75升80标准酒精度(40体积％酒精)的特奎拉龙舌兰酒稀释至7.5升，在该点稀释的物质为4体积％酒精。稀释的特奎拉龙舌兰酒在配有～100道尔顿分子量截留膜(tangentmembranes，inc.，romini)的反渗透单元中循环，其中稀释的材料被浓缩回0.75升的体积。通过将材料再次稀释至7.5升或更高体积并且继续通过ro单元循环来实现另外的乙醇减少。为了产生如根据本发明的能量饮品的组合物，可以继续进行稀释和随后的循环，直到产品被认为无酒精。随后活性mao抑制剂包含于浓缩的无酒精部分中，然后可以根据需要补充维生素，矿物质，氨基酸，蛋白质或咖啡因，并且可以如上所述包括在其它食品或饮品制品中。

在产生本发明的组合物中，重要的方面是某些mao抑制剂为挥发性化合物，并且如果通过加热蒸馏或在减压下蒸发乙醇来产生组合物，例如，会发生重要mao抑制剂的损失。

提供以下实施例来展示而不是限制本发明。

实施例1

使用市售检测来检测各种特奎拉龙占兰酒使用市售的mao活性试剂盒来测试不同的市售特奎拉龙舌兰酒s或梅兹卡龙舌兰酒，s1，s1dw，s2和s3的样品。该试剂盒购自西格玛阿尔德里奇公司(sigma-aldrich)(目录号mak136单胺氧化酶活性试剂盒)，其包括已知的mao抑制剂化合物，氯吉灵和帕吉林作为对照以及酪胺作为酶底物。该试剂盒中还包含辣根过氧化物酶以与酪胺氧化产生的过氧化氢相互作用，来与包含的标记物红反应。maoa和/或b的作用产生了导致荧光发射的事件级联。s1和s3是特奎拉龙舌兰酒，s1为s3的陈年版本，而s1dw是在氩气流干燥后的蒸馏水重构s1样品。s2是梅兹卡龙舌兰酒样品，由蓝龙舌兰以外的龙占兰种类制成。dw是蒸馏水。计算相对于缓冲液对照样(无抑制剂)的抑制百分比的荧光数据。作为对照，包括已知的maoa抑制剂氯吉灵和已知的maob抑制剂帕吉林。如图1所示，取决于样品可以实现maoa或b的选择性抑制。

实施例2

使用仅用犬尿胺的检测来测试各种特奎拉龙舌兰酒

在该实施例中使用不同的检测法，其中只有犬尿胺是底物和检测标记物。该测定使用犬尿胺作为mao底物，并且其为maoa和b两者的底物。由此是更理想的方法，因为消除了对过氧化物酶或光谱干扰的影响。犬尿胺氧化导致360nm和320nm处的od变化。产物也是荧光性的，并且可以通过以320nm的激发波长在400nm的发射强度的增加来检测。

根据以下方案在透明聚苯乙烯96孔板中设置检测：向孔中加入磷酸盐缓冲液(205μl/100mm/ph7.2)，随后加入10μm的20μl每种提取物样品和对照抑制剂氯吉灵(对于maoa)和帕吉林(对于maob)。重组人maoa和maob(0.5mg/ml蛋白质)购自并向每个检测提供3μg该蛋白质。一些检测以无蛋白质进行作为对照，也由提供。使抑制剂，缓冲液和蛋白质在设定在37℃的powerwave^tm光密度读数板读数器中预孵育10分钟。然后向每个孔中加入犬尿胺底物，并将该板在37℃下进一步孵育30分钟。在od360nm对板进行读取，计算从0到30分钟的吸光度变化，并转化成％抑制。样品s40，s41，s42分别为龙舌兰银酒(blanco)，未满一年陈的龙舌兰酒(reposado)和陈酿龙舌兰酒(anejo)，并且是相同制造商在0，1和2级陈化的特奎拉龙舌兰酒。s1，s3为如实施例1的特奎拉龙舌兰酒，s2是梅兹卡龙舌兰酒。从时间0到30分钟的360nm处的光密度变化计算抑制百分数。

结果示于图2中。

(含有40％乙醇的用作样品的一种特奎拉龙占兰酒(dj1942)测试没有乙醇脱氢酶和nad检测的干扰效应并且显示出干扰)。

实施例3

陈化的影响

使用犬尿胺检测来测试三种不同年数的特奎拉龙舌兰酒，s40，s41，s42，并比较这些样品的水和二氯甲烷提取物。相比年数较短的馏出物，陈化的特奎拉龙舌兰酒显示增加的mao抑制活性，如图3所示。

实施例4

mao抑制剂活性分级

用去离子水将特奎拉龙舌兰酒(1750ml)稀释至5000ml并分成三份，每份以二氯甲烷(4×100ml)提取。合并提取物，以去离子水(2×100ml)洗涤，并过无水硫酸钠干燥。通过使用旋转蒸发器蒸发溶剂，将样品体积减少至10ml，然后加入干二氧化硅，并在室温下除去溶剂。将样品吸附的二氧化硅干负载在具有50ml床体积的二氧化硅柱上，并使用己烷∶乙酸乙酯(100％己烷，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，100％乙酸乙酯)的梯度对柱进行操作。在柱运行期间，收集7ml馏分。样品检测如下：

a和b的mao检测设置于黑色thermoscientific^tm96孔板(#7205)中，每个检测含有溶解于dmso中的1μl样品，87μl的100mmph7.4的磷酸钾缓冲液，3μl0.75mm犬尿胺储备液。仅使用dmso的对照样(0抑制剂)，作为maoa抑制对照的1μldmso中的50微摩尔氯吉灵和作为maob抑制对照的1μldmso中的50微摩尔帕吉林的组被加入到每个板上。当优化检测时，板上有时包括无蛋白质组。

以在9μl缓冲液中的750ng蛋白质将重组人maoa和maob(supersomes^tm)加入到每个相应检测的孔中。

将板在37℃保温30分钟，然后向每个孔中加入100μl2nnaoh。在激发波长310和发射波长405的条件下在荧光分光光度计中对板进行读取。

为了鉴定柱馏分中的抑制活性，将25μl的每个馏分置于1.5ml微量离心管中，并在savant^tmspeedvac^tm中蒸发至干。向每个管中加入dmso(5μl)，根据上述方法检测1μl的maoa和b抑制活性。图4显示了所收集的馏分的maoa和b抑制活性。

在馏分6至13中可以看到显著的mao抑制。

实施例5

含mao抑制剂的油的制备

将特奎拉龙舌兰酒(100ml)以去离子水稀释至200ml，以二氯甲烷(3×50ml)提取。合并提取物，并通过无水硫酸钠柱。使用旋转蒸发器蒸发溶剂，得到30mg油状物。该油状物的样品抑制maoa75％，抑制maob87％。

将特奎拉龙舌兰酒(100ml)以去离子水稀释至200ml，以二氯甲烷(3×50ml)提取。合并提取物，并通过无水硫酸钠柱。通过在70℃的水浴上加热的kudernadanish装置中蒸发除去溶剂，得到17mg油状物。油状物的样品显示出55％的maoa抑制和88％的maob抑制。

实施例6

各种特奎拉龙舌兰酒样品本身的测定

如上所述，有mao抑制活性的样品不能在减压下蒸发，否则化合物将与乙醇共蒸发。因此，样品应在无乙醇蒸发的情况下进行检测，以消除mao抑制化合物的损失，并来准确地评级所分析产物的mao抑制活性。在黑色thermoscientific^tm96孔板(#7205)中如下设置检测：

每个检测在有100mmph7.4的磷酸盐缓冲盐水的93μl总体积中包括5μl的样品，0.975μg犬尿胺二氢溴酸盐，0.75微摩尔烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。

将乙醇脱氢酶稀释至0.25单位/ml，并向孔中加入3μl。将板在25至37℃孵育15分钟。

将以5mg/ml提供的人重组maoa和b(corning)以每份20μl等分在的小瓶中，并用246μl的缓冲液稀释用于检测，然后将4μl的每种mao加入其各自孔中。

将板在37℃下保温30分钟，加入2nnaoh(100μl)，并在激发波长310和发射波长405的条件下对板进行读取。

使用该检测，测试了各种特奎拉龙舌兰酒样品，结果如表1所示。

表1各种源自龙舌兰的饮料的分级

实施例7

反渗透(ro)的影响

使用配有～100mwco过滤器的tangentmembranes，inc.的romini将乙醇从特奎拉龙占兰酒分离，同时保留mao抑制化合物。这里，以蒸馏水将1.5升陈酿特奎拉龙舌兰酒(dja)稀释至15升，并在romini中循环，直到体积减少回1.5升。评估10，20，30和40μl浓缩样品和滤液的mao抑制活性(图5)。

如图5所示，浓缩物保留了maoa和b抑制剂，而mao抑制剂不存在于仅含有来自稀释样品的乙醇和水的滤液中。

表2显示了各种饮料以及稀释的特奎拉龙舌兰酒原料(标记稀释的ro对照)，第一ro浓缩物，第二ro浓缩物，第一ro滤液和第二ro滤液的结果。在mao抑制检测中显示滤液具有较少的抑制活性，而大部分活性随浓缩物保留。

表2