使用不同检测温度及基准值的靶核酸序列检测的制作方法
本发明涉及使用不同检测温度及基准值的靶核酸序列检测。
背景技术：
为了检测靶核酸序列，作为实时检测方式广泛利用以一边监控靶扩增，一边可检测靶核酸序列的实时检测方法。通常，在实时检测方法中使用与靶核酸序列特异性杂交的已标志的探针或引物。作为使用已标志的探针及靶核酸序列之间的杂交的方法的例，包括使用具有发夹结构的双重标志的探针的分子信标(molecularbeacon)方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、利用分别标志成供体及受体的2个探针的杂交探针方法(bernadetal,147-148clinchem2000；46)及使用单一标志的寡核苷酸的lux方法(美国专利第7537886号)。在本技术领域中广泛利用taqman方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述taqman方法(美国专利第5210015号及第5538848号)利用借助双重标志的探针及脱氧核糖核酸(dna)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探针的切割。
作为使用标志的引物的方法的例，包括日出(sunrise)引物方法(nazarenkoetal,2516-2521nucleicacidsresearch,1997,v.25no.12及美国专利第6117635号)、蝎形(scorpion)引物方法(whitcombeetal,804-807,naturebiotechnologyv.17august1999及美国专利第6326145号)及tsg引物方法(wo第2011-078441号)。
作为代替接近法，提出使用以依赖于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚体的实时检测方法，例如，侵入物(invader)分析(美国专利第5691142号、美国专利第6358691号及美国专利第6194149号)、探测和标标记寡核苷酸切割及延伸(ptocleavageandextension)方法(wo第2012/096523号)、探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo第2013/115442号)及探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(第pct/kr2013/012312号)。
如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相相关或无关的信号扩增过程中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标志产生的信号。根据现有实时检测技术，在一个反应管中利用单一类型的标志来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标志。在利用单一类型的标志的情况下，利用tm差异的解链分析可检测多个靶核酸序列，但是，解链分析具有如下缺点：解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的tm值的探针的设计变得越来越难。
如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相相关或无关的信号扩增过程中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标志产生的信号。根据现有实时检测技术，在单一反应管中使用单一类型的标志来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标志。在使用单一类型的标志的情况下，利用tm差异的解链分析可检测多个靶核酸序列，但是，解链分析具有如下缺点：解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的tm值的探针的设计变得越来越难。
因此，若开发不依赖于解链分析且在一个反应容器中使用单一类型的标志及单一类型的检测器来检测靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，若结合上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)，则能够以效率大大提高的方式在一个反应容器中使用单一类型的标志检测多个靶核酸序列。
在本说明书全文中，参照了多篇专利及文献，并用括号表示了其引用。为了更加明确地说明本发明及本发明所属技术领域的水平，这种专利及文献的公开内容全插入于本说明书作为参照。
技术实现要素：
本发明人为了开发检测靶核酸序列的方法，尤其为了开发以更准确且简单的方式定性或定量地检测的方法而进行了努力研究。其结果，本发明人在调节的检测温度下与靶核酸序列有关的信号后，通过使用基准值，来合适地分析检测结果确认到能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式在一个反应容器中利用单一类型的标志及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。
因此，本发明的目的在于，提供用于使用不同检测温度及基准值，来检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个核酸序列的方法及试剂盒。
本发明的再一目的在于，提供使用不同检测温度及基准值来对样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型进行分析的方法及试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器执行使用不同检测温度及基准值确定样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法。
本发明的另一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指示，上述处理器用于执行使用不同检测温度及基准值分析样品内靶核酸序列的单核苷酸多态性基因型方法。
本发明的还一目的在于，提供用于使用不同检测温度及基准值确定样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的装置。
本发明的又一目的在于，提供使用不同检测温度及基准值来分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型的装置。
本发明的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于执行使用不同检测温度及基准值确定样品内2个核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质。
本发明的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于执行使用不同检测温度及基准值分析核酸序列的单核苷酸多态性的基因型的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质。
与所附的发明要求保护范围及附图一同，通过以下详细说明可使本发明的其他目的及优点更加明确。
附图说明
图1a表示在相对较高检测温度(72℃)及相对较低检测温度(60℃)下，靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体(ct))、靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸、淋球菌(ng))及它们的组合的检测结果。通过taqman探针方法产生与沙眼衣原体及淋球菌有关的信号。
图1b表示基于图1a的检测结果获取基准值。作为基准值使用相对于在相对较低检测温度下检测出的信号在相对较高检测温度下检测出的信号的比率。
图1c以图示化的方式表示通过使用在图1b中获取的沙眼衣原体的基准值及在图1a中检测出的信号，来确定靶核酸序列(淋球菌基因组的脱氧核糖核酸、淋球菌)的存在。虚线表示阈值。
图1d以图示化的方式表示通过使用在图1b中获取的淋球菌的基准值及在图1a中检测出的信号，来确定靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体)的存在。虚线表示阈值。
图2a为表示在相对较高检测温度(67.8℃)及相对较低检测温度(60℃)下，靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体)、靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸、淋球菌)及它们的组合的检测结果。通过探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法产生与沙眼衣原体及淋球菌有关的信号。
图2b表示基于图2a的检测结果获取基准值。作为基准值使用相对于在相对较低检测温度下检测出的信号在相对较高检测温度下检测出的信号的比率。
图2c以图示化的方式表示通过使用在图2b中获取的沙眼衣原体的基准值及在图2a中检测出的信号，来确定靶核酸序列(淋球菌基因组的脱氧核糖核酸、淋球菌)的存在。虚线表示阈值。
图2d以图示化的方式表示通过使用在图2b中获取的淋球菌的基准值及在图2a中检测出的信号，来确定靶核酸序列(淋球菌基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体)的存在。虚线表示阈值。
图3b为表示在相对较高检测温度(64℃)及相对较低检测温度(60℃)下，靶各个单核苷酸多态性基因型(野生型纯合子、突变纯合子及杂合子)的检测结果。通过探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号。
图3b表示基于图3a的检测结果获取基准值。作为基准值使用相对于在相对较低检测温度下检测出的信号在相对较高检测温度下检测出的信号的比率。
具体实施方式
本发明的最大的特征是在一个反应容器中使用单一类型的标志及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。在利用不同检测温度及基准值的本发明中，在一个反应容器中利用单一类型的标志的情况下也可检测多个靶核酸序列。在本发明中，在各个靶核酸序列在不同检测温度均产生信号的情况下可检测多个靶核酸序列。根据本发明的特征选择本发明的结构，并成为用于检测靶核酸序列的惊人的工艺。
在现有的实时聚合酶链式反应方法中，为了在一个反应容器中检测2个靶核酸序列而需要2种类型的荧光标志或解链分析。
本发明可实现在一个反应容器中使用单一类型的荧光标志来检测2个靶核酸序列的实时聚合酶链式反应方案。
在本发明中利用如下有趣地发现：针对于在2个靶核酸序列中的一个，可在检测其他靶核酸序列的存在中使用在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的反映信号之间的差异的基准值。在本发明中所使用的与靶核酸序列有关的基准值是在相对较高检测温度及相对较低检测温度下从信号产生机构产生信号并检测，来以实验的方式获取的规定的值。在检测靶核酸序列中可直接使用基准值。选择性地，为了证明靶核酸序列的存在及不在，基准值可多样地适用于处理信号的式。
尤其，在本发明中用于检测多个靶核酸序列的信号产生机构在不同检测温度下均产生信号时还可检测多个靶核酸序列。
本发明可实现为如下的多种实施方式：
(a)使用不同检测温度及基准值的样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的检测；以及
(b)使用不同检测温度及基准值的样品内核酸序列的核苷酸多态性基因型分析。
i.使用不同检测温度及基准值的样品内至少一个靶核酸序列的检测
在本发明的一实施方式中，提供使用不同检测温度及基准值检测样品内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的方法，包括：步骤(a)，提供如下：(i)借助第一信号产生机构表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号的变化关系的、与第一靶核酸序列有关的第一基准值和/或(ii)借助第二信号产生机构表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号的变化关系的、与第二靶核酸序列有关的第二基准值；上述第一基准值与上述第二基准值不同；步骤(b)，与用于检测2个靶核酸序列的第一信号产生机构及第二信号产生机构一同培养样品，并在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测来自上述第一信号产生机构及第二信号产生机构的信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(c)，根据在上述基准值中的至少一种及在上述步骤(a)中检测出的信号确定2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在。
根据使用扩增曲线的现有的实时聚合酶链式反应方法，使用提供不被分辨的相同信号的信号产生机构来分辨多个靶核酸序列，从而无法进行检测，这是本发明所属技术领域的普通常识。
本发明克服与本技术领域的普通常识相关的局限，带来以非常得到改善的方式检测靶核酸序列的未期待的结果。
如下详细说明本发明。
步骤(a)：基准值的提供
提供与第一靶核酸序列有关的第一基准值及与第二靶核酸序列有关的第二基准值。
有趣地是本发明人确认在一个反应容器中，在表示预先确定单一靶核酸序列的存在的的2个检测温度下检测出的情况下，以特定图案(图案或者规则)存在信号变化。例如，针对靶核酸序列，，在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的信号变化呈特定图案(图案或者规则)。例如，上述信号的强度可相同或者实质上相同，或上述信号的强度在2个检测温度下，在特定范围中可互不相同。。
本发明的特征在于，将上述结果适用于取得基准值，且检测靶核酸序列。在一个反应容器中，与靶核酸序列有关的信号仅以检测温度不同的方式(例如，无靶含量的变化或者无缓冲液条件的变化)检测出，因而在2个检测温度之间的信号变化中存在特定图案(图案或者规则)。基于信号变化中的特定关系(图案或者规则)，在相对较高检测温度下检测出的信号可使用在用于分析在相对较低检测温度下检测出的信号，与此相反也相同。根据一实例，在针对2个检测温度之间的与靶核酸序列有关的信号变化允许特定关系(图案或者规则)的条件洗实施本发明的方法。
靶核酸序列的“基准值(referencevalue，rv)”表示在2个检测温度下借助用于检测靶核酸序列的信号产生机构提供的信号变化的关系。
根据一实例，培养与靶核酸序列相应的标准物质及信号产生机构，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号后，取得在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异来获取各个基准值。
根据一实例，(i)通过(i-1)与用于检测第一靶核酸序列的第一信号产生机构进行培养，(i-2)检测在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号，(i-3)取得在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异，来获取与第一靶核酸序列有关的第一基准值；(ii)通过与用于检测第二靶核酸序列的第二信号产生机构进行培养，(ii-2)检测在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号，(ii-3)取得在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异，来获取与第二靶核酸序列有关的第二基准值；上述第一基准值与第二基准值不同。
可根据多种方式提供各个基准值。
根据一实例，通过实施本发明的方法的人员的实验提供各个基准值。
选择性地，通过本发明的试剂盒、计算机可读存储介质、装置或计算机程序的制作公司提供各个基准值。可包含对包装在上述试剂盒、计算机可读存储介质、产品、装置或计算机程序的说明书具有关心的与靶核酸序列有关的基准值。
根据一实例，通过对相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获取基准值。
这种数学处理为信号的函数。为了获取基准值而使用的函数在提供相对较高检测温度及相对较低检测温度下，借助信号产生机构提供的信号变化的关系下包括任意函数。例如，函数能够以信号的加法、乘法、减法及除法等数学处理来提出。
可在获取相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号变化的关系中，以本身使用在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号的特征。可通过对上述信号的特征进行数学处理，来使在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号变形，并可在获取在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号变化的关系中，使用在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号。
选择性地，可使初始获取的基准值变形，并可用作基准值。
根据一实例，与基准值相关的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，还包含通过对信号进行数学处理来提供的变形的信号。
能够以多种方式获取在本发明中所用的基准值。例如，能够以预测的值提供基准值。考虑靶序列、信号产生机构及检测温度，来可预测表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号变化的关系的基准值。
当获取基准值时，术语“在第一检测温度及第二检测温度下检测出的信号之间的差异”为在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系的一实例。
根据一实例，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异包含对在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理来获取的差异。
根据一实例，在进行数学处理的情况下，作为信号的特征应该容易进行数学处理。在特定实例中，数学处理包括使用信号的计算(例如，加法、乘法、减法及除法)或者获取来源于信号的其他值的处理。
能够以多种实施方式表述在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号之间的差异。例如，可通过具有数值、信号的存在/不存在或信号特性的绘制表示上述差异。
可通过多种计算方法及他们的变形来进行用于获取差异的信号的数学处理。
尤其，通过计算在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号之间的比率，来可进行用于获取差异的信号的数学处理。
例如，作为基准值可使用相对于在第二检测温度下检测出的信号的端点(end-point)，在第一检测温度下检测出的信号的端点强度的比率。
根据本发明的一实例，用于获取信号之间的差异的信号的数学处理为相对于在相对较低检测温度下检测出的信号，在相对较高检测温度下检测出的信号的比率的计算。
根据一实例，可通过计算在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的减法来获取基准值。
可利用多种方式进行用于获取差异的数学处理。可通过使用机器来来进行数学处理。例如，可借助检测器或实时聚合酶链式反应装置内的处理器以数学方式处理信号。选择性地，尤其，可根据预选确定的算法以手工、数学方式处理信号。
根据本发明的一实例，第一基准值与第二基准值不同。根据本发明的一实例，以第一基准值与第二基准值不同的方式设计第一信号产生机构及第二信号产生机构。
在rv值相互不同的情况下，可根据计算rv值的接近法技术差异程度的定量性表述不同。
根据一实例，根据共同的计算方法处理用于获取基准值的信号来可提供用于比较的基准值，之后使用用于比较的上述基准值，来可获取2个基准值之间的差异程度。根据一实例，共同计算方法为2个信号的除法。
例如，根据本发明的方法为了获取在分析信号中所使用的基准值，在根据减法进行处理的情况下，为了获取用于比较上述2个信号的基准指可根据除法进行处理。
根据本发明的一实例，与第二基准值相比，第一基准值至少还大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。根据本发明的一实例，与第一基准值相比，第二基准值至少还大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。
根据一实例，在为了确定第一基准值与第二基准值是否相同，进行比较的情况下，根据除法计算上述基准值。根据一实例，为了确定第一基准值与第二基准值是否相同，计算基准值的方法可与为了检测靶核酸序列，计算基准值的方法相同或不同。
根据本发明的一实例，用于基准值的信号产生机构可与用于检测靶核酸序列的信号产生机构相同。
根据本发明的一实例，用于获取基准值的培养条件与用于分析样品的培养条件相同。
针对靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信号产生机构、酶或三磷酸脱氧核苷酸(dntp))的量、缓冲液ph或反应时间的多种反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号，因此在充分的反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，在计算基准值获得的信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内或者参照上述特定范围来选择基准值。根据本发明的一实例，可选择上述特定范围的最大值或最小值作为基准值或者参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值、尤其，考虑到在多种条件下获得的上述基准值的标准变化、允许误差范围、特异度或敏感度，可使基准值变形。
本发明为了提供与靶核酸序列有关的信号而利用信号产生机构。借助相应的信号产生机构检测各个靶核酸序列。
在本申请中所使用的术语“信号产生机构”意味着在产生用于表示靶核酸序列存在的信号的过程中所使用的任何物质，例如，其包括寡核苷酸、标志及酶。选择性地，在本申请中所使用的术语“信号产生机构”意味着利用用于产生信号的物质的任何方法。
根据本发明的一实例，培养是在基于信号产生机构可产生信号的条件下进行的。这种条件包括溶液的温度、盐浓度及ph。
作为信号产生机构使用的寡核苷酸的例包括与靶核酸序列特异性杂交的寡核苷酸(例如，探针及引物)，在与靶核酸序列杂交的探针或引物被切割而放出片段的情况下，作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述片段特异性杂交的捕捉寡核苷酸，在与上述捕捉寡核苷酸杂交的片段延伸而形成延伸链的情况下，作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸；作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述捕捉寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸；以及作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含它们的组合。
即使信号产生原理相同，也可将包含不同序列的寡核苷酸的信号发生机构视为互不相同的。
标志可与寡核苷酸相连接或者可以为自由形态。在延伸反应期间标志可插入于延伸产物。
在信号产生中使用上述寡核苷酸的切割的情况下，作为酶的例包括5’-核酸酶、3’-核酸酶、尤其包括具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶、具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶或fen核酸酶。
在本发明中，可使用上述记载的多种物质以多种方式产生信号。
根据一实例，在2个信号产生机构中的至少一个为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，各个与靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，上述二聚体包含双链靶核酸序列。
在本申请中，与信号产生机构相关使用的表达“以依赖于二聚体形成的方式产生信号”意味着以依赖于2个核酸分子的结合或解离的方式提供被检测出的信号。上述表达包括根据以依赖于靶核酸序列存在的方式形成的二聚体(例如，包含标志的检测寡核苷酸及核酸序列)提供信号。并且，上述表达包括通过抑制二聚体(例如，具有标志的检测寡核苷酸及核酸序列)的杂交来提供信号，上述抑制随着其他二聚体的形成产生。
尤其，通过与靶核酸序列及上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚体的形成产生上述信号。
在本申请中所使用的术语“检测寡核苷酸”是参与产生被检测的信号的寡核苷酸。根据本发明的一实例，检测寡核苷酸包含参与产生实质信号的寡核苷酸。例如，其他寡核苷酸(例如，包含与靶核酸序列或检测寡核苷酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸)和检测寡核苷酸的杂交或非杂交确定信号产生。
根据本发明的一实例，检测寡核苷酸包含至少一个标志。
基于靶核酸序列及检测寡核苷酸之间的二聚体形成的信号可通过包括蝎形方法(whitcombeetal,naturebiotechnology17:804-807(1999))、日出(或amplifluor)方法(nazarenkoetal,nucleicacidsresearch,25(12):2516-2521(1997)及美国专利第6117635号)、lux方法(美国专利第7537886号)、叩诊槌(plexor)方法(sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))、分子信标方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、相邻的杂交探针方法(bernard,p.s.etal.,anal.biochem.,273:221(1999))及lna方法(美国专利第6977295号)的多种方法产生。
尤其，通过以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸(mediationoligonucleotide)的切割的方式形成的二聚体产生信号。
在本申请中所使用的术语“介导寡核苷酸”为介导生成不包含靶核酸序列的二聚体的寡核苷酸。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸的切割本身不产生信号，在进行介导寡核苷酸的杂交及切割之后，通过上述切割形成的片段参与用于产生信号的连续反应。
根据一实例，介导寡核苷酸的杂交或切割本身不产生信号。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸以与靶核酸序列杂交且被切割的方式放出片段，从而包含介导二聚体生成的寡核苷酸。尤其，上述片段在捕捉寡核苷酸中介导基于上述片段的延伸的二聚体的生成。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸的切割放出片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，并在上述捕捉寡核苷酸中延伸。
根据本发明的一实例，与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，上述片段以延伸的方式形成延伸链，这导致形成上述延伸链及捕捉寡核苷酸之间的延伸二聚体，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与上述延伸链互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，上述第三寡核苷酸及延伸链的杂交通过形成其他类型的二聚体，来提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，第三寡核苷酸及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚体形成受到上述延伸链及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚体形成的抑制，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，上述片段、上述延伸链、上述捕捉寡核苷酸、上述第三寡核苷酸或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号可通过包括探测和标标记寡核苷酸切割及延伸(ptocleavageandextension)方法(wo2012/096523)、探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo2013/115442)及探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(pct/kr2013/012312)的多种方法产生。
与在上述的参考文献中公开的术语相关地，与寡核苷酸的相应的例如下：介导寡核苷酸与探测和标标记寡核苷酸(pto)相应，捕捉寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸(cto)相应，第三寡核苷酸分别与信号转导寡核苷酸(signalingoligonucleotide；so)或杂交寡核苷酸(ho)相应。信号转导寡核苷酸、杂交寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、延伸链或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号包含以由以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体抑制其他二聚体的形成的方式提供的信号(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交)。
例如，当通过探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法产生基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号时，信号产生机构包含：上游寡核苷酸，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；探测和标标记寡核苷酸(pto)；捕捉和模板化寡核苷酸(capturingandtemplatingoligonucleotide；cto)；适合的标志以及模板-依赖性核酸聚合酶，具有5’-核酸酶活性。探测和标标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含捕捉部位(i)及模板化部位(ii)，上述捕捉部位(i)包含与上述探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，上述模板化部位(ii)包含与探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法的产生信号的特定实施例包括如下步骤。
包括：步骤(a)，使靶核酸序列与上游引物及探测和标标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割上述探测和标标记寡核苷酸的条件下，使步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标标记寡核苷酸的切割，上述切割放出包含上述探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交；从上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应；通过使与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段延伸来形成延伸二聚体，上述延伸二聚体具有可通过(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或、(ⅲ)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度调节的tm值，上述延伸二聚体根据(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的至少一个标志、(ii)在延伸反应期间插入于延伸二聚体内的标志、(ⅲ)在延伸反应期间插入于延伸二聚体内的标志及与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志或(ⅳ)插入标志提供靶信号；以及步骤(e)，上述延伸二聚体在维持其双链形态的预先确定的温度下测定靶信号，由此检测上述延伸二聚体，上述延伸二聚体的存在表示靶核酸序列的存在。在这种情况下，在上述探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在语句“在反复循环之间变性”中，术语“变性”意味着将双链核酸分子解离成单链核酸分子。
在探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法的步骤(a)中，替代上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在这种情况下，在上述探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在使与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标标记寡核苷酸片段延伸而形成延伸链后，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法可分类为检测上述延伸的过程。探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法的特征在于，使用延伸链及上述捕捉和模板化寡核苷酸之间的二聚体检测延伸链的形成。
还存在检测延伸链形成的其他接近法。例如，可利用与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸，来检测延伸链的形成(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)。在这种方法中，信号可从(i)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志、(ii)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及与探测和标标记寡核苷酸片段相连接的标志、(iii)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及在延伸反应期间插入于延伸链的标志或(iv)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及嵌入染料提供。选择性性地，信号可从(i)与延伸链相连接的标志或(ii)嵌入染料提供。
选择性地，通过检测用于抑制与捕捉和模板化寡核苷酸及上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸之间的杂交的其他方法(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)检测延伸链形成。将这种抑制视为用于表现靶核酸序列的存在。信号可从(i)连接在可与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标志、(ii)与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志、(iii)连接在可与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标志及与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志或(iv)嵌入染料提供。
根据一实例，可与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸具有与探测和标标记寡核苷酸片段重叠的序列。
根据一实例，检测寡核苷酸包含：可与延伸链特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)及可与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)。根据一实例，检测寡核苷酸包含在反应期间生成的延伸链或捕捉和模板化寡核苷酸。
通常，基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法伴随依赖于靶核酸序列的存在的延伸链的形成。在本发明中为了包括用于提供信号的多种方法使用术语“基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法”，上述多种方法包括通过探测和标标记寡核苷酸的切割及延伸形成延伸链的步骤。
基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法产生信号的例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物及探测和标标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于上述探测和标标记寡核苷酸的切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶与相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的探测和标标记寡核苷酸的切割，上述切割放出包含探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，从上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，使用步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸，来形成延伸链；步骤(e)，通过检测与延伸链的存在依赖性地产生的信号来检测上述延伸链的形成。在步骤(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在这种情况下，在上述基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
根据一实例，基于二聚体的形成产生的上述信号包括基于上述二聚体杂交(例如，二聚体本身的杂交或第三寡核苷酸的杂交)被诱导的信号或基于抑制因二聚体形成而引起的第三寡核苷酸的杂交而被诱导的信号。
根据一实例，各个与靶核酸序列有关的信号产生机构是基于以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚体的信号产生机构。
根据一实例，在2个信号产生机构中的至少一个信号产生机构为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，2个信号产生机构均是以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
尤其，在使检测寡核苷酸和靶核酸序列杂交后，基于检测寡核苷酸的切割产生信号。
在使检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，基于上述检测寡核苷酸的切割的信号可通过包括taqman探针方法(美国专利第5210015号及美国专利第5538848号)的多种方法产生。
在通过taqman探针方法产生上述信号的情况下，信号产生机构包含用于扩增靶核酸序列的引物组、具有适当的标志(例如，相互作用性双重标志)的taqman探针及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶。在靶扩增期间，与靶核酸序列杂交的taqman探针被切割，并产生表示上述靶核酸序列存在的信号。
通过taqman探针方法产生信号的特定例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使引物组及具有适当的标志(例如，相互作用性双重标志)的taqman探针与靶核酸序列杂交的步骤；步骤(b)，使用上述步骤(a)的结果物及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶，来扩增靶核酸序列，上述taqman探针被切割而放出标志；以及步骤(c)，从所放出的上述标志检测信号产生。
尤其，信号以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式借助检测寡核苷酸的切割产生。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段的情况下，上述片段与检测寡核苷酸特异性杂交，上述片段诱导检测寡核苷酸的切割。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而放出片段的情况下，上述片段被延伸而切割包含与捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的检测寡核苷酸。
基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式的检测寡核苷酸的切割的信号可通过包括invader分析(美国专利第5691142号)、探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性切割(ptocleavageandextension-dependentcleavage)方法(wo2012/134195)及在美国专利第7309573号中记载的方法等多种方法产生。尤其，在美国专利第7309573号中记载的方法可被视为使用基于切割的产生信号的基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法中的一种。在上述探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，检测基于延伸链的形成的与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸的切割，从而可检测上述延伸链的形成。在invader分析中，借助介导寡核苷酸的切割形成片段，并且以无片段的延伸的方式诱导连续的切割反应。
根据本发明的一实例，在以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，检测寡核苷酸的切割诱导信号变化或者放出所要检测的已标志的片段。
在信号产生机构不仅基于检测寡核苷酸的切割产生信号，而且基于二聚体的形成而产生信号的情况下，只要上述信号产生机构基于切割产生信号，就可被视为基于切割提供信号的信号发生机构。
当切割检测寡核苷酸时，以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构产生信号，但是在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号互不相同。检测出的上述信号的差异(例如信号强度的差异)可以是与检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交和/或标志(例如，染料)的信号产生有关的基于温度的影响的信号。在使用taqman探针方法的实施例中使用这种差异。
有趣地，在本发明中使用以依赖于不同的检测温度及检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构(例如，taqman探针方法)，来可检测2个靶序列。
根据本发明的实例，与靶核酸序列有关的信号产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号产生机构及基于二聚体的形成的信号产生机构的组合。
根据一实例，检测寡核苷酸包含至少一个标志。
根据本发明的一实例，检测寡核苷酸可包含至少一个寡核苷酸。根据本发明的一实例，当检测寡核苷酸包含多个寡核苷酸形成时，上述检测寡核苷酸能够以多种方式具有标志。例如，多个寡核苷酸中的一个寡核苷酸可具有至少一个标志、多个寡核苷酸均可具有至少一个标志或者寡核苷酸的一个部位可具有至少一个标志而其它部位能够不具有标志。
借助2个信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨。术语“不被单一类型的检测器分辨的信号”意味着因它们的相同或实质上相同的信号特性(例如，光学特性、放出波长及电信号)不被单一类型的检测器相互分辨。例如，针对2个靶核酸序列使用相同的标志(例如，fam)且为了检测从fam的放出波长使用单一类型的检测器时，则无法以分辨的方式检测信号。
在本申请中所使用的术语“单一类型的信号”意味着提供相同或实质相同的信号特性(例如，光学特性、放出波长及电信号)的信号。例如，fam及calfluor610提供不同类型的信号。
在本申请中所使用的术语“单一类型的检测器”意味着用于单一类型的信号的检测机构。在包括用于多个不同类型的信号的多个通道(例如，光电二极管)的检测器中，各个通道(例如，光电二极管)相当于“单一类型的检测器”。
根据本发明的一实例，2个信号产生机构包含相同的标志，来自上述标志的信号不被上述单一类型的检测器分辨。
在本发明中，有用的标志包括在本技术领域中公知的多种标志。例如，在本发明中，有用的标志包括单一标志、相互作用性双重标志、嵌入染料及插入标志(incorporatinglabel)。
例如，单一标志包括荧光标志、发光标志、化学发光标志、电化学标志及金属标志。根据一实例，单一标志根据是否存在于双链或者是否存在于单链来提供不同的信号(例如，不同的信号强度)。根据一实例，上述单一标志为荧光标志。在本发明中所使用的单一荧光标志的优选种类及结合位点公开在美国专利号第7537886号及美国专利号第7348141号中，且其相关教导事项包含在本说明书中作为参照。例如，上述单一荧光标志包含joe、fam、tamra、rox及基于荧光素的标志。单一荧光标志可通过多种方法与寡核苷酸相连接。例如，上述标志可通过包含碳原子的隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或12-碳间隔区)与探针相连接。
作为属于大靶的相互作用性标志系统，荧光共振能量转移(fret，fluorescenceresonanceenergytransfer)标志系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移中，能量供体可以为荧光性，能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用性标志系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用性标志系统的另一形态中，能量受体为发光性，例如为生物发光性、化学发光性或电化学反光性，受体为荧光性。相互作用性标志系统包含基于“接触-介导猝灭(oncontact-mediatedquenching)”的双重标志(salvatore等.,nucleicacidsresearch,2002(30)no.21e122及johansson等.,j.am.chem.soc2002(124)pp6950-6956)。相互作用性标志系统包含基于至少2个分子(例如，染料)之间的相互作用诱导信号变化的任何标志系统。
在本发明中，有用的报道分子及猝灭分子可包括在本发明所属技术领域中公知的任何分子。上述的具体例如下：cy2tm(506)、yo-protm-1(509)、yoyotm-1(509)、calcein(517)、fitc(518)、fluorxtm(519)、alexatm(520)、rhodamine110(520)、oregongreentm500(522)、oregongreentm488(524)、ribogreentm(525)、rhodaminegreentm(527)、rhodamine123(529)、magnesiumgreentm(531)、calciumgreentm(533)、to-protm-1(533)、toto1(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3tm(570)、alexatm546(570)、tritc(572)、magnesiumorangetm(575)、phycoerythrinr&b(575)、rhodaminephalloidin(575)、calciumorangetm(576)、pyroniny(580)、rhodamineb(580)、tamra(582)、rhodamineredtm(590)、cy3.5tm(596)、rox(608)、calciumcrimsontm(615)、alexatm594(615)、texasred(615)、nilered(628)、yo-protm-3(631)、yoyotm-3(631)、r-phycocyanin(642)、c-phycocyanin(648)、to-protm-3(660)、toto3(660)、diddilc(5)(665)、cy5tm(670)、thiadicarbocyanine(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、fluorescein(520)、fluorescein-c3(520)、pulsar650(566)、quasar570(667)、quasar670(705)及quasar705(610)。括号内的数字为纳米单位的最大发光波长。优选地，报道分子-猝灭分子包含joe、fam、tamra、rox及基于荧光素的标志。
在如下多种文献中公开适合的荧光分子及适合的报道-猝灭对：pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colorandconstitutionoforganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(pergamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)；pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；haugland,r.p.,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,6thedition(molecularprobes,eugene,oreg.,1996)美国专利第3996345号及第4351760号。
留意如下：在本发明中，可使用能够对多种范围的波长或特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光猝灭分子(例如，黑猝灭分子或黑暗猝灭剂)。
在包含报道分子及猝灭分子的信号转导系统中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的另一伙伴(受体)。例如，将荧光素染料(fluoresceindye)作为报道分子使用，将罗丹明染料(rhodaminedye)作为猝灭分子使用。
相互作用性双重标志可与二聚体中的一条链相连接。当包含上述相互作用性双重标志的链以单链状态存在时，上述链通过形成发夹或无规卷曲结构来诱导相互作用性双重标志之间的猝灭。当上述链形成二聚体时，上述猝灭减少。择一性地，当上述相互作用性双重标志与位于邻近链的位置的核苷酸相连接时，产生相互作用性双重标志之间的猝灭。在上述链形成二聚体并被切割的情况下，上述猝灭减少。
各个相互作用性双重标志可分别与二聚体的两条链相连接。上述二聚体的形成诱导猝灭，二聚体的变形诱导进行猝灭。选择性地，在两条链中的一条链被切割的情况下，可诱导进行猝灭。
在本发明中作为有用的例示的嵌入染料包含sybrtmgreeni、po-protm-1、bo-protm-1、sytotm43、sytotm44、sytotm45、sytoxtmblue、popotm-1、popotm-3、bobotm-1、bobotm-3、lo-protm-1、jo-protm-1、yo-protm1、to-protm1、sytotm11、sytotm13、sytotm15、sytotm16、sytotm20、sytotm23、tototm-3、yoyotm3、gelstartm及噻唑橙。嵌入染料特异性地插入于双链核酸分子内来产生信号。
在产生信号过程中能够以在延伸期间插入标志的方式使用插入标志(例如，plexor方法，sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))。并且，在基于以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号产生过程也可使用上述插入标志。
通常，插入标志可与核苷酸相结合。并且，还可使用具有非-天然碱基核苷酸。
在本申请中所使用的术语“非-天然碱基(non-naturalbase)”意味着如腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)及尿嘧啶(u)等的天然碱基的衍生物，它们可形成氢键碱基对。在本申请中所使用的术语“非-天然碱基”作为母体化合物(mothercompound)包含具有与天然碱基不同的碱基对模式的碱基，例如，公开于美国专利第5432272号、美国专利第5965364号、美国专利第6001983号及美国专利第6037120号中。非-天然碱基之间的碱基对与天然碱基相同，具有2个或3个氢键。并且，非-天然碱基之间的碱基对还以特定方式形成。在非-天然碱基的特定例中，在碱基对组合中包含如下碱基。iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg、k/x、h/j及m/n(参照美国专利第7422850号)。
在通过探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号的情况下，在进行延伸反应期间插入的上述核苷酸可具有第一非-天然碱基，捕捉和模板化寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有对上述第一非-天然碱基产生特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
在本申请中所使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测或定量的核酸序列。靶核酸序列不仅包含单链序列，还包含双链序列。靶核酸序列不仅包含起初存在于核酸试样内的的序列，还包含在反应中新生成的序列。
靶核酸序列可包含任意脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gdna)及互补脱氧核糖核酸(cdna))及核糖核酸分子及它们的杂化体(嵌合核酸)。上述序列可以为双链或单链形态。在作为初始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将上述两条链制备成单链或部分单链形态。作为用于链分离的公知的方法包含加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，链分离可在80℃～105℃的温度范围下进行加热来实现。在文献[josephsambrook,等,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)]中公开了用于实现这种处理的常规方法。
当将信使核糖核酸(mrna)用作初始物质时，在进行退火步骤之前必需进行反转录步骤，在文献[josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)；及noonan,k.f.etal.,nucleicacidsres.16:10366(1988)]中确认其相关详细内容。为了实现反转录反应，可利用能够与信使核糖核酸的聚腺苷酸尾杂交的寡核苷酸dt引物、随机引物或靶特异性引物。
靶核酸序列包含任何天然原核细胞核酸、真核细胞核酸(例如，原生动物和寄生虫、真菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、eb病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。并且，核酸分子可以为通过重组生产的或可生产的任何核酸分子或化学合成或可化学合成的任何核酸分子。因此，可自然发现或无法发现核酸分子。靶核酸序列可包含已知或未知的序列。
步骤(b):样品和信号产生机构的培养及信号检测
与用于检测2个靶核酸序列的第一信号产生机构及第二信号产生机构一同培养所要分析的样品，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测来自上述第一信号产生机构及第二信号产生机构的信号。
根据一实例，设计各个相应的用于检测靶核酸序列的各个信号产生机构，从而在存在相应的靶核酸序列的相对较高检测温度及相对较低检测温度下均产生信号。
上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨。
根据一实例，用于分析样品的培养条件与用于获取第一基准值及第二基准值的培养条件相同。
在进行从信号检测的多种信号特征，例如信号强度(例如，rfu(相对荧光单位)值或进行扩增的情况下，特定循环、被选择的循环或在端点中的rfu值)、信号变化形状(或图案)或ct值或对上述特性进行数学处理来获得的值。
根据一实例，与基准值或样品分析相关的术语“信号”不仅包含在检测温度下获取的信号本省，而且包含通过对上述信号进行数学处理，来提供的变形的信号。
根据本发明的一实例，在通过实时聚合酶链式反应(pcr)获取扩增曲线的情况下，为了确定靶的存在可选择并使用从扩增曲线的多种信号值(或特征)(强度ct值或扩增曲线数据)。
根据一实例，使用于靶核酸序列的存在的信号是显著的信号。即，上述信号是以依赖于靶核酸序列的存在的方式产生的信号。根据一实例，可使用阈值来确定所检测的信号的显著性。例如，可考虑检测器的背景信号、敏感度或所使用的标志，来从阴性对照组预先确定阈值后，可确定信号的显著性。
根据本发明的一实例，可在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行步骤步骤(b)。根据本发明的一实例，以无核酸扩增的方式，在信号扩增过程中进行步骤(b)。
在本发明中，由信号产生机构产生的信号可与靶扩增一同进行扩增。选择性地，信号可无靶扩增地进行扩增。
根据本发明的一实例，信号产生与靶扩增一同在包含信号扩增的过程中实施。
根据本发明的一实例，根据聚合酶链式反应实施靶扩增。为了靶扩增，在本发明所属技术领域中广泛利用聚合酶链式反应，聚合酶链式反应包括靶序列的变性、靶序列和引物之间的退火(杂交)及引物延伸的循环(mullisetal.美国专利第4683195号、第4683202号及第4800159号；saikietal.,(1985)science230,1350-1354)。可通过在聚合酶链式反应的过程中适用上述的信号产生方法(例如，taqman方法及基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法)来扩增信号。根据一实例，本发明通过实时聚合酶链式反应方法提供信号。根据一实例，靶核酸序列的扩增通过聚合酶链式反应(聚合酶链式反应)、连接酶链式反应(lcr，参照wiedmannm,etal.,“ligasechainreaction(lcr)-overviewandapplications.”聚合酶链式反应methodsandapplications1994feb；3(4):s51-64)、缺口填补连接酶链式反应(glcr，参照wo第90/01069号、ep第439182号及wo第93/00447号)、q-β复制酶扩增(q-beta，cahillp,etal.,clinchem.,37(9):1482-5(1991)，美国专利第5556751号)、链置换扩增(sda，参照gtwalkeretal.,nucleicacidsres.20(7):1691-1696(1992)，ep第497272号)、基于核酸序列的扩增(nasba，参照compton,j.nature350(6313):912(1991))，转录介导的扩增(tma，参照hofmannwpetal.,jclinvirol.32(4):289-93(2005)；美国专利第5888779号)或滚环扩增(rca，参照hutchisonc.a.etal.,proc.natlacad.sci.usa.102:17332-17336(2005))实施。
上述记载的扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一序列反应来扩增靶序列。以“循环”表示包括重复一序列反应的扩增的单位。根据扩增方法循环的单位能够以重复次数或时间表示。
例如，可在扩增的各循环、选择的多个循环或反应的端点中进行信号检测。根据一实例，在至少2个循环中检测出信号的情况下，可在所有检测温度下或者在选择一部分的检测温度下实施各个循环中的信号检测。根据本发明的一实例，在奇数的循环中，在相对较高检测温度下进行检测，在偶数的循环中，在相对较高检测温度下进行检测。
根据本发明的一实例，在不仅可产生基于信号产生机构的信号，而且可实现靶扩增的条件下进行培养。
借助包含用于扩增的引物组及核酸聚合酶的靶扩增机构实现靶核酸序列的扩增。
根据本发明的一实例，可使用具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶。根据本发明的一实例，可使用不具有核酸酶活性的核酸聚合酶。
本发明中，有用的核酸聚合酶为从各种细菌种得到的热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶，上述脱氧核糖核酸聚合酶包含栖热水生菌(thermusaquaticus(taq))、极端嗜热菌(thermusthermophilus(tth))、丝状栖热菌(thermusfiliformis)、黄栖热菌(thermisflavus)、超好热性古细菌(thermocusliteralis)、典型嗜热菌(thermusantranikianii)、卡德菲勒斯嗜热菌(thermuscaldophilus)、切拉罗菲勒斯嗜热菌(thermuschliarophilus)、黄栖热菌(thermusflavus)、火地栖热菌(thermusigniterrae)、嗜齿菌(thermuslacteus)、死亡嗜热菌(thermusoshimai)、红栖热菌(thermusruber)、鲁本斯栖热菌(thermusrubens)、水生栖热菌(thermusscotoductus)、西凡纳斯热袍(thermussilvanus)、栖热菌种z05(thermusspeciesz05)、栖热菌种sps17(thermusspeciessps17)、嗜热菌(thermusthermophilus)、海栖热袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯栖热袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(thermosiphoafricanus)、嗜热球菌(thermococuslitoralis)、巴罗西热袍菌(thermococusbarossi)、嗜热古细菌(thermococusgorgonarius)、海栖热袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯栖热袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(thermosiphoafricanus)、沃氏热球菌(pyrococuswoesei)、掘越氏热球菌(pyrococushorikoshii)、深海热球菌(pyrococusabyssi)、隐蔽热网菌(pyrodictiumoccultum)、嗜火产液菌(aquifexpyrophilus)以及菌属超嗜热菌(aquifexaeolieus)。尤其，热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶为taq聚合酶。
根据本发明的一实例，通过非对称性聚合酶链式反应实现靶核酸序列的扩增。可通过考虑下游寡核苷酸的切割或杂交来选择引物的比率。
根据本发明的一实例，在无核酸扩增的信号扩增工序中进行步骤(a)和/或步骤(b)。
在通过包括寡核苷酸的切割的方法产生信号的情况下，信号能够以无靶扩增的方式被扩增。例如，虽然可通过cpt方法(duckp,etal.,biotechniques,9:142-148(1990)))，invader分析(美国专利第6358691号及第6194149号)，基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法(例如，探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法、探测和标标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法及pcec方法)或根据cer方法(wo2011/037306)使信号扩增，但以不扩增靶核酸序列的方式进行上述步骤(a)。
上述的信号扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一序列反应来扩增靶序列。以“循环”表示包括重复一序列反应的信号扩增的单位。根据扩增方法，循环的单位能够以重复次数或时间表示。
例如，可在扩增的各循环、选择的多个循环或反应的端点中进行信号的产生及检测。
为了产生信号，针对样品，在与两个信号产生机构进行培养(反应)期间或反应之后，可通过使用单一类型的检测器，来检测产生的信号。
根据一实例，考虑可借助信号产生机构产生信号的温度范围来预先确定针对靶核酸序列的检测温度。
在本发明中，利用存在能够以依赖于信号产生机构的方式产生信号的特定温度范围。
例如，当2个核酸分子杂交(或结合)时，信号产生机构产生信号，当它们之间非-杂交(或解离)时，在不产生信号的情况下，虽然在可实现2个核酸分子的杂交的温度下产生信号，但在2个核酸分子未进行杂交的温度下不产生信号。如上所述地，存在可产生信号(即，信号检测)的特定温度范围及不产生信号的其他温度范围。上述温度范围受在信号产生机构所使用的2个核酸分子的杂交物的tm值的影响。
在利用信号产生方法的情况下，上述信号产生方法使用切割后具有标志的所放出的片段，在理论上，可在任何温度(例如，30～99℃)下检测信号。
检测温度选自可由信号发生机构产生信号的温度范围。
根据一实例，用于检测靶核酸序列的信号产生机构可以为在2个检测温度下提供互不相同的信号(例如，信号强度)的信号产生机构。
根据一实例，在利用以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构(例如，taqman探针方法)情况下，在从信号产生机构的信号中，从检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交及染料的信号的产生可受到温度的影响的问题上，可根据检测温度不同。例如，利用荧光报道分子及猝灭分子标志的探针可根据检测温度产生不同的信号，与相对较高检测温度相比，可在相对较低检测温度下产生更高的信号。
与此相关地，本发明通过使用以依赖于不同的检测温度及检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构，来可检测2个靶序列。根据本发明的实例，2个信号产生机构均是基于检测寡核苷酸的切割的信号产生机构。
检测温度选自可由上述信号发生机构产生信号的温度范围。术语“检测温度范围”是为了特别记述可实现信号产生(即，信号检测)的温度范围而使用。
根据本发明，可通过考虑信号产生机构来分配用于检测各个靶核酸序列的存在的温度。
根据一实例，可预先确定进行检测的相对较高检测温度及相对较低检测温度。例如，作为相对较高检测温度及相对较低检测温度分别预先确定为72℃及60℃后，制作适合上述检测温度的信号产生机构。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于二聚体形成的方式产生信号的情况下，基于二聚体的tm选择上述检测温度。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于二聚体形成的方式产生信号的情况下，可通过调节二聚体的tm值来控制检测温度。
例如，在基于与靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸(例如，lux探针、分子信标探针、hybecon探针及相邻的杂交探针)产生信号的情况下，通过调节寡核苷酸的二聚体的tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。在使用蝎形引物的情况下，通过调节与延伸链杂交的部位的tm值，来在预先确定的温度下成功地实现上述信号的检测。
在基于根据靶核酸序列的存在形成的二聚体来产生信号的情况下，通过调节二聚体的tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。例如，在通过探测和标标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号的情况下，在捕捉和模板化寡核苷酸上通过调节通过探测和标标记寡核苷酸片段的延伸形成的延伸二聚体的tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。
基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法具有可容易调节二聚体及通过上述二聚体对杂交起到影响的第三杂化体的tm值的优点。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，虽然通过切割放出的标志放出信号，但是，由于检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交，因此可基于检测寡核苷酸的tm值来选择。
在本发明中所使用的检测器包括可检测信号的任何机构。例如，在使用荧光信号的情况下，可将适合于检测荧光信号的的光电二极管作为检测器使用。使用单一类型的检测器的检测意味着可检测单一类型的信号的检测器或使用包含括多种通道(即，光电二极管)的检测器的各通道(即，光电二极管)来进行检测。
根据一实例，信号的产生包括从标志“产生或消灭信号”以及“增加或减少信号”
在本申请中所使用的术语“试样”包括生物学样品(例如，从生物学供给源的细胞、组织及流体)及非-生物学样品(例如，食品、水及土壤)。生物学样品包含病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴、痰、swap、吸入物、支气管肺泡清洗液、牛奶、小便、粪便、眼内液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液(scf)、阑尾、脾脏及扁桃组织提取物、羊水及腹水，但并不限定于此。并且，样品包含从生物学供给源绝缘的核酸分子及合成的核酸分子。
在进行步骤(a)之间，可进行步骤(b)，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。因此，那种变化及变形属于附加的发明要求保护范围及其的等同范围确定的本发明的范围。
步骤(c):基于基准值及信号的靶核酸序列的存在的确定
最后，根据在基准值中的至少一个及在步骤(b)中检测出的信号确定2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在。
根据一实例，在根据2个基准值(即，第一基准值及第二基准值)检测2个靶核酸序列中使用本发明的方法。
与靶核酸序列的存在的确定相关，在本申请中所使用的术语“根据基准值及信号”意味着通过直接或间接使用在步骤(a)中提供的基准值及从信号产生机构产生的信号或进行变形或进行数学处理(包括使用基准值及信号的数值或它们的变形，使用基准值的范围、对基准值及信号进行绘制以及使用信号的存在/不存在)，来确定靶核酸序列的存在。在术语“根据基准值及信号”及“使用基准值及信号“之间无任何意图的差异，这些术语可相互交换使用。
可通过使用在步骤(a)中提供的基准值中的至少一个及在步骤(b)中检测出的信号，来确定在2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在，由此如下形成进一步准确地确定。
根据一实例，根据第二基准值及在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，在步骤(b)中检测出的信号确定样品内第一靶核酸序列的存在，根据第一基准值及在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，在步骤(b)中检测出的信号确定样品内第二靶核酸序列的存在。
根据一实例，根据第二基准值及利用在步骤(b)中检测出的信号计算的差异确定样品内第一靶核酸序列的存在，根据第一基准值及在相对较高检测温度及利用在步骤(b)中检测出的信号计算的差异确定样品内第二靶核酸序列的存在。
更尤其，确定第一靶核酸序列的存在的步骤包括如下的步骤：通过在第二基准值及步骤(b)中检测出的信号进行处理，来去除由第二信号产生机构产生的信号，并确定基于第一信号产生机构的信号的产生；确定第二靶核酸序列的存在的步骤包括如下的步骤：通过在第一基准值及步骤(b)中检测出的信号进行处理，来去除由第一信号产生机构产生的信号，并确定基于第二信号产生机构的信号的产生。
更尤其，在去除由第二信号产生机构产生的信号的步骤中，以数学方式从在步骤(b)中检测出的信号去除由第二信号产生机构产生的信号，在去除由第一信号产生机构产生的信号的步骤中，以数学方式从在步骤(b)中检测出的信号去除由第一信号产生机构产生的信号。
更尤其，根据第一基准值及在相对较高检测温度下检测出的信号，从在相对较低检测温度下检测出的信号去除由第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生的信号，由此确定第一信号产生机构在相对较低检测温度下是否产生信号，这是证明第一靶核酸序列的存在或不存在。
例如，在2个检测温度下，通过计算借助第二信号产生机构所提供的信号之间的比率，来获取第二基准值的情况下，可在相对较低检测温度下检测出的信号中减去值，来确定基于第一信号产生机构的在相对较低检测温度下的产生的信号；通过在相对较高检测温度下检测出的信号乘以第二基准值或在相对较高检测温度下检测出的信号除以第二基准值来获取上述值。
根据一实例，根据基准值“乘以”或“除以”在检测温度下检测出的信号是根据计算上述比率的方法不同。
更尤其，根据第二基准值及在相对较低检测温度下检测出的信号，从在相对较检测温度下检测出的信号去除由第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生的信号，由此确定第一信号产生机构在相对较低检测温度下是否产生信号，这是证明第一靶核酸序列的存在或不存在。
例如，在2个检测温度下，通过计算借助第二信号产生机构所提供的信号之间的比率，来获取第二基准值的情况下，可从在相对较高检测温度下检测出的信号减去值，来确定基于第一信号产生机构的在相对较高检测温度下的产生的信号；通过在相对较低检测温度下检测出的信号乘以第二基准值或在相对较低检测温度下检测出的信号除以第二基准值来获取上述值。
更尤其，根据第以基准值及在相对较高检测温度下检测出的信号，从在相对较低检测温度下检测出的信号去除由第一信号产生机构在相对较低检测温度下产生的信号，由此确定第二信号产生机构在相对较低检测温度下是否产生信号，
例如，在2个检测温度下，通过计算借助第一信号产生机构所提供的信号之间的比率，来获取第一基准值的情况下，可从在相对较低检测温度下检测出的信号减去值，来确定基于第二信号产生机构的在相对较低检测温度下的产生的信号；通过在相对较高检测温度下检测出的信号乘以第一基准值或在相对较高检测温度下检测出的信号除以第一基准值来获取上述值。
更尤其，根据第一基准值及在相对较低检测温度下检测出的信号，从在相对较高检测温度下检测出的信号去除借助第一信号产生机构在相对较高检测温度下产生的信号，由此确定第二信号产生机构在相对较高检测温度下是否产生信号。
例如，在2个检测温度下，通过计算借助第一信号产生机构所提供的信号之间的比率，来获取第一基准值的情况下，可从在相对较高检测温度下检测出的信号减去值，来确定基于第二信号产生机构的在相对较高检测温度下的产生的信号；通过在相对较低检测温度下检测出的信号乘以第一基准值或在相对较低检测温度下检测出的信号除以第一基准值来获取上述值。
如下，参照实施例1对成为本发明的基本的实施原理进行说明。
在实施例1中，培养第一靶核酸序列(淋球菌)及第一信号产生机构后，在相对较低检测温度(l)及相对较高检测温度(h)下测定信号。计算相对于借助第一信号产生机构所提供的在相对较低检测温度下的检测出的信号(ftl)的、借助第一信号产生机构所提供的在相对较高检测温度下的检测出的信号(fth)的比率，最终，将上述用作与第一靶核酸序列有关的第一基准值(淋球菌的rv＝rvf＝(ftl)÷(fth)＝1.8)。
培养第二靶核酸序列(沙眼衣原体)及第二信号产生机构后，在相对较低检测温度(l)及相对较高检测温度(h)下测定信号。计算相对于借助第二信号产生机构所提供的在相对较低检测温度下的检测出的信号(stl)的借助第二信号产生机构所提供的在相对较高检测温度下的检测出的信号(sth)的比率，最终，将上述用作与第二靶核酸序列有关的第二基准值(沙眼衣原体的rv＝rvs＝(stl)÷(sth)＝5.8)。
在与第一信号产生机构及第二信号产生机构培养样品的情况下，分别以fh及fl表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的荧光信号。
如实施例1，在根据比率提供与靶核酸序列有关的基准值的情况下，为了确定第一信号产生机构在相对较低检测温度下是否产生信号，可提供如下式(参照图1c及(ii)：fl－(fh×rvs)。
能够以在相对较高检测温度下从第一靶核酸序列的信号(fth)及从第二靶核酸序列的信号(sth)之和表示样品内的fh，能够以在相对较低检测温度下从第一靶核酸序列的信号(ftl)及从第二靶核酸序列的信号(stl)之和表示样品内的fl：fh＝fth+sth及fl＝ftl+stl。
可如下表示fl－(fh×rvs)：
fl–(fh×rvs)＝(ftl+stl)–((fth+sth)×rvs)
＝ftl－rvs×fth+stl－rvs×sth
＝ftl－5.8×fth+stl－5.8×sth。
在样品包含第二靶核酸序列的情况下，实际上(stl－5.8×sth)可显示0的值，这是因为rvs＝stl/sth＝5.8。
在样品中不存在第二靶核酸序列的情况下，实际上(stl－5.8×sth)可显示0的值，这是因为实际上stl及sth的值为0。
在样品包含第一靶核酸序列的情况下，(ftl－5.8×fth)可显示负值，这是因为在(ftl－5.8×fth)中使用5.8的基准值，相反地，第一靶核酸的第一基准值为1.8。
因此，在(ftl－5.8×fth)显示负值的情况下，确定为样品包含第一靶核酸序列(参照图1c)。
在样品内不存在第一靶核酸序列的情况下，实际上(ftl－5.8×fth)可显示0的值(参照图1c)。
选择性地，为了确定样品内第二靶核酸序列的存在，即，为了确定第二信号产生机构在相对较低检测温度下是否产生信号，可提供如下式(参照图1d及(i)：fl－(fh×rvf)。
可如下表示fl－(fh×rvf)：
fl－(fh×rvf)＝(ftl+stl)－((fth+sth)×rvf)
＝ftl－rvf×fth+stl－rvf×sth
＝ftl－1.8×fth+stl－1.8×sth。
在样品包含第二靶核酸序列的情况下，实际上ftl－1.8×fth可显示0的值，这是因为rvf＝ftl/fth＝1.8。
在样品中不存在第一靶核酸序列的情况下，实际上(ftl－1.8×fth)可显示0的值，这是因为实际上ftl及fth的值为0。
在样品包含第二靶核酸序列的情况下，(stl－1.8×sth)可显示正值，这是因为在(stl－1.8×sth)中使用1.8的基准值，相反地，与第二靶核酸有关的基准值为5.8。
因此，在(stl－1.8×sth)显示正值的情况下，确定为样品包含第二靶核酸序列(参照图1d)。
在样品内不存在第二靶核酸序列的情况下，实际上(stl－1.8×sth)可显示0的值(参照图1d)。
通过在上述的相对较低检测温度下分析信号，来当考虑检测靶核酸序列的原理时，如下通过分析在相对较高检测温度下的信号，来可实现靶核酸序列的检测。
例如，为了确定第一信号产生机构在相对较高检测温度下是否产生信号，提供以下式(参照图1c及(i))：fh－(fl÷rvs)。
选择性地，为了确定样品内第二靶核酸序列的存在，即，为了确定第二信号产生机构在相对较高检测温度下是否产生信号，可提供如下式(参照图1d及(ii)：fh–(fl÷rvf)。
当考虑上述的实例时，本发明所属技术领域的普通技术人员可理解如下：计算相对于借助信号产生机构所提供的在相对较高检测温度下的检测出的信号(fth)的、借助信号产生机构所提供的在相对较低检测温度下的检测出的信号(ftl)的比率，并且将此用作基准值(即，rv＝(fth)÷(ftl))，来根据本发明的方法确定核酸序列的存在或不存在。
根据一实例，本发明为了确定基于上述式的计算结果的显著性，还使用阈值。根据所选择的式可适用不同的阈值。根据一实例，为了相互补充基准值可选择阈值。
根据一实例，与基于聚合酶链式反应的靶扩增相关，在以实时方式产生信号的情况下，利用基准值处理在各个扩增循环或一部分已选择的循环中的信号，并针对循环绘制计算结果，来使用于确定靶核酸序列的存在。
根据一实例，一个反应容器还包括至少一个附加装置，上述至少一个附加装置分别包括用于检测除了上述2个靶核酸序列之外的靶核酸序列的额外的2个信号产生机构；由容器内的2个信号产生机构中的各个装置产生的信号被区分，并借助不同类型的检测器分别检测上述信号。例如，当以fam标志上述步骤(b)中的两个信号产生机构且以quasar570标志额外的2个信号产生机构时，在上述容器中由被fam-标志的信号产生机构产生的信号与由quasar570-标志的信号产生机构产生的信号相互分辨，因此为了检测2个不同的放出光需要2种类型的检测器。
根据本发明的一实例，上述2个靶核酸序列包含核苷酸变异，上述2个靶核酸序列中的一个包含一种类型的核苷酸变异，另一个包含另一类型的核苷酸变异。
在本说明书中所使用的术语“核苷酸变异”意味着在类似的连续的脱氧核糖核酸片段中特定位置的脱氧核糖核酸序列中的任意单一或多个核苷酸置换、缺失或插入。这种连续的脱氧核糖核酸片段包含一个基因或一个基因或染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以为突变或多态性等位基因变异。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(snp)、突变、缺失、插入、置换以及移位。例示的核苷酸变异的例包括人类基因组内的各种变异(例如，在亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)基因中的变异)、与病原体的药剂耐性相关的变异以及肿瘤形成诱发变异。在本申请中所使用的术语核苷酸变异包含核酸序列的特定位置的任意变异。即，术语核苷酸变异包含核酸序列的特定位置的野生型及其任意突变型。
根据本发明的一实例，通过本发明检测出的核苷酸变异是单核苷酸多态性(snp)。
根据本发明的一实例，通过使用第一信号产生机构，来检测由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子，通过使用第二信号产生机构，来检测由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子，通过使用第一信号产生机构及第二信号产生机构，来检测由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子。
在成为本发明的基础的实施原理下，本发明的方法可适用于在3个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的检测。
例如，3个靶核酸序列包含第一靶核酸序列、第二靶核酸序列及第3靶核酸序列。其中，可如下检测第一靶核酸序列。
在综合性的作为单一靶考虑第二靶核酸序列及第三靶核酸序列的情况下，可通过与第二信号产生机构及第三信号产生机构一同培养第二靶核酸序列及第三靶核酸序列，来获取与上述单一靶有关的综合性基准值。选择性地，与第二靶核酸序列有关的第二基准值或与第三靶核酸序列有关的第三基准值中的一种可用作综合性基准值。
然后，可根据上述综合性基准值及在2个检测温度下检测出的信号确定第一靶核酸序列的存在或不存在。
并且，可根据与第一靶核酸序列有关的检测接近法确定各个第二靶核酸序及第三靶核酸序列的存在或不存在。
ii.使用不同检测温度及基准值来分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型分析
在本发明的另一实施方式中，提供包括以下步骤的使用不同检测温度及基准值来分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性(snp)基因型分析方法。
步骤(a)，提供如下：(i)与纯合子有关的第一基准值，上述纯合子由借助第一信号产生机构表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系的第一单核苷酸多态性等位基因构成；(ii)与纯合子有关的第二基准值，上述纯合子由借助第二信号产生机构表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系的第二单核苷酸多态性等位基因构成；以及(iii)与杂合子有关的第三基准值，上述杂合子由借助第一信号产生机构及第二信号产生机构表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系的第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成；上述第一基准值、上述第二基准值及上述第三基准值互不相同；步骤(b)，与用于上述单核苷酸多态性等位基因的第一信号产生机构及第二信号产生机构一同培养样品，并在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测来自2个信号产生机构的信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(c)，根据上述基准值及在上述步骤(b)中在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异，来确定单核苷酸多态性基因型。
在原则上本发明基于上述的本发明的第一实施方式，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。在为了说明本实施方式，提起与第一实施方式有关的说明的情况下，需要留意本实施方式与第一实施方式一部分不同。本发明所属技术领域的普通技术人员需要理解与第一实施方式有关的一部分说明直接可适用于与实施方式有关的说明，变形的其他说明可适用于与本实施方式有关的说明。
步骤(a)：基准值的提供
提供如下：与由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第一基准值；与由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第二基准值；以及与由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子有关的第三基准值。
本发明具有利用与3个基因型有关的基准值的特征。
通过培养相应的单核苷酸多态性类型及信号产生机构，并在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号后，取得在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异，来获取各个基准值。
根据一实例，以三个基准值相互不同的方式设计信号产生机构。
根据一实例，(i)通过如下步骤获取与第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第一基准值，即，步骤(i-1)，与用于检测第一单核苷酸多态性等位基因的第一信号产生机构一同培养由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子；步骤(i-2)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号；以及步骤(i-3)，之后，获取在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异；(ii)通过如下步骤获取与由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第二基准值，即，步骤(ii-1)，与用于检测第二单核苷酸多态性等位基因的第二信号产生机构一同培养由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子；步骤(ii-2)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号；以及步骤(ii-3)，之后，获取在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异；以及(iii)通过如下步骤获取与由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子有关的第三基准值，即，(iii-1)，与用于检测第一单核苷酸多态性等位基因的第一信号产生机构及用于检测第二单核苷酸多态性等位基因的第二信号产生机构一同培养由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子；步骤(iii-2)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号；以及步骤(iii-3)，之后，获取在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异。
根据一实例，信号产生机构设置成与第一单核苷酸多态性等位基因有关的基准值与第二单核苷酸多态性等位基因有关的基准值不同。
含有单核苷酸多态性位点的核酸序列可包含人类的染色体对
根据一实例，当获取基准值时，检测出的信号之间的差异表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系。
根据一实例，当获取基准值时，检测出的信号之间的差异为信号之间的比率。
根据本发明的一实例，当获取基准值时，检测出的信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内参照上述特定范围来选择上述基准值。根据本发明的一实例，可利用上述特定范围的最大值或最小值或参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值。
根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号的充分的反应条件下获取基准值。例如，为了获得与由第一核苷酸多态性等位基因及第二核苷酸多态性等位基因均构成的杂合子有关的基准值，选择与各个核苷酸多态性等位基因的含量相同的反应条件，以在反应结束时提供与各个核苷酸多态性等位基因有关的饱和信号。根据本发明的一实例，当计算基准值时获取的信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内选择上述基准值或者参照上述特定范围来选择上述基准值。根据本发明的一实例，可利用上述特定范围的最大值或最小值或参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值。
步骤(b):样品和信号产生机构及与检测信号的培养
与用于分析核酸序列的单核苷酸多态性基因型的第一信号产生机构及第二信号产生机构一同培养包含含有单核苷酸多态性(单一核苷酸多态性)位点的核酸序列，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，检测来自上述第一信号产生机构及第二信号产生机构的信号。在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生信号，由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨。
根据本发明的一实例，在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行步骤(b)。
根据本发明的一实例，在无核酸扩增的信号扩增过程中进行步骤(b)。
步骤(c)：单核苷酸多态性基因型的确定
最后，根据基准值及在步骤(b)中在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异确定单核苷酸多态性基因型。
在本发明中不确定在样品内存在哪一个单核苷酸多态性等位基因，只是可根据相应的单核苷酸多态性基因型的基准值及在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异分析单核苷酸多态性基因型。
无需确定个别的单核苷酸多态性等位基因的存在的理由在于，存在3个单核苷酸多态性基因型，杂合子以1：1的比率包含野生型等位基因及突变等位基因。并且，上述理由在于在样品培养中可容易调节核酸分子的量。
根据一实例，在步骤(b)中检测出的信号之间的差异包含通过对在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号进行数学处理，来获取的差异。
根据一实例，通过计算上述信号之间的比率，来可获取在步骤(b)中检测出的信号之间的差异
根据本发明的一实例，含有第一单核苷酸多态性等位基因的纯合子样品表示特定范围内的差异(例如比率)，杂合子样品表示另一范围内的差异(例如比率)，含有第二单核苷酸多态性等位基因的纯合子样品表示另一特定分为内的差异(例如比率)。
根据一实例，通过与基准值比较信号之间的差异来确定单核苷酸多态性基因型。例如，与由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第一基准值为1.0，与由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子构成的第二基准值为5.2，与由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子有关的第三基准值为3.2，实际上，在步骤(b)中信号之间的差异为1.0的情况下，确定为样品是第一单核苷酸多态性等位基因的纯合子。
根据一实例，考虑与各个基因型有关的基准值的范围，来确立2个cut-off值，并可使用于基因分析。
iv.用于检测靶核酸序列的试剂盒
在本发明的追加实施方式中提供用于使用不同检测温度及基准值分析样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的试剂盒，上述用于使用不同检测温度及基准值分析样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的试剂盒包括：(a)2个信号产生机构，用于检测2个靶核酸序列；以及(b)说明书，记载标题为使用不同检测温度及基准值检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的检测的实施方式i的本发明的方法。
在本发明的追加实施方式中提供使用不同检测温度及基准值检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的试剂盒，上述使用不同检测温度及基准值检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的试剂盒包括：(a)2个信号产生机构，用于检测2个靶核酸序列中的至少一个；以及(b)说明书，记载标题为使用不同检测温度及基准值检测样品内至少一个靶核酸序列的实施方式ii的本发明的方法。
在本发明的另一实施方式中提供使用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型的试剂盒，上述供使用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型的试剂盒包括：(a)信号产生机构，用于第一单核苷酸多态性等位基因；(b)信号产生机构，用于第二单核苷酸多态性等位基因；以及(c)说明书，记载标题为利用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性基因型的实施方式iii的本发明的方法。
为了实施本发明而制备本发明的试剂盒，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
上述的本发明的所有试剂盒可选择性地包含缓冲液、脱氧核糖核酸聚合酶辅助因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸等的用于进行靶扩增聚合酶链式反应(例如，聚合酶链式反应)所需的试剂。选择性地，试剂盒还可包含多种多核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂及用于抑制脱氧核糖核酸聚合酶活性的抗体。并且，上述试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组时所需的试剂。在特定反应中所使用的试剂的最佳量可由知道本公开事项的优点的本发明所属技术领域的普通技术人员容易地确定。试剂盒的组成成分可存在于独立的容器或者多个组成成分可存在于一个容器内。
用于记述或实施本发明的方法的说明书可存储于适合的存储介质。例如，说明书可印刷于纸及塑料等的基板。在再一实例中，说明书能够以存在于只读储存器(cd-rom)及软盘等的适合的计算机可读存储介质的电子存储数据文件方式存在。在另一实例中，可在试剂盒内不包括实质的说明书，只是提供从远程数据源通过互联网获得说明书的机构。上述实例中的一例是包含可浏览说明书的网址和/或可下载说明书的网址的试剂盒。
v.用于检测靶核酸序列的存储介质及装置
在以下记述的存储介质、装置及计算机程序用于在计算机中实施本发明，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行使用不同检测温度及基准值确定样品内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法，上述使用不同检测温度及基准值确定样品内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法包括：步骤(a)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，接收从用于第一靶核酸序列的第一信号产生机构及用于第二靶核酸序列的第二信号产生机构产生的样品内信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(b)，根据在步骤(a)中所接收的信号、与第一靶核酸序列有关的第一基准值和/或与第二靶核酸序列有关的第二基准值确定至少一个靶核酸序列的存在；上述第一基准值表示借助第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系，上述第二基准值表示借助第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；上述第一基准值与上述第二基准值不同。
根据本发明的一实例，第一基准值和/或第二基准值存储于计算机可读存储介质。根据本发明的一实例，当运行本方法时，计算机可读存储介质包含输入第一基准值和/或第二基准值的指令。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质还可包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行用于获取第一基准值和/或第二基准值的方法，在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机程序，运行用于执行使用不同检测温度及基准值确定样品内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质，上述使用不同检测温度及基准值确定样品内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的方法包括：步骤(a)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，接收从用于第一靶核酸序列的第一信号产生机构及用于第二靶核酸序列的第二信号产生机构产生的样品内信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(b)，根据在步骤(a)中所接收的信号、与第一靶核酸序列有关的第一基准值和/或与第二靶核酸序列有关的第二基准值确定至少一个靶核酸序列的存在；上述第一基准值表示借助第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系，上述第二基准值表示借助第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；上述第一基准值与上述第二基准值不同。
根据本发明的一实例，计算机程序包含第一基准值和/或第二基准值。根据本发明的一实例，计算机程序包含当运行本方法时输入第一基准值和/或第二基准值的指示。根据本发明的一实例，计算机程序还包含指示，上述指示运行用于获得上述基第一基准值和/或第二基准值的处理器。
在借助上述处理器运行的情况下，通过启动上述程序指示来使处理器运行上述的本发明的方法。程序指示可包含用于接收第一信号及第二信号的指示，并且可包含利用所接收的上述信号来确定上述2个靶核酸序列的存在的指示。
可在处理器实施上述的本发明的方法，例如，可在位于独立计算机(stand-alonecomputer)、与网络相连接的计算机(networkattachedcomputer)或实时聚合酶链式反应设备等数据收集装置(dataacquisitiondevice)的处理器中执行上述的本发明的方法。
计算机可读存储介质包括刻录光盘(cd-r)、只读储存器(cd-rom)、数字多功能光盘(dvd)、闪存存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘、通用串行总线(usb)、磁带、迷你光碟(minidisc)、非易失性存储卡、电可擦只读存储器(eeprom)、光盘(cd)、光存储介质、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、系统存储器及web服务器等多种存储介质。
与信号相关的数据(例如，强度、扩增循环数及检测温度)可通过几个设备来接收。例如，数据可借助位于聚合酶链式反应数据收集装置的处理器收集。在进行收集期间可实时提供数据或者可储存于存储器单元或缓冲区，在完成实验后可在处理器提供数据。类似地，通过与上述收集装置的网络连接(例如，局域网(lan)，虚拟专用网络(vpn)、互联网及内联网)或直接连接(例如，通用串行总线、其它直接有线连接或无线连接)向独立计算机系统等额外的系统提供上述数据集或者可向光盘、数字多功能光盘、软盘、便携式硬盘或独立计算机系统等便携式介质提供上述数据集。类似地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供上述数据集。在相对较高检测温度下检测出信号的情况下，在接收或收集上述数据后，在上述数据分析过程中提供从用于确定靶核酸序列的存在的信号之间的差异获得的加工信号。上述处理器通过处理与信号相关的接收的数据，来提供反应在上述2个检测温度下的信号之间的差异的加工信号。例如，处理器通过处理所接收的数据来获得针对在相对较高检测温度下检测出的信号的在在上述相对较低检测温度下检测出的信号的比率。
用于实现运行本发明的处理器的指示可包含在逻辑系统。虽然可向便携式硬盘、通用串行总线、软盘、光盘及数字多功能光盘等的任何软件存储介质提供上述指示，但是可进行下载且可存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着随机存取存储器、只读存储器等其他存储器)。用于运行本发明的计算机代码可运行为如c、c++、java、visualbasic、vbscript、javascript、perl及xml等多种代码语言。并且，多种语言及协议可利用于基于本发明的数据和命令的外部及内部存储和传送。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供用于使用不同检测温度及基准值检测试样内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的装置，上述用于使用不同检测温度及基准值检测试样内包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2个靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列的存在的装置包括：(a)计算机处理器；以及(b)与上述计算机处理器耦合的计算机可读存储介质。
根据一实例，上述装置还包括：反应容器，可收容试样及信号产生机构；温度调节机构，用于调节上述反应容器的温度；和/或单一类型的检测器，用于检测借助上述信号产生机构产生的信号。
根据一实例，计算机处理器不仅使单一类型的检测器检测在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由信号产生机构产生的信号，而且还可计算在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的差异。上述处理器可被制作成一个处理器进行两种行为的结构，即，可进行在2个检测温度下的检测及计算差异的命令。选择性地，处理器单元可被制作成2个处理器分别进行两种行为的结构。
上述装置的第一个必要的特征为上述装置具有处理器，上述处理器用于可检测在上述2个检测温度下产生的信号。根据一实例，在信号与靶核酸序列的扩增一同产生的情况下，上述装置包括处理器，上述处理器用于能够在每次扩增循环中检测在上述2个检测温度下产生的信号。
上述装置的第二个必要的特征为上述装置具有处理器，上述处理器通过对在上述2个检测温度下检测的信号进行处理来取得上述信号之间的差异。根据一实例，上述信号之间的差异通过数学处理表示为数字。
根据一实例，上述处理器能够以在用于检测靶核酸序列的现有装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)设置软件的方式实现。根据一实例，上述装置可在至少2个检测温度下检测信号，并且包括对至少2个检测结果进行数学处理的处理器。
在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行使用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性的基因型的方法，上述使用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性的基因型的方法包括：步骤(a)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，接收从用于单核苷酸多态性等位基因的第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的样品内信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(b)，根据在步骤(a)中所接收的信号之间的差异、与由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第一基准值、与由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第二基准值以及与由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子有关的第三基准值来确定单核苷酸多态性基因型；上述第一基准值表示借助第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系，第二基准值表示借助第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；第三基准值表示借助第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；上述第一基准值、上述第二基准值及上述第三基准值互不相同。
根据本发明的一实例，在计算机可读存储介质存储第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值。根据本发明的一实例，当执行本方法时，计算机可读存储介质包含输入第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值的指令。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质还包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行用于获取第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值方法。
在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机程序，运行用于使用执行不同检测温度及基准值分核酸序列的单核苷酸多态性的基因型的方法的处理器且存储于计算机可读存储介质，上述计算机程序的特征在于，上述使用不同检测温度及基准值分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性的基因型的方法包括：步骤(a)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下，接收从用于单核苷酸多态性等位基因的第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的样品内信号；上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；以及步骤(b)，根据在步骤(a)中所接收的信号之间的差异、与由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第一基准值、与由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子有关的第二基准值以及与由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子有关的第三基准值来确定单核苷酸多态性基因型；上述第一基准值表示借助第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系，第二基准值表示借助第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；第三基准值表示借助第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下所提供的信号变化的关系；上述第一基准值、上述第二基准值及上述第三基准值互不相同。
根据本发明的一实例，计算机程序包含第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值。根据本发明的一实例，当执行本方法时，计算机程序包含输入第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值的指令。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质还包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行用于获取第一基准值和/或第二基准值和/或第三基准值方法。
在本发明的另一实施方式中，提供用于分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性(单一核苷酸多态性)基因型的装置，上述用于分析样品内核酸序列的单核苷酸多态性(单一核苷酸多态性)基因型的装置包括：(a)计算机处理器；以及(b)与上述计算机处理器耦合的计算机可读存储介质。
对本发明的特征及优点进行归纳如下：
(a)在利用不同检测温度的本发明中，在一个反应容器中仅用单一类型的标志，也能够以现有的实时方式检测多个靶核酸序列。在现有技术中，在完成靶扩增后，通过解链分析检测多个靶核酸序列。与此不同地，由于本发明在靶扩增后无需解链分析，从而大大缩短分析时间。
(b)在2个检测温度中产生2个与靶核酸序列有关的信号的情况下，本发明可检测出各个靶核酸序列。这种优点针对于各个靶核酸序列可使用基于切割产生信号的信号产生机构。
(c)在使用不同检测温度的本发明中，针对各个靶核酸序列的借助以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体提供信号的信号产生机构(例如，基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法)可诱导意外的效果。第一、如基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法在使用介导寡核苷酸的方法中通过容易调节二聚体的tm值来可简单地选择检测温度。根据上述特征能够更简单地进行调节，从而具有所需的基准值(或基准值的差异)。进一步，如基于探测和标标记寡核苷酸切割及延伸的方法在使用介导寡核苷酸的方法中，可形成具有特定tm值的二聚体，这是因为上述二聚体具有与靶核酸序列无关的序列。与此不同地，在适用与靶核酸序列直接杂交的探针的方法中，在所形成的二聚体中至少一个链包含与靶核酸序列互补的序列，因此在靶核酸序列上存在变形的情况下，可形成具有未意图的tm值的二聚体。
通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明，在所附的发明要求保护范围中所公开的本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的
实施例
实施例1：基于使用不同的检测温度及基准值的taqman实时聚合酶链式反应的多个靶检测
本发明人对使用单一检测通道在一个反应容器中可否检测2个靶核酸进行了调查。通过使用不同检测温度及基准值，来执行检测过程，并且将taqman实时聚合酶链式反应适用为信号产生机构。
为了上游引物和下游引物的延伸及taqman探针的切割，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌(ng)的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体(ct)的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。准备4种类型的样品(淋球菌、沙眼衣原体、淋球菌+沙眼衣原体及无靶的对照组)并进行了分析。
利用taqman实时聚合酶链式反应，来检测了淋球菌及沙眼衣原体。在靶核酸存在的情况下，taqman探针被切割，并放出标志的片段。可通过从标志的片段测定信号，来获取扩增曲线。
与淋球菌有关的taqman探针在其的5’-末端由荧光报道分子(quasar670)标志以及在其的3’-末端由猝灭分子标志(序列：3)，与沙眼衣原体有关的taqman探针在其的5’-末端由荧光报道分子(quasar670)标志以及内部部分由猝灭分子(bhq-2)标志(序列：6)
在上述实施例中，虽然来自taqman探针的信号未被相互分辨，但是使用与各个靶序列有关的基准值以及来自2个检测温度(72℃及60℃)的信号的绘制方法提供表示各个靶核酸序列的存在的扩增曲线。
用于获取与基准值有关的计算式及与各个与靶核酸序列有关的扩增曲线的绘制式如下：
(1)淋球菌或沙眼衣原体的基准值(rv)
在端点下，在60℃温度下的rfu÷在72℃温度下的rfu
(2)与淋球菌靶有关的绘制式：
(i)在72℃温度下的rfu－(在60℃温度下的rfu÷沙眼衣原体靶的rv)
或(ii)在60℃温度下的rfu－(在72℃温度下的rfu×沙眼衣原体靶的rv)
(3)与沙眼衣原体靶有关的绘制式：
(i)在72℃温度下的rfu－(在60℃温度下的rfu÷淋球菌靶的rv)
或(ii)在60℃温度下的rfu－(在72℃温度下的rfu×淋球菌靶的rv)。
在上述式中，rfu(相对荧光单位)值为在实时聚合酶链式反应的各个循环中测定的值，rv表示基准值。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物及探针的序列如下。
ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)
ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)
ng-p5’-[quasar670]tgcccctcattggcgtgtttcg[bhq-2]-3’(序列：3)
ct-f15’-tccgaatggataaagcgtgaciiiiiatgaactcac-3’(序列：4)
ct-r15’-aacaatgaatcctgagcaaaggiiiiicgttagagtc-3’(序列：5)
ct-p5’-[quasar670]cattgtaaaga[t(bhq-2)]atggtctgcttcgaccg[c3spacer]-3’(序列：6)
(i：脱氧肌苷)
利用包含靶核酸(1pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或1pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、1.5pmole的taqman探针(序列3)、5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列4)，10pmole的下游引物(序列5)、3pmole的taqman探针(序列6)以及5μl的4×主混合液(最终，200μm的三磷酸脱氧核苷酸(dntps)、2mm的mgcl2及2u的taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(cfx96，伯乐公司(bio-rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。
如图1a所示，当淋球菌、沙眼衣原体或淋球菌+沙眼衣原体存在时，在60℃及72℃温度下均检测出了信号。当靶核酸不存在时，未检测出信号。通过使用淋球菌独立样品或沙眼衣原体独立样品的信号来计算了与各个靶序列有关的基准值。如图1b所示，与淋球菌及沙眼衣原体靶有关的基准值分别为1.8及5.8。
之后，为了确认靶序列，将相应的基准值、在72℃及60℃温度下的rfu适用于绘制式(在图1c及图1d)中的(i)式或(ii)式)，并获取了各个靶序列的扩增曲线。为了确保获取的上述扩增曲线的显著性，参照淋球菌独立样品及沙眼衣原体独立样品的结果，来选择了适当的阈值。
如图1c及图1d所示，来源于绘制方法的扩增曲线可确认各个样品内淋球菌或沙眼衣原体的存在或不存在。
因此，可理解如下：通过使用不同检测温度及基准值的taqman实时聚合酶链式反应，在使用单一检测通道的情况下在一个反应容器中可检测出2个靶核酸。
实施例2：基于包括使用不同检测温度及基准值的探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的多个靶检测
本发明人对使用单一检测通道在一个反应容器中可否检测2个靶核酸进行了调查。通过使用不同检测温度及基准值，来执行以下检测过程，并且将探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应适用为信号产生机构。
为了上游引物和下游引物的延伸、探测和标标记寡核苷酸的切割及探测和标标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。准备4种类型的样品(淋球菌、沙眼衣原体、淋球菌+沙眼衣原体及无模板的对照组)并进行了分析。
通过使用探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，来检测了沙眼衣原体及淋球菌。在靶存在的情况下，探测和标标记寡核苷酸被切割，并生成探测和标标记寡核苷酸片段。上述探测和标标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚体(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。延伸二聚体的形成提供信号，并通过在延伸二聚体形成温度下测定信号，来可获取扩增曲线。
探测和标标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其延伸的方式被碳间隔区阻断。捕捉和模板化寡核苷酸在其的模板部位由猝灭分子(bhq-2)标志以及荧光报道分子(calfluorred610)标志(序列8及序列12)。
在本实施例中选择67.8℃及60℃作为信号检测温度。以依赖于靶核酸序列的存在的方式生成的延伸二聚体具有通过它们的序列及长度调节的能够控制的tm值。在本实施例中以在67.8℃及60℃温度下均提供信号的方式设计与淋球菌及沙眼衣原体有关的延伸二聚体的序列及长度。虽然来自信号产生机构的信号未被相互分辨，但是使用与各个靶序列有关的基准值以及来自2个检测温度(67.8℃及60℃)的信号的绘制方法提供表示各个靶核酸序列的存在的扩增曲线。
用于获取与基准值有关的计算式及与各个与靶核酸序列有关的扩增曲线的绘制式如下：
(1)淋球菌或沙眼衣原体的基准值(rv)
在端点下，在60℃温度下的rfu÷在67.8℃温度下的rfu
(2)与淋球菌靶有关的绘制式：
(i)在67.8℃温度下的rfu－(在60℃温度下的rfu÷沙眼衣原体靶的rv)
或(ii)在60℃温度下的rfu－(在67.8℃温度下的rfu×沙眼衣原体靶的rv)
(3)与沙眼衣原体靶有关的绘制式：
(i)在67.8℃温度下的rfu－(在60℃温度下的rfu÷淋球菌靶的rv)
或(ii)在60℃温度下的rfu－(在67.8℃温度下的rfu×淋球菌靶的rv)。
在上述式中，rfu(相对荧光单位)值为在实时聚合酶链式反应的各个循环中测定的值，rv表示基准值。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)
ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)
ng-pto5’-gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg[c3spacer]-3’(序列：7)
ng-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttg[t(calfluorred610)]actgcccgtatcgcgtac[c3spacer]-3’(序列：8)
ct-f25’-gagttttaaaatgggaaattctggtiiiiitttgtataac-3’(序列：9)
ct-r25’-ccaattgtaatagaagcattggttgiiiiittattggaga-3’(序列：10)
ct-pto5’-gattacgcgaccgcatcagaagctgtcattttggctgcg[c3spacer]-3’(序列：11)
ct-cto5’-[bhq-2]gcgctggataccctggacga[t(calfluorred610)]atgtgcggtcgcgtaatc[c3spacer]-3’(序列：12)
(i：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探测和标标记寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)，5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探测和标标记寡核苷酸(序列10)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及5μl的4×主混合液(最终，200μm的三磷酸脱氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(cfx96，伯乐公司(bio-rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，在95℃的温度下变性30秒，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟，在67.8℃下5秒钟的方式实施50次。在每个循环的60℃及67.8℃的温度下进行了信号的检测。
如图2a所示，当淋球菌、沙眼衣原体或淋球菌+沙眼衣原体存在时，在60℃及67.8℃温度下均检测出了信号。当靶核酸不存在时，未检测出信号。通过使用淋球菌独立样品或沙眼衣原体独立样品的信号来计算了各个靶的基准值。如图2b所示，与淋球菌及沙眼衣原体靶有关的基准值分别为6.1及1.0。
之后，为了确认各个样品，将相应的基准值、在67.8℃及60℃温度下的rfu适用于绘制式(在图2c及图2d)中的(i)式或(ii)式)，并获取了各个靶序列的扩增曲线。为了确保获取的扩增曲线的显著性，参照淋球菌独立样品及沙眼衣原体独立样品的结果，来选择了适当的阈值。
如图2c及图2d所示，来源于绘制方法的扩增曲线可确认各个样品内淋球菌或沙眼衣原体的存在或不存在。
因此，通过包含在不同温度下的信号检测的探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，使用单一检测通道，来在一个反应容器中可检测出2个靶核酸。
因此，可理解如下：通过使用探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，使用单一检测通道，来在一个反应容器中可检测出2个靶核酸。
实施例3：使用不同检测温度及基准值的单核苷酸多态性基因型分析
本发明人对本发明的方法可否适用于使用单一检测通道在一个反应容器中分析单核苷酸多态性基因型进行了调查。将探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应适用为信号产生机构。
为了上游引物、下游引物、探测和标标记寡核苷酸的切割及探测和标标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脱氧核糖核酸聚合酶。将mthfr(c677t)人类基因组脱氧核糖核酸的野生型(c)纯合子、突变型(t)纯合子及杂合子用作靶核酸序列。
通过使用探测和标标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应，来检测了mthfr(c677t)人类基因组脱氧核糖核酸的野生型(c)等位基因及突变型(t)等位基因。在靶等位基因存在的情况下，探测和标标记寡核苷酸被放出，并生成探测和标标记寡核苷酸片段。上述探测和标标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚体(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。上述延伸二聚体的形成提供信号，并通过在延伸二聚体形成温度下测定信号，来可获取扩增曲线。
探测和标标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其延伸的方式被碳间隔区阻断。利用猝灭分子(bhq-2)标志于与野生型(c)等位基因或突变型(t)等位基因有关的捕捉和模板化寡核苷酸的其的5’-末端以及利用荧光报道分子(calfluorred610)标志于其的模板部位(序列16及序列18)。
在本实施例中选择64℃及60℃作为信号检测温度。以依赖于野生型(c)等位基因或突变型(t)等位基因的存在的方式生成的延伸二聚体具有通过它们的序列及长度调节的能够控制的tm值。在本实施例中以在64℃及60℃温度下均提供信号的方式设计与野生型(c)等位基因及突变型(t)等位基因有关的延伸二聚体的序列及长度。以野生型(c)等位基因的基准值与突变型(t)等位基因的基准值不同的方式设计及选择包含延伸二聚体及2个检测温度的反应条件。
通过与上述3个基因型有关的基准值比较在2个检测温度下检测出的信号之间的差异，来可确定包含mthfr(c677t)基因的未公知的样品的基因型。
为了确认mthfr(c677t)基因的单核苷酸多态性基因型，计算了于各个基因型有关的基准值。由于可分辨于各个基因型有关的基准值，因此本发明人利用2个cut-off值来可划分与各个基因型有关的基准值的范围。如下计算在本实施例中使用的与各个基因型有关的基准值。
与野生型纯合子、突变纯合子及杂合子有关的基准值
在端点下，在60℃温度下的rfu÷在64℃温度下的rfu
在上述式中，rfu(相对荧光单位)值为在实时聚合酶链式反应的端点下测定的值。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
m677-f5’-ccaccccgaagcagggaiiiiigaggctgacc-3’(序列：13)
m677-r5’-caagtgatgcccatgtcggiiiiigccttcacaa-3’(序列：14)
m677-w-pto5’-ggtcccgacgttagctcccgcagacaccttctccttc[c3spacer]-3’(序列：15)
m677-w-cto5’-[bhq-2]cctcggtgccacgccatcgg[t(calfluorred610)]tcttctaacgtcgggacc[c3spacer]-3’(序列：16)
m677-m-pto5’-acgtcgattcgcactcccgcagacaccttctccttcaa[c3spacer]-3’(序列：17)
m677-m-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttt[t(calfluorred610)]attctgcgaatcgacgt[c3spacer]-3’(序列：18)
(i：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸(10ng的野生型(c)同源二聚体mthfr(c677t)人类基因组脱氧核糖核酸、10ng的突变(t)同源二聚体mthfr(c677t)人类基因组脱氧核糖核酸或10ng的异源二聚体mthfr(c677t)人类基因组脱氧核糖核酸)、5pmole的上游引物(序列13)及5pmole的下游引物(序列14)、3pmole的各个探测和标标记寡核苷酸(序列15及序列17)、1pmole的各个捕捉和模板化寡核苷酸(序列16及序列18)以及5μl的4×主混合液(最终，200μm的三磷酸脱氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(cfx96，伯乐公司)中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟，在64℃温度下5秒钟的方式进行了50次。在每个循环的60℃及64℃的温度下进行了信号的检测。
如图3a所示，当野生型(c)纯合子、突变(t)纯合子或杂合子存在时，在60℃及64℃温度下均检测出了荧光信号。当靶核酸不存在时，未检测出信号。确认计算与3个基因型有关的基准值，并根据cut-off值可进行分辨。
如图3b所示，与野生型(c)纯合子、杂合子及突变(t)纯合子有关的基准值分别为1.0、1.3及2.7。确认了与各个基因型有关的基准值表示可分辨各个基因型。
这些结果示出如下：在使用单一检测通道在一个反应容器中分析单核苷酸多态性基因型中可适用本发明的方法。有趣地是，无法相互分辨来自等位基因的信号，但是在本发明的方法中使用单一检测通道可准确地分析单核苷酸多态性基因型来实施。
详细记述了本发明的优选实例，可进行根据本发明的原理的变形及修改，这对本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的，本发明的范围可根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案定义。
序列表
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<120>使用不同检测温度及基准值的靶核酸序列检测
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