该文本涉及用于在植物中生产以非N-糖基化形式的感兴趣的重组蛋白的材料和方法。开发了用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白的策略，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核表达系统中的非N-糖基化重组蛋白的生产。描述了使用瞬时表达系统、通过与植物中的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了表达植物中的活性内切H的方法。
技术实现要素：
植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N-糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)蛋白或人类因子XIII的A链不携带N-连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N-连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，这可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGase F(肽：N-糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素-中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGase F处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白质中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N-糖基化重组蛋白质的生产。因此，本发明描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。
背景技术：
N-糖基化对于许多蛋白质的正确折叠和稳定性是关键的PTM，并且在异源表达系统中产生的许多重组蛋白质的生物学活性取决于它们的糖基化状态。然而，一些真核的以及细菌的蛋白质在天然宿主中不含N-聚糖，但含有多个潜在的N-糖基化位点，当这些蛋白质在异源真核表达系统中被表达时，这些N-糖基化位点可能异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠或掩蔽可能导致降低的功能性和免疫原性。例如，恶性疟原虫的Pfs48/45蛋白质或人类因子XIII的A链不携带N-连接的聚糖，并且炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统的表达过程中被异常糖基化的潜在的N-连接的糖基化位点。植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力也可能是对基于植物的表达系统的有用性的显著限制。在我们先前的研究中，我们已经使用植物中的瞬时表达、通过与细菌PNGase F(肽：N-糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)。使用体内去糖基化策略，在本萨明那烟草(N.benthamiana)中生产了以非N-糖基化形式的Pfs48/45蛋白质，并且针对Pfs48/45蛋白质的不同表位生产的四种mAbs(其中两种是构象特异性的)识别的Pfs48/45 2-至6-折叠的去糖基化形式要好于它们识别的相同蛋白质的糖基化形式(Mamedov等人，2012)。另外，仅利用体内PNGase F-去糖基化的Pfs48/45观察到了最强的结合和最大的mAb III信号抑制，而Pfs48/45的体外去糖基化、糖基化(Mamedov等人，2011)与它们抑制mAb III信号的能力相等。此外，这也与其他靶标一起进行了测试，结果显示只有体内去糖基化形式与抗体具有更强的结合，与体外去糖基化和糖基化形式相比，表明异常糖基化可能导致重要表位的掩蔽或引起Pfs48/45蛋白质的不正确/变异的折叠(Mamedov等人，2012)。
内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H，EC3.2.1.96)是由链霉菌(Streptomyces plicatus)和少数其他链霉菌属(Streptomyces)物种分泌的糖水解酶()(Tarentino等人，1976)。它切割寡糖的N-乙酰基葡糖胺核心的β-1,4-糖苷键并且使一个N-乙酰基壳二糖(N-acetylchitobiose)与糖蛋白的天冬酰胺残基连接(Trimble等人，1978；Muramatsu 1971)。链霉菌的内切H基因为939bp(GenBank登记号AAA26738.1)，编码28.9-kDa蛋白质。来自链霉菌的内切H最近在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中被表达，并且通过共发酵和发酵后处理，体外证实了巴斯德毕赤酵母产生的内切H的去糖基化活性(Wang等人，2015)。然而，蛋白质在体内条件下通过内切H酶的N-去糖基化尚未实现。在本研究中，描述并呈现了使用瞬时表达系统、通过与植物中的内切H共表达，对重组N-糖基化蛋白质进行体内去糖基化。
发明目的
在我们以前的研究中，通过与细菌PNGase F共表达靶蛋白，我们已经论证了在体内靶蛋白的去糖基化(Mamedov T.WO/2012/170678，2012；Mamedov等人，2012)。虽然通过PNGase F的去糖基化(体内或体外)完全除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白质中的氨基酸改变。此时，其他去糖基化酶(如内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H))——其催化N-连接的聚糖的壳二糖核心的两个GlcNAc残基之间的切割，从而将单个GlcNAc残基连接到天冬酰胺(图1)，并且与PNGase F相反，通过内切H的去糖基化导致所得去糖基化蛋白质的NxS/T位点的氨基酸序列没有变化。由于内切H处理在所得的去糖基化蛋白质中不产生氨基酸变化，因此我推测通过内切H产生的去糖基化蛋白质可能具有更多天然样折叠，因此与相同蛋白质的PNGase F去糖基化形式相比，具有更好的功能活性(免疫原性、受体结合、蛋白质-抗体相互作用、酶活性等)。我还推测，由于内切H切割使一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖产生电荷，从而可以提高去糖基化蛋白质的溶解度和稳定性。
本发明的工业应用
如上所述，PNGase F处理(体内去糖基化)完整除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺()脱酰胺成为天冬氨酸，导致去糖基化蛋白质中的氨基酸改变。内切H处理导致在所得去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变。在此，推测由内切H产生的去糖基化蛋白质可具有更多天然样折叠，因此与相同蛋白质的经PNGase F处理形式相比具有更好的功能活性(免疫原性、受体结合、蛋白质-抗体相互作用、酶活性等)。还推测由于内切H切割使一个GlcNAc残基与天冬酰胺连接，剩余的单糖产生电荷，由此可以提高去糖基化蛋白质的溶解度和稳定性。在本研究中，我首次证明了植物中去糖基化细菌酶内切H的表达。我还首次证明了在本萨明那烟草植物中通过内切H在体内对靶蛋白进行的去糖基化。我们证明了重组植物产生的内切H在体内完全有活性，并且成功地从PA83和Pfs48/45蛋白质切割N-连接的聚糖。此外，PA83与内切H的共表达导致PA83的累积，其尺寸与通过细菌PNGase F在体内去糖基化的分子的尺寸相似。重要的是，我们的初步稳定性分析的结果证明，内切H体内去糖基化的PA83似乎比相同蛋白质的糖基化的或PNGase F去糖基化(体内)的形式更稳定，特别是在高温下。总之，所有这些结果表明，内切H共表达策略可以用于在基于本萨明那烟草(N.benthamiana-based)的瞬时表达系统中生产以天然样形式的非糖基化的重组蛋白质。此外，本研究的结果揭示了内切H使PA83去糖基化作为炭疽和Pfs48/45疫苗的潜力，并且支持其用于临床前开发的进一步特征。这些结果证明内切H成功地从所有测试的糖蛋白切割了N-连接的聚糖，并且表明内切H共表达策略可用于生产非糖基化的疫苗抗原、治疗性蛋白质、抗体和细菌蛋白质(尤其是疫苗抗原候选物)酶。此外，本发明可用于在任何真核系统中生产工业酶(特别是细菌源酶)，用于提高生物质能/生物燃料产量，以及改善食品质量，特别是用于生产天然添加剂。
附图说明
图1A显示了内切H在寡糖的二乙酰基壳二糖核心中的两个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基之间切割，产生了在天冬酰胺(Asn)上剩余一个GlcNAc的截断的糖分子。图1B显示了肽-N-糖苷酶F(PNGase F)，其是一种酰胺酶，其在来自N-连接的糖蛋白的高甘露糖型、杂合体以及复合体寡糖的最内部的GlcNAc与天冬酰胺残基之间切割；□：N GlcNAc；○：甘露糖。
图2显示了如本文所述的在本萨明那烟草中表达的内切H的核苷酸和氨基酸序列。图2A显示了细菌的内切H基因核苷酸序列，其使用本萨明那烟草密码子进行密码子优化。图2B显示了在本萨明那烟草植物中表达的内切H的氨基酸序列。将PR-1a信号肽序列(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA)加到用下划线表示的N-端。将KDEL(ER保留信号)序列(粗体)跟随的FLAG表位(亲和纯化标签)加到C-端。
图3显示了本萨明那烟草植物中内切H的蛋白质印迹分析。用pGR-M-内切H或pGR-M-PNGase F构建物浸润本萨明那烟草植物，以产生内切H和PNGase F。以5dpi取叶样品，并在三倍体积的提取缓冲液中匀浆。以13,000g离心分离后，将样品在SDS-PAGE上运行，然后进行蛋白质印迹法。使用多克隆兔抗-flag标签(细胞信号传导，cat no.2368)抗体检测内切H和PNGase F。抗-兔IgG、HRP-连接的抗体(细胞信号传导，cat no.7074)作为第二抗体使用。1-本萨明那烟草植物表达PNGase F(35kDa)；2-本萨明那烟草植物表达内切H(约30kDa)。
图4显示了如所指出的，用pGR-M-PNGase F/pGR-M-PA83(1,2)或pGR-M-内切H/pGR-M-PA83(3-5)浸润的本萨明那烟草植物叶通过使用多克隆兔抗-flag标签(细胞信号传导，cat no.2368)抗体的蛋白质印迹法进行分析，以检测PNGase F或内切H。A：6-非浸润的本萨明那烟草植物。图4B显示了用pGR-M-PNGase F/pGR-M-PA83(1,2)或pGR-M-内切H/pGR-M-PA83(3-5)浸润的本萨明那烟草植物的蛋白质印迹分析。为了检测PA83蛋白质，使用抗-PA抗体(抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原抗体、BAP0101、cat.no.ab1988、Abcam)。
图5描绘了本萨明那烟草植物中所示的炭疽芽孢杆菌PA与细菌PNGase F和内切H的共表达的蛋白质印迹分析。用pGR-M-PNGase/pGR-M-PA83或pGR-M-内切H/pGR-M-PA83构建物浸润本萨明那烟草植物，用于生产去糖基化的PA83。以5dpi取叶样品，并在三倍体积的提取缓冲液中匀浆。以13,000g离心分离后，将样品在SDS样品缓冲液中稀释10倍。将10微升样品在SDS-PAGE上运行，然后进行蛋白质印迹法。如所示的，使用抗-PA抗体(抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原抗体、BAP0101、cat.no.ab1988、Abcam)或抗-His标签抗体(Penta His抗体、无BSA、cat no.34660)、QIAGEN)探测PA83带。单独(-)表达PA83，或者用PNGase F(+)或内切H(+)表达PA83。
图6描绘了在本萨明那烟草植物中恶性疟原虫的Pfs48/45蛋白质与细菌内切的共表达的蛋白质印迹分析。如所示的，用pGR-M-内切H或pGR-M-内切H/pGR-M-PA83构建物浸润本萨明那烟草植物，用于生产去糖基化的PA83。以7dpi取叶样品，并在三倍体积的提取缓冲液中匀浆。以13,000g离心分离后，将样品在SDS样品缓冲液中稀释10倍。将10微升样品在SDS-PAGE上运行，然后进行蛋白质印迹法。使用抗-FLAG多克隆抗体(细胞信号传导，cat no.2368)抗体探测Pfs48/45和内切H带。
图7描绘了使用HisPurTM Ni-NTA树脂纯化的PA83的去糖基化形式的SDS-PAGE(A，B)和WB分析(C)。图7A分别显示了由内切H和PNGase F的共表达生产的去糖基化PA83蛋白质的SDS-PAGE分析。图7B显示了在4℃培养48h的蛋白质的SDS-PAGE考马斯蓝染色。图7AC显示了，如所示的，在37℃培养1小时和在4℃培养48小时的去糖基化PA83蛋白质的蛋白质印迹分析。
实施例
实施例1-材料和方法
在本萨明那烟草中内切H的克隆和表达。内切H基因(GenBank登记号AAA26738.1)被优化，用于在本萨明那烟草植物中表达并由GENEART AG(Thermo Fisher Scientific)合成。为了在本萨明那烟草植物中瞬时表达内切H，从内切H序列中去除信号肽(氨基酸1-42)，并将烟草(Nicotianatabacum)PR-1a信号肽(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA)加到N-端。另外，将KDEL序列(ER保留信号)和FLAG表位(亲和纯化标签)加到C-端。将得到的序列插入修饰的pGreen II(pGR-M)或pBI121(Chen等人，2003)二元表达载体中，以分别获得pGR-M-内切H F和pBI-内切H。
在本萨明那烟草中PNGase F、PA83和Pfs48/45的克隆和表达。PNGase F(Mamedov等人，2012)和炭疽芽孢杆菌PA(氨基酸30-764，GenBank登记号AAA22637，Mamedov等人，2012)的序列被优化用于在本萨明那烟草植物中表达，并且使用Gene2Oligo(Rouillard等人，2004；Mamedov等人，2007)计算机程序由942bpPNGase F基因和2205bp PA基因的寡核苷酸进行合成。优化Pfs48/45(氨基酸28-401，GenBank登记号EU366251)的序列用于在本萨明那烟草植物中表达，并通过GENEART AG(赛默飞世尔科技)进行合成。将PR-1a信号肽(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA)加到所有基因的N-端。另外，将KDEL序列(ER保留信号)和FLAG表位(用于内切H和PNGase F，亲和纯化标签)或His标签(用于PA83)加到C-端。将得到的序列插入二元表达载体pGR-M或pBI121中(Chen等人，2003)。pGreen II，pSoup质粒从John Innes Centre(诺威奇)获得。随后将所有质粒连同pSoup和p19一起引入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL1或GV3101中。所得细菌菌株在BBL培养基(10g/L大豆水解物，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl和50mg/L卡那霉素)中在28℃过夜生长。通过手动浸润将细菌引入在土壤中生长的6周龄的本萨明那烟草植物。在浸润后四天、五天、六天和七天，收获叶组织，并使用研钵和研杵均化。AGL1或GV3101土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株和P19质粒由Sophien Kamoun教授(英国诺里奇的塞恩斯伯里实验室(The Sainsbury Laboratory))友情提供。野生型本萨明那烟草在阿卡德尼兹大学的温室的土壤中生长。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。植物生产的PA83样品的SDS-PAGE分析在用考马斯(Gel Code蓝，Pierce Rockford，IL)染色的10％丙烯酰胺凝胶上进行。在电泳之后并在蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜之后进行蛋白质印迹分析。转移后，用I-Block(Applied Biosystems，卡尔斯巴德，加拿大)封闭蛋白质印迹膜，并用抗-4xHis(Qiagen，巴伦西亚，加拿大)mAb或抗-炭疽芽孢杆菌保护性抗原抗体[BAP0101](ab1988)检测重组蛋白质。然后用含有0.1％Tween 20的1×PBS(PBS-T)洗涤膜，以除去过量的第一抗体，并用抗-小鼠辣根过氧化物酶(anti-mouse horseradish peroxidase)(HRP)偶联的第二抗体(ab98790)或抗-兔辣根过氧化物酶(anti-rabbit horseradish peroxidase)(HRP)偶联的第二抗体(ab97051)标记。用化学发光底物(SuperSignal West Pico,Thermo Fisher Scientific,Grand Island,NY)获得信号产生；将膜与5ml SuperSignal West Pico化学发光底物培养5分钟，包裹在塑料中，然后暴露于柯达X射线胶片不同的时间。将该胶片在暗室中用显影剂和快速定影液分别显影和定影。
实施例2-本萨明那烟草中的细菌内切H基因的克隆和表达
如实验过程所述，将包含313个氨基酸的细菌内切H基因序列(GenBank：AAA26738.1)(没有信号序列的催化活性蛋白质的全长，1-42aa)进行优化用于在本萨明那烟草植物中的表达(图2)，将其克隆到pGR-M载体中并在本萨明那烟草植物中表达。此外，为了比较通过内切H与PNGase F的体内去糖基化，如先前所述，将包含314个氨基酸的细菌PNGase F基因序列进行优化用于在本萨明那烟草植物中的表达，并将其进行表达(Mamedov等人，2012)。通过使用抗-FLAG单克隆抗体(mAb)的蛋白质印迹分析证实了本萨明那烟草中的内切H和PNGase F的表达(图3)。如图3所示，PNGase F在约35kDa在SDS-PAGE中迁移(接着进行蛋白质印迹)，内切H以约25kDa迁移，这比PNGase F蛋白质更快。应该注意的是，当目标的共表达达到最高水平时，表达内切H和PNGase F的本萨明那烟草植物在浸润后7、8和9天(dpi)保持健康(图4)，没有可见的症状发展或生长改变。
实施例3-内切H的去糖基化能力；通过共表达内切H在本萨明那烟草植物中的重组炭疽芽孢杆菌PA的体内去糖基化
为了评价N-连接的寡糖修饰的PA83的体内切割，内切H和PA83通过共-农杆菌浸润在本萨明那烟草植物中瞬时共表达。作为参考，细菌PNGase F也通过共-农杆菌浸润在本萨明那烟草植物中瞬时共表达。应该注意的是，炭疽芽孢杆菌的PA不是糖蛋白，但在本萨明那烟草植物中表达时它是糖基化的。以5dpi进行的蛋白质印迹分析证明了与内切H共表达的PA83的迁移率的变化(图5)，表明了蛋白质去糖基化。此外，如SDS-PAGE和蛋白质印迹分析所示，与内切H共表达导致PA83的积聚，其大小与通过细菌PNGase F在体内去糖基化的分子的大小相似(Mamedov等人，2012)，表明PA83被酶促地去糖基化(图5)。
实施例4-内切H的去糖基化能力；通过共表达内切H在本萨明那烟草植物中的Pfs48/45的体内去糖基化
Pfs48/45是传播-阻断(TB)疫苗开发的主要候选物之一。为了评估N-连接的寡糖修饰的Pfs48/45的体内切割，通过与pGR-M-Pfs48/45和pGR-M-内切H构建物的共-农杆菌浸润，在本萨明那烟草植物中瞬时共表达恶性疟原虫的细菌内切H和Pfs48/45蛋白质。如SDS-PAGE和蛋白质印迹分析所示，与内切H的共表达导致分子量约为～60kDa的Pfs48/45的积累，其大小与通过PNGase F的体外去糖基化的分子的大小相似(参见图4，Mamedov等人，2012)，表明Pfs48/45被酶促地去糖基化(图5)。这些结果证明内切H成功地从PA83和Pfs48/45蛋白质切割了N-连接的聚糖，并且植物生产的内切H在体内是有酶促活性的，并且表明内切H共表达策略可用于在基于本萨明那烟草的瞬时表达系统中生产以非糖基化形式的治疗性蛋白质。
实施例5-使用HisPurTM Ni-NTA树脂的去糖基化的PA83蛋白质的纯化以及去糖基化的PA蛋白质的初步稳定性分析。
使用HisPurTM Ni-NTA树脂(Thermo Fisher scientific,Cat.No.8822)纯化PA83的内切H和PNGase F共表达的和去糖基化的形式。如SDS-PAGE和考马斯染色所示(图5A)，纯化的PA83蛋白质是高度均一的。此外，如SDS-PAGE和(图5A)以及蛋白质印迹分析所示，与内切H的共表达导致PA83的积累，其大小与通过细菌PNGase F在体内去糖基化的分子的大小相似。为了评估通过内切H和PNGase F的去糖基化对蛋白质性质的影响，以37℃和4℃处理的形式对PA83蛋白质的去糖基化形式进行了PA83的不同形式的初步稳定性测试，发现与PNGase F糖基化的形式相比，内切H体内去糖基化的PA83似乎更稳定，特别是在高温(37℃)时。
实施例6-抗-PA单克隆抗体与糖基化的内切H或PNGase F体内去糖基化的PA83变体的结合
使用IMAC纯化的PA83抗原和炭疽芽孢杆菌保护性抗原抗体(MA1-21675)进行抗-PA单克隆抗体与糖基化的内切H或PNGase F体内去糖基化的PA83变体的结合。抗-PA抗体(抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原抗体，BAP0101，cat.no.ab1988，Abcam)显示了与植物生产的糖基化的和内切H或PNGase F在体内去糖基化的PA83蛋白质类似的结合(未显示数据)。
参考文献
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<120> 通过用内切H共表达的体内N-去糖基化重组蛋白质的生产
<210> 1
<211> 942
<212> DNA
<213> 人工的（artificial）
<223> 重组DNA
<400> 1
ATGGGTTTCGTGCTGTTCAGCCAGCTGCCTTCTTTCCTTCTTGTGTCTACCCTTCTGCTGTTCCTGGTGATCT
CTCATTCTTGTAGGGCTCCAGCTCCTGCTCCTGTTAAGCAAGGTCCTACTTCTGTGGCTTACGTTGAGGTGAA
CAACAACAGCATGCTGAACGTGGGAAAGTACACCCTTGCTGATGGTGGTGGTAACGCTTTCGATGTGGCTGTG
ATTTTCGCTGCTAACATCAACTACGATACCGGTACTAAGACCGCTTACCTGCACTTCAATGAGAACGTGCAGA
GGGTGTTGGATAACGCTGTGACTCAGATTAGGCCTCTTCAGCAGCAGGGTATTAAGGTGCTGCTTTCTGTGCT
TGGTAACCACCAGGGTGCTGGTTTCGCTAATTTTCCTAGTCAGCAGGCTGCTTCCGCTTTCGCTAAGCAACTT
TCTGATGCTGTGGCTAAGTACGGTCTGGATGGTGTGGATTTCGATGATGAGTACGCTGAGTACGGTAACAACG
GTACTGCTCAGCCTAACGATAGCTCTTTCGTGCATCTTGTGACCGCTCTGAGGGCTAACATGCCTGATAAGAT
CATCAGCCTTTACAACATCGGTCCTGCTGCTTCCAGGCTTTCTTACGGTGGTGTTGATGTGAGCGATAAGTTC
GATTACGCTTGGAACCCTTACTACGGAACCTGGCAAGTTCCTGGTATTGCTTTGCCTAAGGCTCAGCTTTCTC
CAGCTGCTGTTGAGATTGGTAGGACCTCTAGGTCTACCGTGGCTGATCTTGCTAGAAGGACTGTGGATGAGGG
TTACGGTGTGTACCTTACCTACAACCTGGATGGTGGTGATAGGACCGCTGATGTGTCTGCTTTCACCAGAGAG
CTTTACGGTTCTGAGGCTGTGAGGACCCCTGATTACAAGGACGATGATGATAAGGATGAGCTGTAG
<210> 2
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<223> 重组蛋白质
<400> 2
MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuValSerThrLeuLeuLeu
PheLeuValIleSerHisSerCysArgAlaProAlaProAlaProValLysGlnGlyPro
ThrSerValAlaTyrValGluValAsnAsnAsnSerMetLeuAsnValGlyLysTyrThr
LeuAlaAspGlyGlyGlyAsnAlaPheAspValAlaValIlePheAlaAlaAsnIleAsn
TyrAspThrGlyThrLysThrAlaTyrLeuHisPheAsnGluAsnValGlnArgValLeu
AspAsnAlaValThrGlnIleArgProLeuGlnGlnGlnGlyIleLysValLeuLeuSer
ValLeuGlyAsnHisGlnGlyAlaGlyPheAlaAsnPheProSerGlnGlnAlaAlaSer
AlaPheAlaLysGlnLeuSerAspAlaValAlaLysTyrGlyLeuAspGlyValAspPhe
AspAspGluTyrAlaGluTyrGlyAsnAsnGlyThrAlaGlnProAsnAspSerSerPhe
ValHisLeuValThrAlaLeuArgAlaAsnMetProAspLysIleIleSerLeuTyrAsn
IleGlyProAlaAlaSerArgLeuSerTyrGlyGlyValAspValSerAspLysPheAsp
TyrAlaTrpAsnProTyrTyrGlyThrTrpGlnValProGlyIleAlaLeuProLysAla
GlnLeuSerProAlaAlaValGluIleGlyArgThrSerArgSerThrValAlaAspLeu
AlaArgArgThrValAspGluGlyTyrGlyValTyrLeuThrTyrAsnLeuAspGlyGly
AspArgThrAlaAspValSerAlaPheThrArgGluLeuTyrGlySerGluAlaValArg
ThrProAspTyrLysAspAspAspAspLysAspGluLeu
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 本萨明那烟草（Nicotiana benthamiana）
<223> 重组蛋白质
<400> 3
MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuValSerThrLeuLeuLeu
PheLeuValIleSerHisSerCysArgAla
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<223> FLAG序列
<400> 4
AspTyrLysAspAspAspAspLys
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<223> 合成序列
<400> 5
LysAspGluLeu