本发明特别涉及扩增t细胞群的组合物、用来扩增t细胞群的方法以及使用这种细胞群的方法。在一些方面，本发明涉及用来选择性扩增混合t细胞群中存在的t细胞亚群的组合物和方法，以及通过本发明的方法产生的t细胞亚群。
背景技术：
t细胞识别与例如各种癌症或感染性有机体相关的抗原环境的能力由t细胞抗原受体(tcr)赋予，所述t细胞抗原受体由α(阿尔法)链和β(贝塔)链构成，或者由γ(伽玛)和δ(德尔塔)链构成。组成这些链的蛋白由dna编码，dna采用独特机制来产生tcr巨大的多样性。该多亚基免疫识别受体与cd3复合物关联，并与抗原提呈细胞(apc)表面上的主要组织相容性复合物(mhc)i类和ii类蛋白提呈的肽结合。tcr与apc上的抗原肽的结合是t细胞活化中的主要事件，其发生在t细胞与apc之间的接触点处的免疫突触处。为了保持t细胞活化，t淋巴细胞通常需要第二共刺激信号。共刺激对于辅助性t细胞产生足够的诱导克隆扩增的细胞因子水平通常是必要的。利用外源性施用的细胞因子和细胞表面蛋白刺激物可对t细胞进行活体外扩增和活化。
活体外扩增的t细胞广泛用于翻译研究和临床实验，用于癌症和偶然感染的免疫治疗，并预防移植后的自身免疫和移植物抗宿主疾病(gvhd)。尽管活体外扩增t细胞的施用已经取得一些积极的临床结果，但是制造大量的各种t细胞产物的复杂性仍然是更广泛应用的一个主要限制。尽管早期的活体外培养条件目标仅仅是产生高的t细胞数量并使细胞表达体内增殖能力低的不利表型，但是焦点已经转移到产生体内植入、增殖和功能更佳的t细胞的方案。
这些早期方案中的一些在t细胞的活化和扩增中利用
据信，初级t细胞活化信号的质量和数量，以及共刺激配体、细胞因子以及生长因子的存在和类型会决定传递到t细胞的总体信号，和最终对活化t细胞的命运的影响。这种经抗原刺激过的t细胞的成功扩增取决于通过tcr/cd3的刺激的足够强度，还取决于最佳共刺激信号和细胞因子的提供。一些报道显示，使用较强的cd3信号转导能力主要扩增初始t细胞，并且被认为会由于活化诱导的细胞死亡(aicd)而删除经抗原刺激过的t细胞(kalamasz等人，《免疫疗法(immunother)》27：405(2004))。经抗原刺激过的记忆性t细胞及其各种亚型在癌症、自身免疫紊乱、炎性疾病、过敏性疾病以及感染性疾病的治疗中具有广泛的治疗意义。因此，长期迫切需要可靠、有效且快速的方法来扩增特定的免疫亚群，例如经抗原刺激过的记忆性t细胞、调节性t细胞(treg)以及th17细胞。
本发明解决了对来自一般t细胞群的特定t细胞亚型的亚群特异性扩增的这一需要，并且还提供额外益处。
技术实现要素：
本发明(特别)提供用来选择性扩增各种t细胞亚群的组合物和方法。这些t细胞亚群包括，但不限于：(1)cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞(treg)，一种对免疫响应调节重要的cd4+辅助性t细胞的抑制性亚型；(2)th17细胞，一种调控宿主防御并涉及组织发炎和各种自身免疫性疾病的cd4+辅助性t细胞的炎性亚型；以及(3)记忆性t细胞或抗原特异性t细胞，一种长效细胞类型，其对之前暴露过的抗原保持免疫性。本文公开了用来选择性扩增以上所述各个t细胞亚群的方法和组合物。本发明提供了足够数量的t细胞亚群用于治疗用途(例如过继性免疫疗法、体内输注等)。本文所述的方法和组合物可用来产生用于研究目的和/或用于临床用途的不同t细胞亚群。所得扩增的t细胞亚群在临床环境中具有广泛的用途。
在一些方面，本发明涉及用来择性地扩增t细胞亚群成员的组合物和方法。这种方法包括包含以下的那些：将混合t细胞群暴露于(a)第一试剂，所述第一试剂给t细胞亚群成员提供初级活化信号，从而活化t细胞，并将混合t细胞群暴露于(b)第二试剂和第三试剂，所述第二试剂和第三试剂各自刺激t细胞亚群成员上的两种或更多种不同辅助分子，从而刺激(a)的活化的t细胞的增殖。在一些方面，第一试剂、第二试剂以及第三试剂的比例可被调节以诱导所述t细胞亚群成员相对于其它t细胞亚群成员而选择性地扩增。第一试剂可以是抗体(例如抗cd3抗体)。第二试剂也可以是抗体。第三试剂可以是抗体、非抗体蛋白或化学药剂(例如雷帕霉素)。当使用非抗体蛋白时，该蛋白可以是趋化因子或细胞因子(例如白细胞介素-1α、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18、白细胞介素-21、转化生长因子β1等)。
在一些特定方面，第一试剂、第二试剂以及第三试剂的比例可被调节为第一试剂的浓度比第二和/或第三试剂低。此外，第一试剂的更低浓度可以是约0.06单位、约0.1单位、约0.2单位、约0.3单位、约0.34单位或约0.4单位。另外，第一试剂可以是浓度为约0.34单位的抗cd3抗体，第二试剂可以是浓度为3.4单位的抗cd28抗体。
在一些方面，抗cd3可以0.01至4.0(例如从约0.01至约3.5、从约0.01至约3.4、从约0.02至约3.4、从约0.05至约3.5、从约0.1至约3.4、从约0.2至约3.4、从约0.5至约3.0、从约0.1至约2.5、从约0.01至约1.0、从约0.05至约1.0等)单位的量使用，并且抗cd28可以1.0至5.0(例如从约1.0至约4.8、从约1.0至约4.5、从约1.0至约3.5、从约1.0至约3.0、从约1.0至约2.9、从约1.5至约3.5、从约2.0至约3.5、从约2.5至约3.5、从约1.0至约4.8等)单位的量使用。此外，抗cd3与抗cd28的比例可以在从1∶10至1∶50(例如从约1∶12至约1∶48、从约1∶10至约1∶48、从约1∶12至约1∶50、从约1∶10至约1∶40、从约1∶10至约1∶35、从约1∶10至约1∶30等)的范围内。
在一些情况下，选择性地扩增的t细胞亚群可以是treg细胞。在这种情况下(以及其它情况下)，第一试剂的更低浓度可以是约0.01单位。此外，第一试剂可以是浓度为约0.01单位、约0.06单位、约0.1单位、约0.2单位、约0.3单位、约0.34单位或者约0.4单位的抗cd3抗体，第二试剂可以是抗cd28抗体，并且第三试剂可以是抗cd137抗体。
在一些情况下，选择性地扩增的t细胞亚群可以是记忆性t细胞。在这种情况下(以及其它情况下)，第一试剂的更低浓度可以是约0.005、约0.01或者约0.06单位。在其它情况下，选择性地扩增的t细胞亚群可以是th17细胞。此外，第一试剂可以是浓度为约0.01、约0.05、约0.06、约0.1或者约0.34单位的抗cd3抗体，并且第二试剂可以是抗icos抗体。
本发明还包括用来选择性扩增t细胞亚群的组合物和方法。这种方法包括包含(a)和(b)的那些：(a)将t细胞活体外暴露于cd3、cd28和/或cd137信号，和(b)以容许扩增th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞的方式培养所述t细胞。在一些情况下，cd3、cd28以及cd137信号可由抗cd3、抗cd28和/或抗cd137抗体介导。在更特定的情况下，抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体可在包括0.01单位至1.5单位的浓度的范围内使用(例如针对记忆性t细胞的扩增)。此外，抗cd3、抗cd5、抗icos、抗cd6、抗cd28以及抗cd137抗体可在包括0.06单位至1.5单位的浓度的范围内使用(例如针对th17细胞的扩增)。另外，抗cd3、抗cd5、抗icos、抗cd6、抗cd28以及抗cd137抗体可在包括约0.34单位至3.41单位的浓度的范围内使用(例如针对treg细胞的扩增)。另外，抗cd3抗体可在与抗cd5、抗icos、抗cd6、抗cd28以及抗cd137抗体的浓度相比更低的浓度下使用。在一些方面，t细胞可使用cd3选择来分离。此外，通过本发明的方法扩增的th17细胞可以是cd3+、cd8/cd4+/，并且可产生il-17细胞因子。这种th17细胞还可能能够产生il-17、il-21和/或il-22。
通过本发明的方法扩增的记忆性t细胞包括选自由以下组成的群组的那些：干细胞样记忆性t细胞、中枢记忆性t细胞以及效应记忆性t细胞。干细胞样记忆性细胞可具有以下标记物中的一种或多种：cd3+、cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+、il-7rα+、il-2rβ、cxcr3以及lfa-1。中枢记忆性细胞可具有以下标记物中的一种或多种：cd3+、ccr7+、cd45ra-、cd45ro+、cd62l+(l-选择素)、cd27+以及cd28+。此外，这些中枢记忆性细胞可能能够产生il-2。通过本发明的方法扩增的效应记忆性细胞可具有以下标记物中的一种或多种：cd28+/-、cd27+/-、cd3+、cd4+、cd8+、ccr7-、cd45ra-、cd45ro+。效应记忆性细胞还可以是能够产生ifnγ和il-4的细胞。通过本发明的方法扩增的treg细胞可具有以下标记物中的一种或多种：cd4+、cd25+、foxp3+以及cd127阴性/低。
本发明进一步包括用来选择性扩增t调节性细胞的组合物和方法。这些方法包括包含(a)和(b)的那些：(a)将t细胞活体外暴露于cd3和cd28信号，和(b)以容许扩增t调节性细胞的方式培养t细胞。这种cd3和cd28信号可由抗cd3和抗cd28抗体介导。此外，抗cd3和抗cd28抗体可各自在包括0.34至3.4单位的浓度范围的范围内使用。另外，抗cd3抗体可在与抗cd28和/或抗体的浓度相比更低的浓度下使用。
本发明还包括用来选择性地扩增th17细胞的组合物和方法。这种方法包括包含(a)和(b)的那些：(a)将cd3+t细胞活体外暴露于cd3、cd28、cd5和/或icos信号，和(b)以容许扩增th17细胞的方式培养所述cd3+t细胞，其中cd3、cd28、cd5和/或icos的量可以相同或不同。在这种方法中，cd3、cd28以及icos信号可由抗cd3、抗cd28、抗cd5以及抗icos抗体介导。此外，抗cd3、抗cd28、抗cd5以及抗icos抗体针对th17细胞的扩增可在包括约0.06至约1.5单位的浓度范围的范围内使用。另外，抗cd3抗体可在与抗cd28和/或抗icos抗体的浓度相比更低的浓度下使用。
本发明另外还包括用来选择性扩增经抗原刺激过的t细胞的组合物和方法。这些方法包括包含(a)和(b)的那些：将t细胞活体外暴露于cd3、cd28、cd27和/或cd137信号，和(b)以容许扩增经抗原刺激过的t细胞的方式培养所述t细胞。cd3、cd28以及cd27和/或抗cd137信号可由抗cd3、抗cd28、抗cd27和/或抗cd137抗体提供。抗cd3、抗cd28、抗cd27以及抗cd137抗体可在包括0.01至1.5单位的浓度范围的范围内使用。抗cd3抗体可在与抗cd28和/或抗cd137抗体的浓度相比更低的浓度下使用。
本发明还包括组合物，所述组合物包含cd3+(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增t细胞亚群的(a)抗cd3抗体和(b)抗cd28、抗cd137、抗icos或抗cd5抗体。在一些情况下，所存在的(a)抗cd3抗体和(b)抗cd28、抗cd137、抗icos或抗cd5抗体的量可以相同或不同。在特定情况下，t细胞亚群可选自由以下组成的群组：th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。此外，抗cd3、抗cd28、抗cd5、抗icos、抗cd27以及抗cd137抗体可在包括0.01至1.5单位的浓度范围的范围内使用(例如针对记忆性t细胞的扩增)，在包括0.06至1.5单位的浓度范围的范围内使用(例如针对th17细胞的扩增)，或者在包括0.34至3.41单位的浓度范围的范围内使用(例如针对treg细胞的扩增)。在一些情况下，抗cd3抗体可在与抗cd28和抗cd137抗体的浓度相比更低的浓度下使用。
本发明进一步包括组合物，所述组合物包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增th17细胞的抗cd3、抗cd28、抗icos、抗cd5和/或抗cd137抗体，其中所述th17细胞可能能够产生一种或多种效应细胞因子。在一些情况下，珠粒上存在的抗cd3和抗cd28抗体的量可以相同或者不同。此外，所述一种或多种效应细胞因子可以是选自由以下组成的群组中的一种或多种细胞因子：il-17、il-21以及il-22。
本发明包括组合物，所述组合物包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增经抗原刺激过的记忆性t细胞的抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体。在一些情况下，t细胞可能能够识别特异性抗原，并且其中珠粒上存在的抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体的量可以相同或者不同。特异性抗原可选自由以下组成的群组：病毒抗原(例如cmv、ebv、流感、hiv等)、细菌(例如链球菌m-蛋白、奈瑟菌属菌毛、伯氏疏螺旋体脂蛋白vise、类鼻疽伯克氏菌多糖抗原等)、真菌或原生动物的(例如烟曲霉半乳甘露聚糖或土拉热弗朗西丝菌脂多糖等)以及癌症抗原。
本发明还包括组合物，所述组合物包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增调节性t细胞(例如调节性t细胞cd4+cd25+foxp3+cd127低/阴性)的抗cd3和抗cd28抗体。在一些情况下，珠粒上存在的抗cd3和抗cd28抗体的量可以相同或者不同。调节性t细胞活性可包含抑制活性。
本发明还包括组合物和方法，用来(a)治疗有此需要的个体、(b)重建有此需要的个体的免疫系统，以及(c)为有此需要的个体提供过继性免疫疗法。这种方法包含给所述个体施用药学上可接受的组合物，所述组合物包含th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。有此需要的个体可能受到癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病或感染性疾病、移植相关的疾病的影响。此外，示例性的癌症包括肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌以及皮肤癌。炎性疾病可选自由以下组成的群组：糖尿病；类风湿性关节炎；炎性肠病；家族性地中海热；新生儿发作多系统炎性疾病；肿瘤坏死因子(tnf)受体-相关的周期性综合症(traps)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺失(dira)；全身性红斑狼疮；眼色素层炎；以及白塞氏病。
在这种方法(以及本发明的其它方法)中，t细胞可被基因修饰。此外，基因修饰可引起一种或多种嵌合抗原受体或基因修饰的t细胞受体的存在。
本发明还包括用来选择性地改变样品中两种t细胞亚型的比例的组合物和方法。这种方法包括包含将样品与至少两种刺激剂接触的那些，所述样品包含混合t细胞群。在一些情况下，刺激剂为混合群中的t细胞提供不同量的信号。在特定情况下，一种t细胞亚型可相对于第二种t细胞亚型选择性地扩增。此外，样品可包含来自某一个体的血沉棕黄层细胞，以及血沉棕黄层细胞的亚型(例如单核细胞)。此外，所述至少两种刺激信号可刺激cd3和cd28受体。另外，至少一种t细胞亚型可选择性地从混合群去除。在一些方面，可增加tregt细胞相对于混合群中的所有t细胞的比例。这样做的一种方法是通过将细胞与雷帕霉素接触，所述雷帕霉素的量适合从群中除去非treg细胞。在其它方面，可降低样品中记忆性t细胞的总数。此外，刺激信号cd3的量可小于cd28刺激信号的一半。
本发明还包括通过刺激cd3和cd5细胞表面受体来扩增th17细胞的方法。在一些实施例中，本发明包括用来扩增th17细胞的方法，这些方法可包含：(a)将t细胞群活体外暴露于cd3和cd5信号，和(b)在容许扩增th17细胞的条件下培养t细胞群。在本发明的特定实施例中，t细胞群可暴露于一种或多种芳基烃受体激动剂(例如6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑(ficz))和/或可不暴露于外源性白细胞介素-23。在一些情况下，t细胞群是不同t细胞类型的混合群。此外，本发明的方法包括包含将t细胞群与一种或多种极化剂(例如白细胞介素-1β、白细胞介素-23、肿瘤生长因子-β、白细胞介素-6、白细胞介素-21、白细胞介素-2、抗白细胞介素-4抗体和/或抗干扰素γ抗体)接触的那些。
当涉及蛋白使用时，术语“外源性”是指组合物中存在的蛋白而不是组合物中存在的细胞产生的蛋白。例如，样品中存在的t细胞可产生il-2。在这种情况下，外源性添加的il-2是指作为非细胞组成添加到样品中的il-2(例如缓冲液中的il-2)。
在一些实施例中，th17细胞被工程化以表达一种或多种嵌合抗原受体。这些所述一种或多种嵌合抗原受体中的至少一种包括对哺乳动物细胞的细胞表面抗原具有特异性的那些(例如抗原相关的)。
本发明还包括包含cd3信号和cd5信号的组合物，在一些情况下，本发明的组合物可含有一种或多种芳基烃受体激动剂(例如6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑(ficz))、一种或多种细胞因子(例如白细胞介素-1β、白细胞介素-23、肿瘤生长因子-β、白细胞介素-6、白细胞介素-21和/或白细胞介素-2)和/或一种或多种抗体(例如抗白细胞介素-4抗体和/或抗干扰素γ抗体)。在特定情况下，本发明的组合物可含有白细胞介素-1β和白细胞介素-6。组合物(例如以上的那些)可进一步包含t细胞群。此外，本发明的组合物中的cd3信号可以是一种或多种抗cd3抗体。另外，本发明的组合物中的cd5信号可以是一种或多种抗cd5抗体。
本发明的组合物还可包含t细胞群、cd3信号、cd5信号、芳基烃受体激动剂以及一种或多种细胞因子。在特定实施例中，本发明的组合物可包含存在于混合物中的t细胞群，所述混合物包含：(a)“血沉棕黄层”样品，(b)含有大于80％的混合t细胞的白细胞样品，(c)含有大于80％的cd4+t细胞的样品，或者(d)含有大于80％的th17细胞的样品。
本发明进一步涉及对来自混合细胞群(t细胞和非t细胞，例如b细胞)的t细胞进行分离和活化的方法。在一些实施例中，这种方法包含：(a)在容许t细胞与固体载体结合并活化同一t细胞的条件下，将混合细胞群与一种或多种固体载体接触，所述固体载体具有与其结合的至少第一配体，所述第一配体对位于混合细胞群中存在的t细胞上的蛋白具有结合亲和力，和(b)将与固体载体结合的t细胞从未与固体载体结合的t细胞分离，以获得纯化t细胞群。所述一种或多种固体载体可具有与其结合的至少第一配体和/或至少第二配体，其中第一配体和第二配体中的每一个对位于混合细胞群中存在的单独的t细胞上的不同蛋白均具有结合亲和力。此外，第一配体和第二配体可结合到相同的固体载体或不同的固体载体。在一些情况下，第一配体可以是抗cd3抗体或抗cd4抗体。此外，第二配体可以是任何数量的配体，包括选自由以下组成的群组的配体：(a)抗cd5抗体，(b)抗cd28抗体，(c)抗cd137抗体，以及(d)抗icos抗体。此外，本发明的方法包括包含将纯化t细胞群的细胞从固体载体释放(包括将步骤(b)中获得的t细胞从固体载体释放)的那些方法。另外，本发明的方法包括包含一旦从固体载体释放便扩增所释放的t细胞的方法。在许多情况下，所释放的t细胞的扩增会在培养基(例如其中存在一种或多种趋化因子或细胞因子的培养基)中发生。此外，步骤(a)中可存在一种或多种趋化因子或细胞因子。这样一种或多种趋化因子或细胞因子包括选自由以下组成的群组的那些：(a)白细胞介素-1α、(b)白细胞介素-2、(c)白细胞介素-4、(d)白细胞介素-1β、(e)白细胞介素-6、(f)白细胞介素-12、(g)白细胞介素-15、(h)白细胞介素-18、(i)白细胞介素-21以及(j)转化生长因子β1。
本发明的方法还包括用来活化和扩增t细胞的方法。这种方法包括包含将混合t细胞群与(a)和(b)接触的那些：(a)第一试剂，其通过刺激t细胞亚群成员(例如treg细胞、th17细胞等)上的分子为t细胞亚群成员提供初级活化信号，和(b)第二试剂，其刺激t细胞亚群成员上的分子，所述分子与被第一试剂刺激的分子不同。在许多情况下，群中的t细胞(例如t细胞亚群成员)被活化和扩增。在另外的情况下，第一试剂和第二试剂可与一种或多种固体载体结合。此外，t细胞可维持在容许扩增(例如扩增t细胞亚群成员)的条件下。另外，固体载体可在小于120小时的时间段之后断开与t细胞的接触。也就是说，固体载体与t细胞接触有限的时间段，然后断开与t细胞的接触。该时间段可以是从约12小时至约120小时(例如从约12小时至约120小时、从约24小时至约120小时、从约36小时至约120小时、从约48小时至约120小时、从约60小时至约120小时、从约48小时至约96小时、从约60小时至约96小时、从约72小时至约96小时等)。如本文别处所讨论，第一试剂可以是抗cd3抗体。此外，第二试剂也可以是抗体。另外，t细胞可与第三试剂接触，所述第三试剂是抗体或非抗体蛋白(例如趋化因子或细胞因子)。
本文所述的每个方面和实施例能够一起使用，除非从所述实施例或方面的上下文被明确地或清楚地被排除。
附图说明
图1a和1b是显示使用
图2是显示活化10天后cmv特异性记忆性t细胞的扩增倍数的条形图。扩增倍数与增加的信号强度负相关，所述增加的信号强度由与增加量的激动性cd3抗体缀合的
图3a至图3d是显示使用th17-极化条件培养并使用
图4a至图4c是显示使用
图5.中和性抗体的作用。使用cd3/icos珠粒或cd3/cd28珠粒刺激并使用(+)或不使用(-)中和性抗体极化的产生il-17的cd4t细胞(n＝3个供体)的平均％。针对由封闭抗体导致的变动给出的p-值(成对t测试)(nsd，不统计不同的(顶部区块)。单独的结果；单独的供体(a、b、c)和icos相对于cd28刺激(底部区块)。
图6.共刺激对细胞因子产生的影响。使用dynabeads原型cd3/cd28、cd3/cd5或cd3/icos活化的纯化的cd3+t细胞会以不同的效果扩增th17亚型，其中通常cd3/cd5效率最高，随后是cd3/icos，cd3/cd28是效率较低的刺激性原型。cd3/cd5刺激在25至50％的cd4+t细胞中通常会诱导il-17a的产生，在第10至13天进行再刺激时比例高的是多功能性il-17+inf-γ+。
图7.共刺激对表型的影响。通过cd3/cd28、cd3/cd5或cd3/icos刺激的t细胞在扩增后会共表达各种水平的ccr4和ccr6，与cd3/cd28(46％)相比cd3/cd5和cd3/icos刺激产生分数更高的ccr4+ccr6+细胞(77和73％)。
图8.t细胞使用cd3/cd5(上部)或cd3/icos(下部)图活化，并在标准th17-极化细胞因子/抗体(细胞因子包裹)的存在下扩增，或者使用100nmficz和il-1β和il-6活化。在第13天，在对il-17a和il-17f表达进行评估之前，使用pma/伊屋诺霉素刺激培养物4-5小时。流式细胞图显示细胞因子的细胞内表达。
图9a.刺激性
图9b显示如图9a的图例所示制备的细胞活化10天后表达th17相关的表面标记物cd161的cd4+t细胞的分数和绝对数量。
图10a.cd3/cd5分离的t细胞可直接极化和扩增。t细胞使用
图10b.图10a的分离的t细胞在标准th17-极化细胞因子/抗体(tgf-β、il-23、il-6、il-1β、以及αil-4/α-ifn-γ中和性抗体)的存在下同时扩增。活化3天后除去刺激性
具体实施方式
在一些方面，本发明提供(特别)用来选择性扩增特定的t细胞亚群的方法和组合物。这些t细胞亚群包括，但不限于th17细胞、调节性t细胞(treg)以及记忆性t细胞。本文所公开的特定t细胞亚群可用来治疗各种生理状况、疾病和/或疾病状态。
本发明的一些方面
在一些方面，本发明基于用来活化和/或扩增t细胞亚群的信号类型和信号强度。按照这些方面，观察到可通过选择性的细胞表面标记物刺激获得和/或增加混合群中特定的t细胞亚群。进一步观察到，t细胞受体信号的强度变化也可以用来获得特定的t细胞亚群。在许多情况下，t细胞亚群会从混合t细胞群获得(例如从外周血液获得的总的t细胞)。
刺激t细胞受体可对特定的t细胞产生许多影响，例如(1)对t细胞无影响，(2)t细胞活化，(3)t细胞增殖，(4)t细胞极化，(5)t细胞分化(例如记忆性t细胞)，以及(6)在t细胞中诱导凋亡。所产生的影响经常是各种因素的函数，例如所存在的特定的t细胞、刺激信号的性质、当采用多种信号时多种刺激信号(例如两种、三种、四种等信号)的强度比以及t细胞暴露于其的总的信号强度或单独的信号强度。
在许多情况下，t细胞将在受体刺激之前从其它细胞类型分离。这可在一个单独的步骤中或者在多个步骤中进行。示例性的方法如下：(1)对单核细胞进行血沉棕黄层或血液成分单采术分离，(2)使用，例如具有一种或多种cd4受体结合剂的磁性珠粒分离cd4+细胞，以及(3)对荧光活化的细胞进行分选(参见实例1)。
在本发明的一些方面，两种或更多种t细胞信号的比例以会导致选择性地扩增第一组一种或多种t细胞亚群而不是第二组一种或多种t细胞亚群的方式调节。在许多情况下。第一组一种或多种(例如一种、两种、三种、四种、五种等)t细胞亚群将比第二组一种或多种t细胞亚群更小。在一些情况下，第一组一种或多种t细胞亚群可包含单独的t细胞亚群，而第二组一种或多种t细胞亚群可包含存在的所有其它t细胞亚群。在一些情况下，第一t细胞亚群(例如经抗原刺激过的(记忆性)t细胞)将被选择性地扩增而不是第二t细胞亚群(例如初始t细胞)。此外，一种或多种另外的t细胞亚群可与第一t细胞群一起扩增。
在许多情况下，通过刺激第一t细胞受体(例如cd3受体)会产生一个信号，通过刺激第二共刺激t细胞受体(例如cd28受体、cd137受体、cd27受体、cd5受体、cd6受体、icos受体、cd134受体等)会产生另一个信号。信号比可以这样的方式改变：(a)增强特定的t细胞群的扩增，(b)增强另一种t细胞群的消除(例如通过凋亡、抑制细胞生长、通过不具有扩增效果等)，或者(a)和(b)两者。在一些情况下，还可刺激一种或多种另外的t细胞受体，或者可向t细胞提供其它信号。
第一t细胞受体的刺激信号与第二t细胞受体的刺激信号的示例性比例会随着所寻求获得的t细胞亚群而变化，并且可以是从约50∶1至约1∶200(例如约1∶5、约1∶10、约1∶15、约1∶20、约1∶40、从约50∶1至约1∶40、从约50∶1至约1∶30、从约40∶1至约1∶40、从约30∶1至约1∶40、从约40∶1至约1∶20、从约40∶1至约1∶10、从约50∶1至约1∶1、从约50∶1至约5∶1、从约40∶1至约5∶1、从约50∶1至约10∶1、从约50∶1至约15∶1、从约50∶1至约20∶1、从约40∶1至约5∶1、从约30∶1至约3∶1、从约20∶1至约3∶1、从约15∶1至约3∶1、从约10∶1至约5∶1、从约1∶5至约1∶10、从约1∶3至约1∶20、从约1∶8至约1∶25、从约1∶3至约1∶40、从约1∶5至约1∶50、从约1∶10至约1∶50、从约1∶10至约1∶100、从约1∶10至约1∶150、从约1∶10至约1∶200、从约1∶5至约1∶150、从约1∶5至约1∶200等)。
为了说明，由抗cd3抗体和抗cd28抗体提供的信号可以1∶10的比例存在。已经发现，对于一些t细胞亚群的扩增，期望cd3信号的量比第二种信号(例如cd28信号和/或cd137信号)更低。在一些情况下，当提供两种以上的t细胞受体信号时，每种信号的比例可以不同，或者两种或更多种信号的比例可以相同(例如三种中的两种)。作为一个实例，cd3、cd28以及cd137信号可以1∶10∶10的比例存在。当这些信号中的每一种均通过抗体产生时，这通常意味着对于10份抗cd28和抗cd137抗体存在1份抗cd3抗体。这当然假设其同族抗体对三种受体中的每一种的受体刺激的量是相等的。
要考量的一个问题是对含有通过本发明的方法产生的t细胞群的混合物进行表征。在许多情况下，本发明的组合物和方法将涉及改变混合物中特定亚群的t细胞的比例。例如，本发明的方法可导致某些类型的t细胞通过，例如凋亡或稀释从混合群除去。因此，本发明的一个方面涉及混合物中增加或去除的t细胞群的量，以及混合物本身。例如，如果混合物中存在两种t细胞亚群(例如th17t细胞和th1t细胞)并且这些亚群以，例如1∶1的比例存在，那么本发明包括其中一种t细胞亚群相比其它t细胞亚群比例增加的方法。为了说明，所述比例可从约1∶1.5改变为约1∶100,000(例如从约1∶1.5改变为约1∶100,000、从约1∶1.5改变为约1∶80,000、从约1∶1.5改变为约1∶50,000、从约1∶1.5改变为约1∶10,000、从约1∶1.5改变为约1∶5,000、从约1∶2,500改变为约1∶25,000、从约1∶2,500改变为约1∶60,000、从约1∶2,500改变为约1∶80,000、从约1∶2,500改变为约1∶100,000、从约1∶5,000改变为约1∶100,000、从约1∶5,000改变为约1∶80,000、从约1∶5,000改变为约1∶50,000、从约1∶5,000改变为约1∶25,000等)。
此外，本发明涉及用来改变混合物中特定亚群的t细胞的比例的组合物和方法，其中一种t细胞亚群相对于另一种t细胞亚群的比例被增加至少200,000倍(例如从约1,000倍至约200,000倍、从约5,000倍至约200,000倍、从约10,000倍至约200,000倍、从约20,000倍至约200,000倍、从约50,000倍至约200,000倍、从约75,000倍至约200,000倍、从约1,000倍至约120,000倍、从约5,000倍至约120,000倍、从约10,000倍至约120,000倍、从约1,000倍至约80,000倍、从约10,000倍至约80,000倍等)。“倍”所表示的含义的一个实例如下说明。如果两种t细胞亚群以1∶2的初始比例存在，那么将其比例改变为1∶8就是一种t细胞亚群相对于另一种t细胞亚群的2倍增加。
可导致选择性扩增单独的t细胞亚群的另一个因子是刺激信号强度。通过“刺激信号强度”是指以每个t细胞为基础的总的信号强度。这包括群中的每个t细胞暴露于其的各种信号(例如刺激第一t细胞表面受体的信号、刺激第二t细胞表面受体的信号、刺激第三t细胞表面受体的信号等)和组合的信号的强度。因此，本发明还涉及各种t细胞亚群的混合物中每个细胞接收到的刺激信号的量。刺激信号可通过改变刺激剂浓度、其比例或者包含所述刺激剂的表面与细胞计数的比例来调节。在刺激剂基于珠粒的实施例中，可改变珠粒：细胞比。珠粒：细胞比可包含约1∶5,000、约1∶2,500、约1∶1000、约1∶500、约1∶250、约1∶100、约1∶90、约1∶80、约1∶70、约1∶60、约1∶50、约1∶40、约1∶30、约1∶10、约1∶9、约1∶8、约1∶7、约1∶6、约1∶5、约1∶4、约1∶3、约1∶2、约1∶1、约2∶1、约3∶1、约4∶1、约5∶1或约8∶1、约10∶1或约15∶1珠粒/细胞。
在一些情况下，可向t细胞群添加一种或多种细胞因子。在许多情况下，il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、il-21、il-23、ifn-γ以及tgf-β。当th17极化是所期望的时，可使用一种或多种以下细胞因子：il-1β抗体、il-6抗体、tgf-β抗体、il-21抗体、il-23抗体以及抗il-4中和性抗体和抗ifn-γ中和性抗体。此外，il-1β抗体、il-6抗体、tgf-β抗体、il-23抗体以及抗il-4中和性抗体和抗ifnγ中和性抗体的信号可用来选择性扩增th17细胞。
表1显示可使用本发明的方法获得的许多不同的t细胞亚型。表1显示可用来选择性扩增特定类型的t细胞的各种信号。
特别地，本发明包括用来选择性扩增一种或多种t细胞亚群的方法。这种方法导致样品中特定的t细胞增加或去除。作为一个实例，cd3和cd28受体与白细胞介素-2一起刺激初始t细胞、记忆性t细胞、th1t细胞以及调节性t细胞(treg)。已经显示，初始t细胞可被扩增，同时记忆性t细胞可通过调节总的cd3/cd28刺激从样品去除(参见美国专利第8,617,884号，其公开内容通过引用并入本文)。关于本发明的一个方面现在已经显示，可通过调节信号比和总的信号强度选择性地扩增不同的t细胞亚群。作为一个实例，当cd3信号比cd28信号低时treg细胞会良好扩增(参见图1a)。对选择性的扩增条件的确认可用来增加样品中一种t细胞亚群成员与一种或多种其它t细胞亚群成员的比例，即使在各种t细胞亚群的各种细胞响应于相同的刺激而扩增的情况下。为了说明，假定tregt细胞占混合群的1％并且初始t细胞、记忆性t细胞分别占同一混合群的1.5％、3％，可调节刺激信号以诱导消除记忆性t细胞，同时选择性地扩增tregt细胞。最终结果可以是其中tregt细胞占40％而初始t细胞、记忆性t细胞以及th1t细胞分别占混合群的2％、0.5％以及2.5％。
可用来选择性增加或去除一种或多种t细胞亚型(例如cd4+cd25+foxp3+调节性t细胞、cd4+cd25+foxp3-调节性t细胞、cd4+cd25-t细胞等)的另外的因子是雷帕霉素。
哺乳动物免疫系统
哺乳动物免疫系统使用两个一般适应机制来保护机体免受环境病原体的影响。当遇到来自病原体的分子时，免疫响应被高度激活，以确保保护免受该病原体有机体的影响。
第一机制是非特异性(或固有)炎性响应。固有免疫系统可识别病原体上存在但机体本身不存在的特异性分子。第二机制是特异性或获得性(或适应性)免疫响应。针对有关病原体对适应性免疫响应进行常规调节。适应性免疫系统响应于病原体中存在的许多不同分子(称作抗原)而产生特异性免疫球蛋白(抗体)。另外，对种类繁多的t细胞受体取样以测试它们结合加工形式的抗原的能力，所述加工形式的抗原与树突状细胞(dc)这样的抗原提呈细胞(apc)上的i类和ii类mhc结合。
免疫系统识别自身蛋白与非自身蛋白之间的结构差别并对其作出响应。免疫系统识别为非自身的蛋白称作抗原。病原体通常表达大量高度复合的抗原。获得性免疫对抗原结构具有特异性记忆；重复暴露于相同抗原会增加响应，这会增加所诱导的针对该特定病原体的保护水平。
获得性免疫由称作b淋巴细胞和t淋巴细胞(或简称b细胞和t细胞)的专用免疫细胞介导。b细胞通过抗体作用产生并介导其功能。b细胞依赖性免疫响应称作“体液免疫”，这是由于在体液中检测到抗体。t细胞依赖性免疫响应称作“细胞介导的免疫”，这是由于效应活性通过效应t细胞的局部作用直接介导。效应t细胞的局部作用通过t细胞与活化巨噬细胞这样的次级效应细胞之间的协同增效作用被放大。结果是病原体被杀死并防止其导致疾病。
免疫细胞可获得用于活化的特别刺激。例如，使用抗cd3/cd28会为一些t细胞群提供活化信号。据信，初始t细胞需要至少两种信号用来活化。第一种信号是抗原特异性的，并且通过由抗原提呈细胞(apc)提呈并通过t细胞受体(tcr)/cd3复合物接收的肽/主要组织相容性复合物(mhc)复合物诱发。对于一些t细胞亚群，第二种信号可通过抗原提呈细胞传递，并且其受体的候选分子之一是t细胞抗原cd28。据认为，当tcr/cd3和cd28t细胞受体均被适当的配体占据时，t细胞受到刺激后增殖并产生il-2(t细胞增殖必需的一种细胞因子)，而仅t细胞受体被占据则有利于t细胞无反应性或凋亡。
体外已经显示，可通过用固定到固相(例如珠粒或组织培养板)的抗cd3抗体培养t细胞并添加可溶性cd28抗体来刺激t细胞生长和细胞因子的产生(sommer等人，《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol.)》23：2498-2502(1993))，sunder-plassmann等人，《血液(blood)》87：5179-5184(1996))。最近已经显示，将cd3和cd28抗体共同固定到相同固相或不同固相也可以诱导t细胞增殖(levine等人，《免疫学杂志(j.ofimmunol.)》159：592130(1997)；li等人，《科学(science)》283：848-851(1999))。
本发明容许技术人员以可靠、有效且高效的方式产生各种t细胞亚群，并将扩增的t细胞亚群用于不同目的，包括，但不限于治疗目的和研究/发现目的。如以下所进一步讨论，t细胞亚群包括，但不限于调节性t细胞、th17细胞以及经抗原刺激过的记忆性细胞。
调节性t细胞
本发明的方面涉及用来有效产生调节性t细胞(或“t调节性细胞”或“treg”)的方法，以及这些方法在可应用于，例如免疫疗法的t细胞群的产生中的用途。treg细胞可通过cd4+、cd25+、foxp3+、cd127阴性/低这样的标记物进行表征。在一些情况下，使用本发明的组合物和方法扩增的treg细胞将是cd4+、cd25+、foxp3-。在aarvak等人的美国专利第9,119,807号中给出了用来产生foxp3-调节性t细胞的组合物和方法。
天然存在的调节性t(treg)细胞负调节其它t细胞(包括效应t细胞)以及固有免疫系统细胞的活化，并且可用于针对自身免疫性疾病的免疫疗法并提供移植耐受性。已经描述了各种treg细胞群，包括天然存在的cd4+cd25+foxp3+细胞，以及分别分泌il-10和tgf的诱导的tr1和th3细胞。
treg细胞通过效应t细胞响应的持续抑制进行表征。传统的或常规的treg细胞可，例如在脾脏或淋巴结中或者在循环中找到。treg在鼠类模型中被证明在预防gvhd和自身免疫上高度有效。在移植、糖尿病和其它适应症的治疗中过继性转移treg的临床实验正在进行。treg在外周血液中的相对频率大约为总淋巴细胞的1至2％，表明了在过继性转移之前活体外扩增treg对于大多数临床应用的必要性。在活体外扩增过程中产生足够的treg是人类treg疗法应用中的一个主要挑战。
th17细胞
t辅助性17细胞(或“th17细胞”或“th17辅助性细胞”)是调节宿主防御的cd4+辅助性t细胞的炎性亚型，并且涉及组织发炎和各种自身免疫性疾病。已经在各种人类肿瘤中发现了th17细胞，但是它们在癌症免疫中的功能尚不清楚。当过继性转移到带有肿瘤的小鼠中时，发现th17细胞在根除黑色素瘤上比th1或非极化的(th0)t细胞更有效力(muranski等人，《血液(blood)》.112：362-373(2008))。th17细胞在发育上与th1和th2细胞系不同。th17细胞是会响应il-1r1和il-23r信号转导并产生细胞因子il-17a、il-17f、il-17af、il-21、il-22、il-26(人类)、gm-csf、mip-3α以及tnfα的cd4+细胞。th17细胞的表型是cd3+、cd4+、cd161+。使用用于过继性细胞转移的th17细胞的一个障碍是确定可扩增th17细胞亚型以及其体内不稳定表型的鲁棒培养条件(肿瘤微环境)。
本发明(部分)涉及用来产生特定的t细胞亚型的组合物和方法。可使用本发明的组合物和方法产生的一个特定的t细胞亚型是th17细胞。因此，在一些方面，本发明涉及使用cd3信号转导(例如通过抗cd3抗体)和cd5信号转导(例如通过抗cd5抗体)、一种或多种细胞因子和中和性抗体(例如抗il-4抗体和抗ifnγ抗体)扩增(例如选择性扩增)th17细胞的组合物和方法。在一些情况下，用来选择性扩增th17细胞的组合物和方法以会降低一种或多种中和性抗体的量或者消除一种或多种中和性抗体的方式调节。
许多t细胞的一个问题是其可塑性。也就是说，一些t细胞可改变为不同的亚型。另外，这一t细胞的变化经常由周围环境中的t细胞介导。例如，许多t细胞亚型会表达il-4和/或ifnγ。这些蛋白对周围的t细胞具有生理影响，并且在一些情况下介导一种类型t细胞向另一种类型t细胞的分化。
像th17细胞这样的t细胞亚型的扩增(例如选择性扩增)可通过使用一种或多种信号、调节一种或多种信号的强度、调节两种或更多种信号之间的强度比例以及消除一种或多种信号来进行。各条件可基于两个参数或两个以上的参数的比例进行选择。两个实例如下：(1)可调节cd3信号和cd5信号的比例，并且(2)可调节cd3信号和cd5信号的比例，可与总的cd3信号和cd5信号的调节结合。举例来说，当期望扩增th17细胞时，可选择两种信号以供使用(例如cd3信号和cd5信号)。这些信号可以，例如从约1∶1至约1∶50(例如从约1∶1至约1∶50、从约1∶1至约1∶30、从约1∶1至约1∶20、从约1∶1至约1∶15、从约1∶5至约1∶15、从约1∶5至约1∶20、从约1∶8至约1∶12、从约1∶8至约1∶15、从约1∶8至约1∶20等)的比例调节。
本发明还包括芳基烃受体(ahr)拮抗剂用于扩增t细胞(例如th17t细胞)的用途。已经发现，th17t细胞可通过将t细胞暴露于cd3信号(例如激动性抗cd3抗体)、cd5信号(例如激动性抗cd5抗体)、il-1β、il-6以及ahr激动剂(例如ficz)来扩增。
可用来实践本发明的示例性的ahr配体包括，但不限于ficz(6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑)、dficz(6，12-二甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑)、2，3，7，8-四氯二苯并-p-二恶英(tcdd)、2-(1′h-吲哚-3′-羰基)-噻唑-4-甲酸甲酯(ite)、栎精、吲哚-3-甲醇、白藜芦醇、姜黄素、m50367{3-[2-(2-苯基乙基)苯并咪唑-4-基]-3-羟基丙酸以及vaf347{[4-(3-氯-苯基)-嘧啶-2-基]}、靛蓝染料和靛玉红这样的色氨酸衍生物、胆红素这样的四吡咯以及花生四烯酸代谢物脂氧素a4和前列腺素g。
在一些情况下，本发明包括用来扩增th17细胞的组合物和方法，其中t细胞暴露于以下试剂：一种或多种激动性抗cd3抗体、一种或多种激动性抗cd5抗体以及一种或多种ahr激动剂(例如ficz)。在一些情况下，还可使用一种或多种细胞因子。示例性的细胞因子包括il-1β和il-6。因此，在一些情况下，t细胞暴露于一种或多种激动性抗cd5抗体、一种或多种ahr激动剂(例如ficz)、il-1β以及il-6。
在一些情况下，本发明包括用来扩增th17细胞的组合物和方法，其中t细胞暴露于以下试剂：一种或多种激动性抗cd3抗体、一种或多种激动性抗cd5和/或抗cd28抗体以及一种或多种细胞因子。示例性的细胞因子包括tgf-β、il-1β、il-6以及il-23。因此，在一些情况下，t细胞暴露于一种或多种激动性抗cd3抗体、一种或多种激动性抗cd5和/或抗cd28抗体、tgf-β、il-1β、il-6以及il-23。
因此本发明包括用来扩增th17细胞的组合物和方法，其中起始t细胞群的细胞未暴露于tgf-β和/或il-23。
用来实施本发明的t细胞群可例如存在于：(i)“血沉棕黄层”样品中，(ii)去除了非t细胞的白细胞样品(例如含有大于80％的混合t细胞的样品)中，(iii)cd4+t细胞样品(例如含有大于80％的cd4+t细胞的样品)中，或者主要含有th17细胞的样品(例如含有大于80％的th17细胞的样品)中。因此，在一些情况下，本发明的方法涉及一种或多种t细胞亚群的选择性扩增。
关于用来扩增th17t细胞的特定制剂，以及相关的扩增方法，各条件通常会被调节为获得高水平的th17细胞扩增。
可被调节的一个因子是cd3信号(例如激动性抗cd3抗体)与cd5信号(例如激动性抗cd5抗体)的比例。在许多情况下，cd3信号的量将比cd5信号低。示例性的cd3与cd5信号的比例包括从约1至约1.5、从约1至约2、从约1至约3、从约1至约5、从约1至约8、从约1至约10、从约1至约12、从约1至约15、从约1至约20、从约1至约25、从约1至约30、从约1至约40、从约1至约50、从约1至约75、从约1至约100等的比例。
可用来实践本发明的示例性的抗体包括bc3抗cd3抗体和ucht2抗cd5抗体，bc3抗cd3抗体是一种表达该抗体的克隆，可从美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection)(hb-10166)获得，ucht2抗cd5抗体可从许多来源获得，包括加利福尼亚州圣地亚哥的ebioscience有限公司。
抗体总体上在特异性和对关联配体的亲和性上往往会有所变化。因此，cd3和cd5信号的比例可被调节为等于bc3抗体和ucht2抗体的比例。也就是说，以上提及的比例，部分涉及与从bc3抗体和ucht2抗体得到的数据有关，这些抗体的比例会产生对t细胞的生理影响。因此，可使用其它cd3和cd5信号，并且可调节这些其它信号的量以获得相同的生理影响。换句话说，本发明包括各种cd3和cd5信号转导因子，所述信号转导因子可获得以上给出的bc3抗体和ucht2抗体的比例的相同的生理影响。这种生理影响可通过本文中别处(例如实例10，以及与其相关的数据)所述的方法测量。
本发明的组合物中可存在除了cd3和cd5信号转导因子之外的试剂，并且可将其用于本发明的方法。这些另外的试剂中的一些包括ahr激动剂(例如ficz)、细胞因子(例如il-1β和il-6)以及一种或更多种中和抗体(例如抗αil-4和抗α-ifn-γ中和性抗体)。可调节试剂以获得，例如图8所示结果。特别地，所采用的ahr激动剂和细胞因子的量通常在从约1nm至约1mm(例如从约1nm至约800nm、从约1nm至约500nm、从约1nm至约250nm、从约25nm至约1mm、从约25nm至约500nm、从约25nm至约300nm、从约50nm至约300nm、从约75nm至约500nm、从约75nm至约300nm等)的范围内。
记忆性t细胞
记忆性t细胞或经抗原刺激过的细胞，在之前遇到抗原时经受过抗原。这些t细胞是长寿的，可识别抗原并快速且强烈地影响对它们之前已经暴露于其的抗原的免疫响应。记忆性t细胞可包括：干细胞样记忆性细胞(tscm)、中枢记忆性细胞(tcm)、效应记忆性细胞(tem)。tscm细胞具有表型cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+以及il-7ra+，但是它们还表达大量的il-2rβ、cxcr3以及lfa-1。tcm细胞表达l-选择素和ccr7，它们分泌il-2，但是不分泌ifnγ或il-4。tem细胞不会表达l-选择素或ccr7，但是会产生ifnγ和il-4这样的效应细胞因子。
本发明提供用来选择性扩增以上t细胞亚群的方法和组合物。现有方法不容许本领域技术人员以本文所述方式选择性地扩增特定的t细胞亚型。尽管可通过改变标准
i.定义
除非本文中另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
用于本发明的方法的抗体可以是任何种、类或亚型，只要这种抗体可与目标靶点(例如cd3、tcr或cd28，如果合适的话)反应。
因此用于本发明的“抗体”包括：
(a)各种类或子类的免疫球蛋白的任一者(例如从任何动物得到的igg、iga、igm、igd或ige，例如常规使用的任何动物，例如绵羊、兔、山羊、小鼠、骆驼或蛋黄)，
(b)单克隆或多克隆抗体，
(c)单克隆或多克隆的完整抗体或抗体片段，所述片段是含有抗体的结合区域的那些，例如缺少fc部分的片段(例如fab、fab′、f(ab′)2、scfv、vhh片段，或其它单结构域抗体)，通过对连接完整抗体中的重链组分的二硫键进行还原切割获得的所谓“半分子”片段。fv可定义为含有表达为两个链的轻链可变区和重链可变区的片段。
(d)通过重组dna或其它合成技术产生或修饰的抗体，包括单克隆抗体、抗体片段、“人源化抗体”、嵌合抗体或者合成制造的或改变的类抗体结构。
还包括功能性衍生物或抗体“等同物”，例如单链抗体、cdr-移植的抗体等。单链抗体(sca)可定义为基因工程化的分子，所述分子含有通过合适的多肽接头连接的轻链可变区、重链可变区作为融合的单链分子。还包括可以是单价或二价的vhh抗体。
抗体片段以及合成的和衍生化的抗体的制备方法在本领域中是众所周知的，并且在文献中进行了广泛描述，在本文中未进行描述。
如本文所使用，术语“活化”是指经过足够的t细胞表面基团连接以诱导可测量的形态、表型和/或功能性变化之后的细胞状态。在t细胞的情况中，这种活化可以是被充分刺激以诱导细胞增殖后的t细胞状态。t细胞的活化还可诱导细胞因子的产生和/或分泌，以及受体或粘附分子这样的细胞表面分子的表达的上调或下调，或者某些分子的分泌的上调或下调和调节性效应物功能或细胞溶解效应物功能性能的上调或下调。在其它细胞的情况中，该术语意指特定物理化学过程的上调或下调。
如本文中关于抗体所使用，术语“单位”与抗cd3介导的生理影响相关联。特别地，0.34单位的抗cd3是当在3.4单位的抗cd28的存在下与混合t细胞群接触时会在14天后导致treg细胞扩增1000倍的抗体的量(参见实例2和图1)。单位通过所存在的抗体分子的数量来定义。因此，在以上情况中，抗cd28分子比抗cd3分子多10倍
如本文所使用，术语“刺激”是指通过细胞表面基团的连接诱导的初次响应。例如，在受体的情况中，这种刺激需要受体的连接和随后的信号转导事件。至于t细胞的刺激，这种刺激是指t细胞表面基团的连接，在一个实施例中这会随后诱导信号转导事件，例如结合tcr/cd3复合物。此外，所述刺激事件可活化细胞，并上调或下调受体或粘附分子这样的细胞表面分子的表达，或者上调或下调分子的分泌，例如下调肿瘤生长因子β(tgf-β)。因此，细胞表面基团的连接，甚至在不存在直接信号转导事件的情况下，可导致细胞骨架结构的重组，或者导致细胞表面基团的结合，其各自均可用来增强、修改或改变随后的细胞响应。
如本文所使用，术语“因子”、“配体”或“刺激剂”是指与一种或多种所定义的细胞群(例如t细胞亚群成员)结合并诱导细胞响应的分子。所述因子可与任何细胞表面基团结合，例如目标细胞群上存在的受体、抗原决定簇或其它结合位点。所述因子可以是蛋白、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如，小分子)等等。在本说明书中以及在t细胞刺激的情况中，抗体用作这种因子的原型实例。
如本文中关于t细胞所使用，术语“选择性的扩增”和“选择性地扩增”是指某些t细胞在其它t细胞不会扩增或者以较低的速率扩增的条件下扩增的能力。作为一个实例，假设t细胞亚型1和2分别以存在的总的t细胞的5％和10％的百分比存在于混合群中。如果某些条件导致t细胞亚型1占所存在的总的t细胞的30％，t细胞亚型2占所存在的总的t细胞的12％，那么t细胞亚型1相对于t细胞亚型2被选择性地扩增，即使t细胞亚型2现在是总的t细胞群的更大部分。t细胞亚型2相对于混合t细胞群的一般成员被选择性地扩增，在某种意义上是按照t细胞总的百分比，t细胞亚型2以增加的“频率”存在。因此，选择性的扩增涉及特定的t细胞亚型相对于一般t细胞群的扩增，并且通常会导致t细胞亚型也扩增。以上实例可称作选择性扩增t细胞亚型1的条件，尽管t细胞亚型2也扩增。
如本文所使用，术语“暴露”是指带入非常接近或直接接触的状态或条件中。
如本文所使用，术语“增殖”意思是通过产生新的细胞来生长或繁殖。
“对象”可以是脊椎动物、哺乳动物或人类。哺乳动物包括，但不限于农畜、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠以及大鼠。在一个方面，对象是人类。“对象”可以是“患者”(例如在医师的护理下)，但是在一些情况下对象不是患者。
如本文所使用，“共刺激信号”是指一种信号，其与tcr/cd3连接这样的初级信号结合会导致t细胞增殖和/或活化和/或极化。
如本文所使用，“分离”包括大致将一种组分从另一种中纯化的任何手段(例如通过过滤、亲和性、浮力密度或磁性吸引)。
如本文所使用，“表面”是指能够具有与其连接的因子的任何表面，并且非限制性地包括金属、玻璃、塑料、共聚物、胶体、脂质、细胞表面等等。基本上为能够保持与其结合或连接的因子的任何表面。
如本文所使用，单数术语“一个(a或an)”、“一种(a或an)”以及“所述(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另外指出。
如本文所使用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等等是指减轻或缓解紊乱和/或与其相关的症状。应理解，尽管并不排除，治疗紊乱或状况不要求紊乱、状况或与其相关的症状被完全消除。
ii.产生t细胞亚群的方法
本发明的方法可用来选择性地扩增一种或多种基本上纯的特定的t细胞亚群。示例性的t细胞亚群包括，但不限于treg细胞、th17细胞以及记忆性t细胞。本文公开了扩增的t细胞亚群的实例用途。
混合t细胞群的来源
混合t细胞群的起始来源可以是可从对象分离的血液(例如循环血液)。循环血液可从一个或多个血液单元获得，或者从血液成分单采术或白细胞去除术获得。血液成分单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞以及血小板。t细胞可从许多来源获得，包括血液单核细胞、骨髓、胸腺、组织活体切片、肿瘤、淋巴结组织、消化道相关的淋巴组织、粘膜相关的淋巴组织、脾脏组织或任何其它淋巴组织以及肿瘤。t细胞可从t细胞系获得，也可以从自体的或同种异体的来源获得，包括脐带血。t细胞还可从异种来源获得，例如从小鼠、大鼠、非人类灵长类动物以及猪获得。
在本发明的某些实施例中，t细胞可使用任何数量的技术人员已知的技术(例如菲科尔分离)从自对象收集的血液单位获得。t细胞可从对象的循环血液分离。血液可通过血液成分单采术或白细胞去除术从对象获得。血液成分单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞以及血小板。在暴露于致敏组合物以及随后的活化和/或刺激之前，t细胞的来源从对象获得。在一些实施例中，可将通过血液成分单采术收集的细胞洗涤以除去血浆成分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，以便进行随后的处理步骤。在本发明的一些实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤。在一个可替代的实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或者可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子。本领域普通技术人员应容易地理解，洗涤步骤可通过本领域人员已知的方法实现，例如使用半自动化“连续流”离心机(例如cobe2991细胞处理器，百特(baxter))根据生产商的说明书实现。洗涤之后，可将细胞再悬浮于像(例如)不含钙(ca)、不含镁(mg)的pbs这样的各种生物相容的缓冲液中。可替代地，将血液成分单采术样品中不希望的组分除去，并将细胞直接再悬浮于培养基中
在其它实施例中，通过裂解或除去红细胞并去除单核细胞(例如通过percolltm梯度离心分离)将t细胞从外周血液淋巴细胞分离。一个特定的t细胞亚群可通过正选择或负选择技术进一步分离。
在一些实施例中，可针对cd3+细胞对t细胞进行正选择。可使用本领域技术人员已知的任何选择技术。一个非限制性实例是流式细胞分选。在另一个实施例中，t细胞可通过使用与抗cd3抗体结合的固体载体培育来分离。一个非限制性实例是抗cd3/抗cd28-缀合的珠粒，例如
另外，t细胞亚群可通过根据一种或多种标记物存在还是不存在进行选择来产生。例如，treg细胞可根据cd4+、cd25+、cd127阴性/低以及任选的foxp3+细胞的选择从混合群获得。在一些情况下，treg细胞可以是foxp3-。在这一情况下，选择实际上是指根据一种或多种可定义的特征对细胞进行“选择”。此外，选择可以是正的或负的，就是说细胞可具有一种或多种特征(正的)，或者细胞不具有一种或多种特征(负的)。
至于treg细胞，为了说明，可通过将这些细胞与具有与其连接的结合到cd4和/或cd25的抗体的表面(例如磁性珠粒)结合并将非treg细胞与具有与其连接的结合到cd127的抗体的表面(例如磁性珠粒)结合，以从混合群获得这些细胞。作为一个特定实例，具有与其结合的结合到cd3的抗体的磁性珠粒可用来分离cd3+细胞。一旦被释放，那么所获得的cd3+细胞便可与具有与其结合的结合到cd4的抗体的磁性珠粒接触。然后所得cd3+、cd4+细胞可与具有与其结合的结合到cd25的抗体的磁性珠粒结合。然后所得cd3+、cd4+、cd25+细胞可与具有与其结合的结合到cd127的抗体的磁性珠粒结合，其中所收集的细胞是不会与珠粒结合的那些。
在一些情况下，可同时使用多种特征来获得t细胞亚群(例如treg细胞)。例如，还可使用含有与其结合的结合到两种或更多种细胞表面标记物的抗体的表面。作为一个特定实例，可通过将这些细胞与具有与其连接的结合到cd4和cd25的抗体的表面结合，以从混合群获得cd4+、cd25+细胞。同时选择多种特征可能会产生许多与目标细胞类型“共纯化”的不希望的细胞类型。之所以如此，是因为使用以上特定实例，除了cd4+、cd25+细胞之外还可获得cd4+、cd25-以及cd4-、cd25+细胞。
流式细胞仪对于根据期望的特征来分离细胞特别有用。细胞可根据与结合到目标细胞的分子相关的可检测标记(例如天然配体，诸如结合到cd127的il-7，一种对cd25等具有特异性的抗体)来分离。因此，可通过流式细胞仪系统检测和/或分化的与细胞组分结合的配体可用来纯化/分离具有特定特征的t细胞。此外，存在或不存在多种特征可通过流式细胞仪来同时确定。
因此本发明包括用来获得一种或多种t细胞亚群成员的方法，其中t细胞亚群成员通过特定特征来识别，并通过这些特征的不同从细胞分离。可用于本发明的方法的特征的实例包括存在或不存在以下蛋白：cd3、cd4、cd5、cd8、cd11c、cd14、cd19、cd20、cd25、cd33、cd34、cd45、cd56、cd123、cd127、cd278、cd335以及foxp3。
与寻求获得的细胞相关的特征的选择会随着特定样品中存在的细胞而变化。例如，已经显示脐带血(ucb)含有treg细胞，所述treg细胞可减轻移植物抗宿主病的影响。但是，ucb含有外周血液中通常不具有的细胞比例。ucb中存在的一个类别的细胞是造血干细胞(hsc)。hsc通常是cd34+，其可通过与具有与其结合的合适的配体的表面结合或者通过与cd4+、cd25+和/或cd34+的一种或多种结合的标记分子从cd4+、cd25+细胞分离。
因此本发明涉及用来纯化细胞的组合物和方法，其中混合物中目标细胞的数量被增加至少5倍(例如从约5倍至约50倍、从约10倍至约50倍、从约15倍至约50倍、从约20倍至约50倍、从约25倍至约50倍、从约10倍至约40倍、从约10倍至约30倍等)。纯化的一个实例是一个细胞类型在纯化之前占混合群中总细胞的5％，并且在纯化之前占混合群中总细胞的25％。这是一个5倍纯化的实例。
从图10a和图10b可以看出，cd3/cd5分离的t细胞可被直接极化和扩增。用于th17极化方案的一种起始材料是cd3或cd4富集的细胞(正分离或负分离)。
上游分离费力且昂贵，并且会使产生th17的过程复杂化。已经发现，cd3/cd5珠粒(与用于th17极化的相同)以与使用
本发明还涉及用来同时活化和纯化t细胞的组合物和方法。这种组合物和方法的一个实例包括形成含有磁性珠粒的混合物，所述磁性珠粒具有与其结合的抗cd3和抗cd5抗体，其中反应混合物包括th17t细胞。在这一情况下，th17t细胞可通过抗cd3和抗cd5抗体活化，并从不含cd3和/或cd5表面标记物的其它细胞分离。当然，除cd3和cd5之外的蛋白，以及蛋白的各自组合(例如cd3和cd28；cd3、cd28以及cd137；cd3和cd137；cd3和cd278等)可用来活化和纯化t细胞。
此外，已经发现，当使用磁性珠粒来同时活化和纯化t细胞时，可调节珠粒与细胞的比例来提高纯化效率。例如，发现使用
通过以上方法获得的纯化t细胞可以为混合类型，或者可以是特定类型(例如treg细胞)。例如，cd3和cd28蛋白存在于许多不同的t细胞亚型的表面上。因此，使用抗cd3和抗cd28抗体纯化的t细胞通常是混合群。特定的t细胞亚型可使用另外的因子(例如趋化因子、细胞因子或其它因子(例如雷帕霉素、芳基烃受体激动剂等))从这种混合群扩增出。因此，可通过调节活化和/或扩增条件使用纯化的混合t细胞群来产生一种或多种亚型的t细胞。
例如，th17细胞可通过如下的过程纯化、活化以及扩增。t细胞可使用与固体载体结合的抗cd3抗体或抗cd4抗体从混合细胞群纯化(正分离)。收集与固体载体结合的细胞并将其暴露于含有抗cd3抗体和抗cd5抗体的固体载体。与这些珠粒结合的t细胞从未结合细胞分离，然后暴露于促进th17细胞极化的因子(例如il-1β、il-6、芳基烃受体拮抗剂等)。然后将t细胞保持在容许th17细胞扩增的条件下。在一些情况下，其它t细胞可在所使用的条件下扩增。通常将条件调节为使得th17细胞比其它t细胞亚型扩增地更快。
扩增和/或增殖为各种t细胞亚群
从对象分离的混合t细胞群可通过使用初级因子改变其对初级活化信号的暴露而被扩增为各种t细胞亚群。所述初级活化信号是抗cd3，并且可使用抗cd3初级因子(例如抗cd3抗体或具有对cd3的结合特异性的其它因子)获得。初级活化信号可与第二试剂和/或第三试剂组合使用，第二试剂和/或第三试剂可指向cd28、ctla-4、cd137、cd27、cd5、cd6、cd134、cd2、lfa-1、cd40、slam、gitr和/或icos。
本发明的细胞可通过在培养物中使用如以上和本文中所述的因子培育来扩增。本发明的组合物包含特定的t细胞扩增因子，其以确定的比例缀合到一个表面上。本发明的t细胞扩增因子可与一种或多种共刺激信号一起存在。t细胞扩增因子与共刺激信号的比例可以是1∶1,000、约1∶500、约1∶100、约1∶50、约1∶40、约1∶30、约1∶20、约1∶10、约1∶5、约1∶4、约1∶3或约1∶2。在一些实施例中，两种或更多种共刺激信号可以，例如1∶1,000∶1,000、约1∶500∶500、约1∶100∶100、约1∶50∶50、约1∶40∶40、约1∶30∶30、约1∶20∶20、约1∶10∶10、约1∶5∶5、约1∶4∶4、约1∶3∶3或约1∶2∶2的比例存在。在一些实施例中，可存在另外的共刺激信号。在一些实施例中，单独的共刺激信号与初级信号的比例可以不同(例如初级信号与共刺激信号的比例为1∶4∶3)。此外，信号与细胞的比例可通过选择性扩增应用的信号总量来控制。例如，在与珠粒结合的刺激信号中，可改变珠粒：细胞比。
在一个实施例中，分离的t细胞通过包含表面作用因子的珠粒扩增。分离的t细胞可通过以每细胞约1个珠粒的比例用本发明的珠粒或其它组合物培育来活体外活化和扩增。在其它实施例中，珠粒可在培养物中用来以每珠粒约100个细胞的比例、每珠粒约10个细胞的比例、每珠粒约5个细胞的比例、每珠粒约2个细胞的比例、每细胞约2个珠粒的比例、每细胞约5个珠粒的比例、每细胞约10个珠粒的比例或者每细胞约100个珠粒的比例活化和扩增t细胞。
珠粒：细胞比、总浓度和/或共刺激信号的相对比例可各自被调节，以获得最大增加倍数、扩增细胞群中目标细胞类型的百分比或者目标细胞类型的相对数量。与总细胞群相比，所得细胞群可包含约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％的目标细胞类型。目标细胞类型的相对数量定义为目标细胞的分数乘以总细胞群的扩增倍数。目标细胞类型的相对数量可包含约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约350、约400或约500。
对于treg，刺激方法可在其它细胞(例如cd4+、cd25+细胞这样的其它t细胞，其本身在本发明的方法过程中可更大程度地增殖)的存在下进行。因此在以上所述方案中，分离t细胞的步骤可包含分离很大一部分的(即至少约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80或约90％)或所有的cd4+细胞，即其包括来自样品的两种cd25+。因此在本发明的一个实施例中，分离步骤包含分离cd4+细胞。此外，还可存在其它细胞，以便treg、th17或记忆性t细胞在分离步骤之前或之后仅形成用于刺激方法的细胞的一部分。因此在刺激步骤中，cd4+、cd25+可作为经受刺激的细胞的一部分存在，即可使用富集制备物，例如包含至少约50、约60、约70、约80或约90％的经受刺激的总细胞的制备物。
在一些情况下，至少一部分cd4-、cd25-细胞不存在，例如至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％的起始材料中显现的细胞不存在。可替代地，用于刺激/扩增的起始细胞可基本上全部是cd4+、cd25+细胞，例如至少约80％、约90％、约95％或约98％的cd4+、cd25+细胞。
刺激t细胞以选择性地扩增treg细胞可包括通过抗cd3和抗cd28因子来刺激。在一些方面，与之前的抗cd3/cd28共刺激方法相比，本发明利用低的抗cd3抗与cd28的比例，以便抗cd3因子以比抗cd28因子更低的程度存在。抗cd3与抗cd28的比例可以是约1∶1，000、约1∶500、约1∶100、约1∶50、约1∶40、约1∶30、约1∶20、约1∶10、约1∶5、约1∶4、约1∶3或约1∶2。在一些情况下，选择性地扩增treg细胞可包括通过(1)抗cd3和(2)抗cd5和/或抗icos因子进行刺激。
为了选择性扩增th17细胞对t细胞进行的刺激可包括刺激cd3、cd28、cd5和/或icos受体的刺激剂。在一些实施例中，th17细胞可使用抗cd3和抗icos抗体产生。在本发明的一些实施例中，与icos刺激的水平相比，cd3受体刺激的水平可在更低的浓度。使用抗体作为一个实例，抗cd3与抗icos的比例可以是约1∶1,000、约1∶500、约1∶100、约1∶50、约1∶40、约1∶30、约1∶20、约1∶10、约1∶5、约1∶4、约1∶3或约1∶2。
为了选择性扩增t记忆性细胞对t细胞进行的刺激可包括抗cd3和抗cd27或抗cd28或抗cd137的刺激。在许多情况下，与抗cd28、抗cd27和/或抗cd137因子相比，抗cd3因子将以更低的浓度存在。抗cd3与抗cd28和抗cd27或抗cd137的比例可以是约1∶1,000∶1,000、约1∶500∶500、约1∶100∶100、约1∶50∶50、约1∶40∶40、约1∶30∶30、约1∶20∶20、约1∶10∶10、约1∶5∶5、约1∶4∶4、约1∶3∶3或约1∶2∶2。
分离之后，t细胞可通过在培养物中使用本发明的组合物不受干扰地培育1至5天、1至4天、2至3天、约2天或者约3天来活化。不受干扰地活化之后，分离的t细胞根据需要通过添加新制培养基和细胞因子来扩增。扩增可发生7至20天、8至15天、10至14天、约10天、约11天、约12天、约13天或者约14天。用于t细胞扩增的细胞因子在以上进行了描述，并在以下参考实例进行讨论。
t细胞的扩增可以使得可产生t细胞亚群细胞的设定细胞数。例如，使用本发明的方法和组合物扩增t细胞可产生包含约106个细胞、约107个细胞、约108个细胞、或约1010个细胞(例如从约106至约1010个细胞、从约107至约1010个细胞、从约108至约1010个细胞、从约109至约1010个细胞、从约106至约109个细胞、从约106至约109个细胞等)的t细胞亚群。
使用本发明的方法，t细胞亚群中的活化/扩增可在约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约20天、约30天等(例如从约2小时至约30天、从约8小时至约30天、从约20小时至约30天、从约1天至约30天、从约3天至约30天、从约5天至约30天、从约7天至约30天等)内实现。
在一些情况下，含有一种或多种刺激信号(例如抗cd3抗体、抗cd28抗体、白细胞介素2等)的固相(例如珠粒)在扩增之后不会从t细胞群除去。在其它情况下，一旦t细胞群扩增到如以上所要求的水平，那么扩增的群便可以适当的方式从固相分离。例如，如果一种或多种刺激信号中的一种与固相连接并且该固相是组织培养孔、板或瓶，那么t细胞群可通过除去含有t细胞的培养基来获得。如果固相包含，例如磁性珠粒，那么便使用磁场来将珠粒吸引到容器侧壁，然后可，例如倒掉含有t细胞的培养基。其它特定的固体载体(例如非磁性珠粒)可从细胞离心或过滤掉。尽管大部分t细胞通常会位于培养基中，但是一些t细胞可能会在扩增之后连接到固相。如果需要，可通过，例如使用移液管或其它合适工具进行再悬浮将这种t细胞分离。这种再悬浮通常在t细胞从固相分离之前进行，以提高收率。一旦从固相分离，那么t细胞群便可以任何期望的方式进一步处理和/或操作，或者如以下所讨论直接用于像(例如)体外实验和研究、非治疗应用、治疗应用等这样的合适的应用。
当采用可溶性活化剂时，这些可(如果需要的话)通过与适当的配体，例如cd3或cd28竞争除去，但是在许多情况下，t细胞从培养基收集并用于如本文所述的应用而不需要进一步的提纯。便利地，对于大规模应用，适当的分离和制备平台可用来选择t细胞群，用于所产生的t细胞群的刺激和/或扩增方案和/或分离。在这点上，可特别提及dynal′sdynamagtmcts平台，其中封闭的无菌一次性袋可用于所进行的任何磁性细胞分离步骤，例如在扩增之前用于细胞分离，在扩增之后用于除去
如果必要的话，根据本发明的方法进行扩增/活化的t细胞群可通过以与初始刺激类似的方式将细胞与更多的活化剂接触来再刺激。一般而言，再刺激只有在t细胞会被培养较长时间(例如10至16天以上)的情况下才是必要的或期望的。
可在使用与初级活化所使用相同的珠粒培育来扩增之后对treg细胞进行再刺激。treg细胞可在初级活化之后的约16天、14天、约11天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天或约12小时进行再刺激。
按本发明的方法进行t细胞亚群中的扩增可导致较小的数量增加，但是在许多情况下，结果是显著增加，例如细胞数量增加至少约2倍，优选至少约5倍、约20倍或约50倍，更优选至少约100倍、约500倍、约1,000倍、约2,000倍、约5,000倍、约10,000倍、约20,000倍、约30,000倍、约40,000倍、约50,000倍、约75,000倍、约100,000倍或更大。这种数量增加可在细胞扩增方案中任何适当的时间点测量。
本发明提供用来产生一种或多种基本上纯的t细胞亚群的群的方法。为了本发明的目的，基本上纯的t细胞亚群的群含有约10％或更少的不希望的细胞(例如不是所期望的亚群细胞类型)。例如，为了说明，如果treg细胞是所期望的t细胞亚群，那么基本上纯的treg亚群将含有约10％或更少的非treg细胞的细胞。当然，这也适用于其它t细胞亚群。在一些实施例中，基本上纯的可包括约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约14％或更少、约13％或更少、约12％或更少、约11％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少和/或约1％或更少的不是所期望的亚群成员的t细胞。
在标准th17产生方案(具有极化细胞因子的x-vivotm15培养基)中，刺激性固体载体(例如
如图9a和图9b所示，已经发现，早期除去活化载体会改进th0细胞向th17表型的极化。进行早期珠粒去除的实验也已经显示高达200倍的扩增，其未受到珠粒去除的影响。
观察到使用icos共刺激的细胞的早期珠粒去除对th17极化的影响比用cd5共刺激的细胞更大，并且在cd28共刺激之后几乎可以忽略(图9a和图9b)。
在一些情况下，可期望除去用来从t细胞混合物活化t细胞的固体载体(例如像磁性珠粒这样的珠粒)。此外，在一些情况下，可期望在较短的时间段之后(例如5天内)除去这种固体载体。因此，本发明包括用于t细胞活化的组合物和方法，其中t细胞暴露于刺激一种或多种细胞表面标记物的因子，暴露时间小于5天(例如从约1天至约5天、从约2天至约5天、从约3天至约5天、从约1天至约4天、从约2天至约3天等)。
在一个特定实施例中，多个混合t细胞群样品在容许t细胞扩增的条件下暴露于：(1)含有抗cd3抗体和抗cd5抗体的固体表面(例如磁性珠粒)、(2)il-1β、(3)il-6、(4)il-23以及(5)tgf-β(以及任选的芳基烃受体激动剂)。对于一个样品，所述固体表面未被除去。对于第二个样品，所述固体表面在1天后除去。对于第三个样品，所述固体表面在2天后除去。对于第四个样品，所述固体表面在3天后除去。活化t细胞的扩增可基本上如实例10所述进行。在扩增过程结束时(约14天)确定扩增细胞的th17表型、th17细胞的数量以及th17细胞与其它细胞类型的比例。
iii.本发明的组合物
本发明的组合物包含表面，其具有以能够刺激特定的t细胞亚群的扩增的数量、比例、或组合固定的因子。在可替代的实施例中，所述因子可在溶液中。
本发明考虑的因子包括蛋白配体和合成配体。可与细胞表面基团结合并且在某些条件下导致会引起信号转导的连接和聚集的因子包括，但不限于凝集素(例如植物血球凝集素(pha)、小扁豆凝集素、伴刀豆球蛋白a)、抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、b细胞受体和t细胞受体配体、mhc-肽二聚体或四聚体、胞外基质组分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质类固醇、前列腺素、四碘甲状腺激素、皮质类固醇、前列腺素、四碘甲状腺素)、细菌基团(例如脂多糖)、有丝分裂原、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、粘附分子(例如l-选择素、lfa-3、cd54、lfa-1)、趋化因子以及小分子。所述因子可从细胞、血液产物以及组织这样的天然来源分离，或者从体外繁殖的细胞分离，重组制备、通过化学合成或通过本领域已知的其它方法制备。
在一个实施例中，本发明的因子包括抗体。本发明的抗体包括，但不限于：抗cd3(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，挪威)、抗cd137(由西班牙潘普洛纳的纳瓦拉大学提供的6b4，或来自美国加利福尼亚州的美国昂飞公司/生物科技(affymetrix/bioscience)的4b4-1)、抗cd28(xr-cd28：赛默飞世尔科技公司，挪威)、抗icos(isa-3)(affymetrix/bioscience，美国加利福尼亚州)、抗cd2、抗cd5、抗cd6、抗cd134、抗cd40l、抗ctla-4、抗gitr、抗lfa-1、抗slam、抗cd27、抗hvem、抗light、抗dr3、抗tim1、抗cd226。
本发明的抗体可从美国模式培养物保藏所(atcc)这样的公共来源获得，抗体到t细胞辅助分子以及细胞表面蛋白可通过标准技术产生。用来产生用于本发明的方法的抗体的方法在本领域中是已知的。抗体还可产生为基因工程化的免疫球蛋白(ig)或ig片段，所述免疫球蛋白(ig)或ig片段被设计为具有特定的目标特性。作为一个非限制性实例，抗体可包括重组igg，所述重组igg为嵌合融合蛋白，具有至少一个来自第一种哺乳动物物种可变(v)区结构域和至少一个来自第二种不同的哺乳动物物种的恒定区结构域。最常见地，嵌合抗体具有鼠类可变区序列和人类恒定区序列。这种鼠类/人类嵌合免疫球蛋白可通过将得自鼠类抗体的互补决定区(cdr)(其赋予抗原结合特异性)移植到得自人类的v区框架区和得自人类的恒定区中来“人源化”。还可将含有具有不同特异性的cdr的抗体组合，以产生多重特异性的(二重特异性或三重特异性等)抗体。这些分子的片段可通过蛋白水解消化，或者任选地通过蛋白水解消化接着进行温和的二硫键还原和烷基化，或者通过重组基因工程化技术来产生。
本发明的因子可进一步包括与细胞表面受体cd3、cd137、cd28、ctla-4、gitr、icos(isa-3)、cd2、cd5、cd6、cd134、抗cd40l、lfa-1、lfa-2、lfa-3特异性结合的任何分子。本发明的因子可包含肽、有机小分子、肽模拟物、可溶性t细胞受体、抗体等等。本发明的因子可以是天然存在的细胞表面受体配体。本发明的合适因子可通过本领域已知的用来确定结合亲和性和特异性的测试来识别，包括竞争性和非竞争性测试。有兴趣的测试包括elisa、ria、流式细胞法等。
本发明考虑的因子可进一步包括蛋白配体、天然配体以及合成配体。可与细胞表面基团结合，并且在某些条件下导致会引起信号转导的连接和聚集的因子包括，但不限于凝集素(例如pha、小扁豆凝集素、伴刀豆球蛋白a)、抗体、抗体片段、肽、多肽、糖肽、受体、b细胞受体和t细胞受体配体、胞外基质组分、类固醇、激素(例如生长激素、皮质类固醇、前列腺素、四碘甲状腺原氨酸)、细菌基团(例如脂多糖)、有丝分裂原、抗原、超抗原及其衍生物、生长因子、细胞因子、病毒蛋白(例如hivgp-120)、粘附分子(例如l-选择素、lfa-3、cd54、lfa-1)、趋化因子以及小分子。所述因子可从细胞、血液产物以及组织这样的天然来源分离，或者从体外繁殖的细胞分离，或者重组制备，或通过本领域技术人员已知的其它方法制备。
在本发明的一个方面，当期望刺激t-细胞时，可用的因子包括能够与cd3/tcr复合物、cd2和/或cd28结合并分别启动活化或增殖的配体。因此，术语配体包括作为细胞表面蛋白的“天然”配体(例如针对cd28的b7分子)以及人工配体(例如指向细胞表面蛋白的抗体)的那些蛋白。这种抗体及其片段可根据常规技术产生，例如杂交瘤(hybridoma)方法以及重组dna和蛋白表达技术。可用的抗体和片段可从任何物种(包括人类)得到，或者可形成为采用来自一种以上物种的序列的嵌合蛋白。
在可替代的实施例中，共刺激信号还可包括雷帕霉素。雷帕霉素可在细胞与活化剂接触之前、同时、和/或之后与细胞接触。雷帕霉素可在根据本发明的方法中的整个增殖/扩增步骤中存在。雷帕霉素可在一个或多个步骤中加入。因此，例如，如本文的实例中所述，分离的cd4+细胞可同时用活化剂和雷帕霉素刺激。在这种方法中，随后的生长和传代可在雷帕霉素存在下进行，而不能在活化剂存在下进行。
雷帕霉素可在从约0.01μm至约10μm(例如约0.5μm至约2μm或约1μm)的浓度下使用。雷帕霉素是分子量为914.2的蛋白激酶抑制剂，还称作西罗莫司、雷帕鸣、ay-22989、rapa以及nsc-226080，可从sigma、calbiochem、lclabs等得到。雷帕霉素可从各种商业来源得到，例如a.g.scientific，inc.(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。
可视情况向培养物中添加其它细胞因子和/或生长因子。这种细胞因子和/或生长因子以适当的浓度在适当的时间点加入。例如，可添加il-2和/或il-4以增强t细胞的增殖。如果需要的话可添加其它细胞因子以诱导特定的分化模式(例如tgf-β和il-10)。例如，已经显示il-4会触发t细胞群分化为th2亚群，并且ifn-γ和il-12会触发分化为th1亚群(sunder-plassmann等人，《血液(blood)》87；5179-5184(1996))。因此在本发明的一些实施例中，细胞因子(例如il-2)可在一个或多个步骤添加，达到的外源性添加的最终浓度为10至4,000u/ml(例如从约10u/ml至约3,000u/ml、从约10u/ml至约2,000u/ml、从约10u/ml至约1,500u/ml、从约15u/ml至约4,000u/ml、从约15u/ml至约3,000u/ml、从约15u/ml至约1,500u/ml、从约20u/ml至约2,000u/ml等)。在一些特定的情况下，il-2可在刺激过程中以20u/ml添加，在初始培养阶段过程中以1,000u/ml定期添加，在收集之前的时段内以20u/ml添加。
例如，il-4可以，例如约1,000-至5,000u/ml或约100至10,000u/ml(例如从约1,000u/ml至约5,000u/ml、从约500u/ml至约5,000u/ml、从约250u/ml至约5,000u/ml、从约100u/ml至约5,000u/ml、从约800u/ml至约2,500u/ml等)的最终浓度外源性添加。在一些情况下，在刺激和培养过程中直到收集时为止可以约1,000u/ml添加。适当的细胞因子和生长因子以及它们对t细胞的影响是众所周知的，并且在本领域中进行了描述。一旦在t细胞生长的适当条件下t细胞群与活化剂和任选的雷帕霉素接触，那么便可让生长进行一段时间，所述时间段根据需要的最终t细胞数量和细胞的扩增速率来选择。在这一时段期间可进行细胞的传代。这种时间段通常在约3天与约10天之间，但是可长达约14至约20天或者甚至更久，只要t细胞的存活率和持续增殖被保持。
本发明的组合物可包含在其上固定以上所述因子的表面。本发明的表面可以是这样的任何表面：其能够具有与其结合或整合到其中的配体，并且是生物相容的，即对于待刺激目标细胞基本上是无毒性的。生物相容的表面可以是可生物降解的或非可生物降解的。表面可以是天然的或合成的。合成表面可以是聚合物。表面可包含胶原蛋白、纯化的蛋白、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖、胞外基质组合物、脂质体或细胞表面。多糖可包括，例如纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸或海藻酸盐。其它聚合物可包括聚酯、聚醚、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、聚乙酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烯、聚四氟乙烯(ptfe)或聚氨酯。聚合物可以是乳酸或共聚物。共聚物可包含乳酸和羟基乙酸(plga)。非可生物降解的表面可包括聚合物，例如聚(二甲基硅氧烷)和聚(乙烯-乙酸乙烯酯)。生物相容的表面包括，例如玻璃(例如生物玻璃)、胶原蛋白、壳多糖、金属、羟基磷灰石、铝酸盐、生物陶瓷材料、透明质酸聚合物、海藻酸盐、丙烯酸酯聚合物、乳酸聚合物、羟基乙酸聚合物、乳酸/羟基乙酸聚合物、纯化的蛋白、纯化的肽或胞外基质组合物。其它聚合物包含表面可包括玻璃、二氧化硅、硅、羟基磷灰石、水凝胶、胶原蛋白、丙烯醛、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙或任何数量的塑料合成有机聚合物等等。表面可包含生物结构，例如脂质体或细胞表面，例如红细胞(rbc)。表面可以是脂质、盘子、袋子、小丸、纤维、筛孔或颗粒形式。颗粒可包括胶体颗粒、微球体、非颗粒、珠粒等等。在各种实施例中，可使用可商购的表面(例如珠粒或其它颗粒)(例如miltenyiparticles，美天旎生物技术有限公司(miltenyibiotec)，德国；sepharosebeads，法玛西亚精细化工(pharmaciafinechemicals)，瑞典；
像抗体这样的蛋白可以任何数量的方式与固体载体(例如珠粒)缀合。将蛋白与载体连接的一种方式是通过生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素。已经开发的一个系统称作strep-
类似的产物可从美天旎公司(miltenyibiotec)得到(德国贝尔吉施格拉德巴赫，目录号130-090-485)。所述产物包含具有与其结合的抗生物素的珠粒，其可用来与生物素化的抗体结合。这种珠粒还可用于细胞纯化，以及t细胞活化。
当使用珠粒时，珠粒可以是能够实现目标细胞刺激的任何尺寸。在一些实施例中，使用尺寸为从约5nm至约500μm的珠粒。珠粒尺寸的选择通常取决于珠粒的特定用途。例如，当使用顺磁性珠粒时，珠粒的尺寸通常低于1μm至约2.8μm至约500μm，通常为约2.8μm至约50μm。最后，可选择使用超顺磁性非颗粒，其可小至约10-5nm。一种示例性珠粒，
在一些实施例中，可使用
可通过本领域已知的和可用的各种方法将因子缀合到表面、连接到表面、结合到表面中、偶联到表面或整合到表面中。因子可以是天然配体、蛋白配体或合成配体。连接可以是共价的或非共价的、静电的或疏水性的，并且可通过各种连接手段，包括(例如)化学、机械、酶、静电或其它手段实现，而配体则能够刺激细胞。因子的连接可直接或间接(例如拴系)进行。例如，抗体可直接连接到表面(即直接连接)或通过间接连接(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素/生物素)。
至于细胞表面，连接可使用任何数量的本领域已知技术(例如包含目标因子的编码区的表达载体的转染或转导等)通过因子的基因表达进行。配体的抗体可通过抗个体基因型抗体连接到表面。另一个实例包括使用蛋白a或蛋白g或者连接到任何适当的表面的其它非特异性抗体结合分子(包括
适当比例的活化剂通常在它们与珠粒接触之前混合在一起。“适当的反应条件”可根据所使用的特定活化剂而变化，但是示例性的条件可包含，例如在颗粒浓度为约4×108个珠粒/ml的约ph7.4的磷酸盐缓冲液(例如0.5m的磷酸盐)中培育珠粒和活化剂，例如抗体。可任选地存在(例如以约0.05％w/v的浓度)人血清白蛋白(例如重组hsa)或其它血清白蛋白，例如牛血清白蛋白以稳定化活化剂并阻挡珠粒表面上剩余的任何疏水性片。
一旦适当的反应混合物设置好，便让反应进行适当的时间，并在适当的条件下促进活化剂以需要的比例吸附到表面。再一次，特定条件可根据反应混合物的组分而变化，但是示例性的条件包括在缓慢倾斜和旋转的同时在约37℃下培育约6至约24小时。
不管选择什么条件，一旦固定反应完成，便可通过在反应容器侧放置磁体将具有以适当比例固定到其表面的活化剂的珠粒从剩余的水性培养基除去，并丢弃上清液。通常会洗涤珠粒以除去过量的任何未结合抗体，然后准备使用。一旦制备好，这种珠粒便可立即使用，或者可储存用于将来使用。
在一些实施例中，
因子可固定到同一珠粒上，即“顺式”，或固定到不同的珠粒上，即“反式”。
在可替代的实施例中，本发明的活化因子可在溶液中。
特定的t细胞亚群的活化和扩增可通过特定的表面因子和表面因子的比例完成。在一些实施例中，用来扩增t细胞(例如treg细胞)的本发明的组合物包含抗cd3因子和抗cd28因子。本发明的t细胞(例如treg细胞)扩增组合物可包含低的、中等的或高的相对水平的粘附到表面的cd3。举例来说，低的抗cd3因子可以约0.01至约0.04、约0.05至约0.4、约0.06至约0.4、约0.07至约0.4、约0.08至约0.4、约0.09至约0.4、约0.1至约0.4、约0.2至约0.4、约0.3或约0.34单位的浓度存在于表面上；中等的抗cd3因子可以约0.5至约1.5、约0.6至约0.8或约0.75单位的浓度存在于本发明的表面上；高的抗cd3因子以约2至约4、约3至约4、约3.4或约3.41单位的浓度存在于本发明的表面上。在一些实施例中，使用用来扩增t细胞(例如treg细胞)的珠粒，其包含低的相对水平的抗cd3抗体以及抗cd28共刺激。
在一些实施例中，用来活化和扩增t细胞(例如记忆性t细胞)的本发明的组合物包含抗cd3因子、抗cd137因子以及抗cd28因子。本发明的t细胞(例如记忆性t细胞)扩增组合物可包含低的、中低的、中高的或高的相对水平的粘附到表面的cd3。举例来说，低的抗cd3因子可以约0.005至约0.02、约0.008至约0.015或约0.01单位的浓度存在于本发明的表面上；中低的抗cd3抗体可以约0.02至约0.08、约0.03至约0.07或约0.05单位的浓度存在于本发明的表面上；中高的抗cd3因子可以约0.09至约0.16、约0.1至约0.15、约0.14或约0.142单位的浓度存在于本发明的表面上；并且高的抗cd3因子可以约1至约2、约1.3至约1.7、约1.4至约1.6或约1.5单位的浓度存在于本发明的表面上。在一些用来扩增t细胞(例如记忆性t细胞)的实施例中，使用包含低的相对水平的抗cd3抗体以及抗cd28和抗cd137共刺激的珠粒。
在一些实施例中，用来活化和扩增t细胞(例如th17细胞)的本发明的组合物包含抗cd3抗体，以及抗icos抗体、抗cd5抗体或抗cd28抗体。本发明的t细胞(例如th17细胞)扩增组合物可包含低的、中等的或高的相对水平的粘附到表面的cd3。举例来说，低的抗cd3因子可以约0.02至约0.1、约0.03至约0.08、约0.04至约0.07、约0.05至约0.07或约0.06单位的浓度存在于本发明的表面上；中等的抗cd3因子可以约0.1至约0.5、约0.2至约0.5或约0.3单位的浓度存在于本发明的表面上；高的抗cd3因子可以约1至2、约1.3至约1.7或约1.5单位的浓度存在于本发明的表面上。在一些用来扩增t细胞(例如th17细胞)的实施例中，使用包含低的相对水平的抗cd3抗体以及抗cd5、抗cd28和/或抗icos共刺激的珠粒。
抗体可通过任何数量的方法缀合到固体载体(例如珠粒)。用来缀合抗体的一些方法涉及在容许抗体与固体载体共价偶联的条件下使抗体与固体载体接触。可用来制备偶联有抗体的珠粒的一个商用产品是
用于反应混合物以使珠粒饱和的蛋白的量会随着所使用的珠粒的“承载量”而变化。作为一个实例，当使用
在本发明的实践中还可使用
可在本发明的实践中使用的另一种产品是piercetmnhs-activatedmagneticbeads(赛默飞世尔科技公司，目录号88827)。这些珠粒在封闭的磁性珠粒表面上具有n-羟基丁二酰亚胺(nhs)官能团。它们是超顺磁性的(无磁性记忆)，并且标称平均直径为1μm(标称)。这些珠粒具有2.0g/cm3的密度和≥26μg兔igg/mg珠粒的结合能力。
首先，使蛋白溶液和磁性珠粒达到室温，然后将300μl磁性珠粒置于1.5ml微离心管中。将该管置于磁性表架中，收集珠粒并丢弃上清液。将1ml冰冷的洗涤缓冲液a(冰冷的1mm盐酸)引入管中，并轻微涡旋15秒。将该管置于磁性表架中，收集珠粒并丢弃上清液。然后向管中添加300μl蛋白溶液，然后将管涡旋30秒。在旋转器上将混合物在室温下培育1至2小时。在培育的第一个30分钟，将管每5分钟涡旋15秒。对于剩余的时间，将管每15分钟涡旋15秒，直到培育完成为止。使用磁性表架收集珠粒并保存穿透流。将1ml洗涤缓冲液b(0.1m甘胺酸，ph2.0)添加到珠粒，并将管涡旋15秒。将管置于磁性表架中，收集珠粒并丢弃上清液。洗涤和收集重复一次。然后将1ml超纯水添加到珠粒，并将管涡旋15秒。将管置于磁性表架中，收集珠粒并丢弃上清液。将1ml淬灭缓冲液(3m乙醇胺，ph9.0)添加到珠粒，并将管涡旋30秒。然后将管在室温下于旋转器上放置2小时。将管置于磁性表架中，收集珠粒并丢弃上清液。将1ml水添加到管中，充分混合，收集珠粒并丢弃上清液。将1ml储存缓冲液(50mm硼酸盐，0.05％叠氮化钠，ph8.5)添加到管中，充分混合，收集珠粒并丢弃上清液。该洗涤步骤重复另外两次。将300μl储存缓冲液添加到珠粒，充分混合，并在4℃下储存直到准备使用为止。偶联有蛋白的磁性珠粒的最终浓度应该是约10mg/ml。
可用来实践本发明的其它珠粒是
在许多情况下，用来实践本发明的固体载体(例如珠粒)会用蛋白饱和。所使用的蛋白的比例可变化。例如，100％的总负载可以是配体(例如抗体)。在这种情况下，可存在一种配体，或者可存在多种配体。当存在多种配体时，它们可以相同的比例(1∶1)或不同的比例(例如1∶10)存在。本文中别处描述了可用于实践的配体的示例性比例。
总的配体负载也可以调节。如使用抗体配体的表2所示，固体载体可负载到小于100％的容量。在许多情况下，当这完成时将期望阻挡配体连接位点进一步反应。这样做的一种方式是通过在容许配体因子和非配体因子与固体载体连接的条件下，使固体载体与不具有与特定应用(例如人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、一种或多种不与t细胞受体结合的抗体等)相关的配体结合活性的因子(例如蛋白)(非配体因子)接触。这容许调节不同的配体比例和不同的总信号比。按照这些方面的许多实例列于表2中。
关于t细胞的总信号可以任何数量的方式调节。例如，如果信号/固体载体(例如珠粒)低，那么每个t细胞可与更多的固体载体表面接触。当使用珠粒时，这意味着可调节珠粒与t细胞的比例。例如，如果使用具有50％的抗体负载的珠粒，那么便可使用两倍那么多的珠粒以获得与100％负载的珠粒相同的总信号。
iv.使用本发明的方法
本发明的t细胞亚群可用于任何数量的生理状况、疾病和/或疾病状态中，以便用于治疗目的和/或研究/发现目的。以异常免疫响应为特征的状况或疾病可以是自体免疫性疾病，例如糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力症、神经炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病或炎性肠病。其中免疫抑制会是有利的状况包括其中正常的或活化的免疫响应对哺乳动物不利的状况(例如(例如)体液或部分的同种异体移植)，以避免排斥，或者其中涉及到怀孕失败和流产的不适当的免疫响应的生育治疗。在移植之前、过程中或之后使用这种细胞会避免广泛的慢性移植物抗宿主疾病，其可发生在正在进行治疗的患者中(例如癌症患者)。细胞可在收集之后立即扩增，或者在扩增之前或扩增之后并在其治疗用途之前储存(例如通过冷冻)。这种治疗可结合已知的免疫抑制性疗法进行。
一旦适当的t细胞群或亚群从患者或动物分离，便可任选地在所得t细胞群使用本发明的方法和载体扩增之前进行基因修饰或操控或任何其它适当的修饰或操控。操控可，例如采取用抗cd3和抗cd28抗体刺激/再刺激t细胞的形式，以活化/再活化它们。
在某些实施例中，可期望给对象施用活化t细胞，随后再抽血(或者进行血液成分单采术)，根据本发明活化其中的t细胞，并给患者再输注这些活化的和扩增的t细胞。该过程可每几星期进行多次。在某些实施例中，t细胞可从10ml至400ml的抽血活化。在某些实施例中，t细胞从约20ml、约30ml、约40ml、约50ml、约60ml、约70ml、约80ml、约90ml或约100ml的抽血活化。给对象施用组合物可以任何便利的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、口服、输液、植入或移植。本文所述组合物可通过皮下、真皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射、或腹膜内给患者施用。在一个实施例中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射给患者施用。在另一个实施例中，本发明的t细胞组合物可通过i.v.注射施用。t细胞组合物可直接注射到肿瘤、淋巴结或感染/发炎位点中(自身免疫)。
根据本发明产生的t细胞亚群组合物具有许多潜在的用途，包括实验和治疗用途。特别地，可以设想，这种t细胞群在抑制不希望的或不适当的免疫响应中会非常有用。在这种方法中，少量的t细胞被从患者除去，然后在将其再输注到患者中之前进行活体外操控和扩增。可以这种方式治疗的疾病的实例是其中期望免疫活性被抑制的自身免疫性疾病和状况(例如对于同种异体移植抗性)。一种治疗方法可包含：提供哺乳动物，从含有t细胞的哺乳动物获得生物样品；根据如上所述的本发明的方法活体外扩增/活化t细胞；以及给待治疗哺乳动物施用扩增的/活化的t细胞。第一种哺乳动物和待治疗哺乳动物可相同或不同。哺乳动物通常可以是任何哺乳动物，例如猫、狗、兔、马、猪、牛、山羊、绵羊、猴子或人类。第一种哺乳动物(“供体”)可以是同种同体的、同种异体的或异种的。可给具有异常的免疫响应(例如自身免疫性疾病，包括例如，糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病以及炎性肠病)、组织移植或生育治疗的哺乳动物施用疗法。
涉及这种疗法的主要技术障碍包括从患者纯化目标细胞，以及细胞的体外扩增和/或操控。这种疗法通常需要大量的细胞，因此可以看出，优化体外诱导t细胞增殖的方法很重要，以使产生的t细胞的数量最大化并使产生足够数量的t细胞需要的时间最小化。本发明的组合物和方法提供大量的特定亚群的t细胞。
本发明的t细胞亚群可用于各种应用和治疗方式中。本发明的t细胞亚群可用于包括，但不限于癌症、自体免疫性疾病、过敏性疾病、炎性疾病、感染性疾病以及移植物抗宿主疾病(gvhd)的疾病状态的治疗中。广义的实例t细胞疗法包括在免疫消除之后或不在免疫消除之后给对象输注通过本发明的方法外部选择性扩增的t细胞亚群，或者给对象输注从供体对象分离的异体外部扩增的t细胞(例如过继性细胞转移)。
自身免疫紊乱
自身免疫性疾病或紊乱是由对自体抗原不适当的和过度的响应产生的那些疾病。研究已经将有缺陷的treg细胞与自身免疫紊乱关联。自身免疫性疾病包括：糖尿病、葡萄膜视网膜炎和多发性硬化症、阿狄森氏病、脂泻病、皮肤肌炎、格拉夫病、桥本氏甲状腺炎、斑秃、强直性脊椎炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、阿布勒米氏病、寻常性天疱疮、银屑病、风湿热、肉样瘤病、硬皮病、脊椎关节炎、血管炎性青斑、白斑病、黏液水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎、克罗恩病、大疱型表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、弥漫性毒性甲状腺肿、感染性多发性神经炎、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、类风湿性关节炎、干燥综合征以及全身性红斑狼疮红斑作为非限制性实例。在自体免疫性疾病状态中，cd4+cd25+treg可以降低的数量存在，或者具有功能缺陷。已经在具有多发性硬化症(viglietta等人，《试验医学杂志(j.exp.med.)》199：971-979(2004))、ii型自身免疫性多内分泌腺体综合征(kriegel等人，《试验医学杂志(j.exp.med.)》199：1285-1291(2004))、i型糖尿病(lindley等人《糖尿病(diabetes)》54：92-929(2005))、银屑病(sugiyama等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》174∶164-173(2005))以及重症肌无力症(balandina等人，《血液(blood)》105：735-741(2005))的患者中发现来自外周血液的treg抑制t细胞增殖的能力降低。
使用t细胞疗法治疗自身免疫紊乱可涉及不同的机制。在一个实施例中，血液或免疫细胞的另一种来源可从患有自身免疫紊乱的对象除去。本文所讨论的本发明的方法可用来选择性地扩增来自患者样品的记忆性t细胞之外的t细胞类型。去除和扩增自体细胞之后，可在有此需要的对象中通过已知方法去除不适当的记忆性t细胞，包括低剂量全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白以及施用化疗。本发明的说明性化疗剂包括，但不限于阿仑单抗、抗cd3抗体、癌得星(cytoxin)、氟达拉滨、环孢素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228以及辐射。去除能够识别自体抗原的不适当的记忆性t细胞之后，可给对象施用外部扩增的自体t细胞，以重建或再刺激其免疫系统。
作为以上所述治疗方式的替代，或者除以上所述治疗方式之外，treg细胞可从包括外周血液单核细胞、骨髓、胸腺、组织活体切片、肿瘤、淋巴结组织、消化道相关的淋巴组织、粘膜相关的淋巴组织、脾脏组织或任何其它淋巴组织以及肿瘤的来源分离。这些t细胞可使用本发明的方法选择性地扩增。可将这些扩增的treg细胞再施用到患者以抑制不适当的免疫响应。可施用该treg疗法，以便在免疫去除之后抑制最小的剩余的免疫响应，或者抑制未经受免疫去除的对象中的免疫响应。
移植物抗宿主疾病
造血干细胞移植中的一个主要问题是移植物抗宿主疾病，其由输注的造血干细胞制剂中存在的同种反应性t细胞导致。在器官移植中，由同种反应性宿主t细胞介导的移植排斥是主要的问题，通常通过移植受体的长期免疫抑制来克服。
在与以上所述的那些类似的方法中，使用t细胞疗法治疗不良移植物抗宿主疾病事件、降低其风险或严重性可涉及不同的机制。在一个实施例中，血液或免疫细胞的另一种来源可从患有移植物抗宿主疾病的对象除去。本文所讨论的本发明的方法可用来选择性地扩增记忆性t细胞之外的t细胞类型，从而选择性地扩增不包含对来自外源性组织的抗原的持久识别的那些细胞类型。去除并外部扩增自体细胞之后，可通过已知方法在有此需要的对象中去除不适当的记忆性t细胞，包括低剂量全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白以及施用化疗。本发明的说明性化疗剂包括(但不限于)阿仑单抗、抗cd3抗体、癌得星(cytoxin)、氟达拉滨、环孢素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228以及辐射。将能够识别外源性组织上的抗原的不适当的记忆性t细胞去除之后，可给对象再施用外部扩增的自体t细胞，以重建或再刺激其免疫系统。
作为以上所述治疗方式的替代，或者除以上所述治疗方式之外，可选择性地扩增从患者血液除去的tred细胞。可给患者再施用这些扩增的treg细胞，以抑制不适当的免疫响应，以便在免疫去除之后抑制最小的剩余的免疫响应，或者抑制未经受免疫去除的对象中的免疫响应。
过敏性疾病
过敏性疾病还可受到t细胞功能障碍的影响。研究已经表明，在患有季节性过敏的患者中存在受损的cd4+cd25+treg-介导的过敏原-特异性t辅助2型(th2)的抑制(lingem等人，《柳叶刀(lancet)》2004；363：608-15.；grindebackeh等人，《临床及实验变态反应(clinexpallergy)》2004；34：1364-72.)。此外，与健康对象相比，患有过敏和哮喘疾病的个体中涉及改变的t细胞群的比例(akdism等人，《试验医学杂志(jexpmed)》2004；199：156775.；tiemessenmm等人，《变态反应与临床免疫学杂志(jallergyclinimmunol)》2004；113：932-9.)。
在与以上所述的那些类似的方法中，使用t细胞疗法治疗、预防或缓解过敏性疾病可涉及不同的机制。与自身免疫紊乱和移植物抗宿主疾病类似，过敏性疾病由不适当的免疫响应导致。抑制该响应，或者去除能够识别不适当的抗原的细胞的可缓解过敏症状。在用来治疗过敏的t细胞疗法的方法中，可从患有过敏紊乱的对象除去血液。本文所讨论的本发明的方法可用来选择性地扩增非t记忆性细胞t细胞类型，从而选择性地扩增不包含来自不适当的抗原的抗原(例如豆科蛋白)的持久识别的那些细胞类型。去除并扩增自体细胞之后，可通过已知方法在有此需要的对象中去除不适当的记忆性t细胞，包括低剂量全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白以及施用化疗。本发明的说明性化疗剂包括，但不限于阿仑单抗、抗cd3抗体、癌得星(cytoxin)、氟达拉滨、环孢素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228以及辐射。将能够识别外源性组织上的抗原的不适当的记忆性t细胞去除之后，可给对象再施用外部扩增的自体t细胞，以重建或再刺激其免疫系统。
作为以上所述治疗方式的替代，或者除以上所述治疗方式之外，可选择性地扩增从患者血液除去的tred细胞。可给患者再施用这些扩增的treg细胞，以抑制不适当的免疫响应，以便在免疫去除之后抑制最小的剩余的免疫响应，或者抑制未经受免疫去除的对象中的免疫响应。
炎性疾病
炎性疾病和与发炎相关的紊乱的治疗中涉及t细胞疗法。许多这些疾病还可归类为自身免疫紊乱。炎性疾病和与发炎相关的紊乱的非限制性实例包括：糖尿病；类风湿性关节炎；炎性肠病；家族性地中海热；新生儿发作多系统炎性疾病；肿瘤坏死因子(tnf)受体-相关的周期性综合症(traps)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺失(dira)；以及白塞氏病。
由于treg细胞在抑制对非病原体抗原的不适当免疫响应中的作用，这些t细胞亚群的数量降低或功能受损可导致炎性疾病。这对于，例如炎性肠病(mhimmell等人，《免疫学(immunology)》2012年6月；136(2)：115-122)和类风湿性关节炎(mnoack等人，《自身免疫综述(autoimmunityreviews)》2014年6月；13(6)：668-677)确实如此。
炎性疾病在机理上与自身免疫紊乱类似。照此，炎性疾病可部分由不适当的免疫响应导致。抑制该响应，或者去除能够识别不适当的抗原的细胞可缓解炎性症状。在用来治疗炎性疾病的t细胞疗法的方法中，可从患有炎性紊乱的对象除去血液。本文所讨论的本发明的方法可用来选择性地扩增非t记忆性细胞t细胞类型，从而选择性地扩增不包含不适当的抗原(例如抗氨甲酰化蛋白(抗carp)抗体介导的类风湿性关节炎中的氨甲酰化蛋白)的持久识别的那些细胞类型。去除并扩增自体细胞之后，可通过已知方法在有此需要的对象中去除不适当的记忆性t细胞，包括低剂量全身辐射、胸腺辐射、抗胸腺细胞球蛋白以及施用化疗。本发明的说明性化疗剂包括(但不限于)阿仑单抗、抗cd3抗体、癌得星(cytoxin)、氟达拉滨、环孢素、fk506、霉酚酸、类固醇、fr901228以及辐射。将能够识别自体抗原并增强所得炎性响应的不适当的记忆性t细胞去除之后，可给对象再施用外部扩增的自体t细胞，以重建其免疫系统。
作为以上所述治疗方式的替代，或者除以上所述治疗方式之外，可选择性地扩增从患者血液除去的tred细胞。可给患者再施用这些扩增的treg细胞，以抑制不适当的免疫响应，以便在免疫去除之后抑制最小的剩余的免疫响应，或者抑制未经受免疫去除的对象中的免疫响应。
过度增殖性疾病
来自癌症患者的证据进一步将t细胞功能障碍与过度增殖性疾病，包括癌症相关联。例如，增加的treg活性可导致对肿瘤抗原的免疫响应较差，并导致免疫功能障碍。已经在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌以及皮肤癌患者的血液或肿瘤本身中发现增加的cd4+cd25+的群(wooey等人；《免疫学杂志(jimmunol)》2002；168：4272-6.；wolfam等人《临床癌症研究(clincancerres)》2003；9：606-12.；liyanageuk等人《免疫学杂志(jimmunol)》2002；169：2756-61.；viguierm等人《免疫学杂志(jimmunol)》2004；173：1444-53.；ormandyla等人《癌症研究(cancerres)》2005；65：2457-64.)。
可使用本发明的方法扩增对肿瘤抗原或过度增殖性疾病抗原或与过度增殖性疾病相关的抗原具有特异性的t细胞。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白，其会引发免疫响应，特别是t细胞介导的免疫响应。
可被治疗的癌症包括未血管化的或者尚未显著血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包含非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或者可包含实体瘤。用本发明的产物治疗的癌症的类型包括，但不限于上皮癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤和恶性肿瘤，例如肉瘤、上皮癌以及黑色素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。这其中是包括以下的癌症：皮肤癌、脑癌和其它中枢神经系统癌、头癌、颈癌、肌肉/肉瘤癌、骨癌、肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌或甲状腺癌或恶性胶质瘤。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性髓性白血病以及成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、骨髓单核细胞白血病、单核细胞白血病以及红白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒性白细胞)白血病、慢性髓性白血病以及慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(缓慢进展性和高分级形式)、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、重链病、脊髓发育不良综合征、毛细胞白血病以及脊髓发育不良。
实体瘤是通常不含囊孢或液体区域的异常团块。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤针对形成他们的细胞的类型命名(例如肉瘤、上皮癌以及淋巴瘤)。像肉瘤和上皮癌这样的实体瘤的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、良性滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴类恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、肾上腺嗜铬细胞皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管瘤、绒毛膜癌、维尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤以及cns瘤(例如神经胶质瘤(例如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称作多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤以及脑转移癌)。
治疗有此需要的对象或患者的一种方法是使用本发明扩增的t细胞并基因修饰t细胞以靶向通过嵌合抗原受体(car)的表达在肿瘤细胞上表达的抗原。car是被设计为以独立于人类白细胞抗原的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。在利用car的治疗中，免疫细胞可从患者血液或其它组织收集。t细胞被如下所述工程化，以在其表面上表达car，从而容许其识别特异性抗原(例如肿瘤抗原)。然后这些cart细胞可通过本发明的方法扩增并输注到患者中。在某些实施例中，t细胞以1×105、1×106、1×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1×1012个细胞施用给对象。患者输注之后，t细胞会继续扩增并表达car，从而容许针对t细胞的免疫响应增加，所述t细胞含有car被工程化以识别的特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供细胞(例如t细胞)，其被工程化以表达car，其中所述cart细胞展现出抗肿瘤特性。本发明的car可被工程化为包含胞外域，所述胞外域具有融合到t细胞抗原受体复合物ζ链(例如cd3ζ)的胞内信号结构域的抗原结合结构域。当在t细胞中表达时，car能够根据抗原结合特异性重定向抗原识别。
car的抗原结合基团包含靶点特异性结合元素。或者称作抗原结合基团。基团的选择取决于界定目标细胞的表面的配体的类型和数量。例如，可选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态相关的目标细胞上充当细胞表面标记物的配体。因此，本发明的car中的抗原基团结构域包括与病毒、细菌以及寄生虫感染、自体免疫性疾病以及癌细胞相关的那些。
编码car的天然或合成核酸的表达通常通过可操作地将编码car多肽或其部分的核酸与启动子结合并将构建体结合到表达载体中来实现。所述载体可适合复制和整合真核细胞。典型的克隆载体含有可用于调节目标核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列以及启动子。
本发明的t细胞还可使用标准基因递送方案用于核酸免疫和基因治疗。基因递送的方法在本领域是已知的。参见，例如美国专利第5,399,346、5,580,859、5,589,466号。在另一个实施例中，本发明提供了一种基因治疗载体。
核酸可被克隆到许多类型的载体中。例如，核酸可被克隆到包括，但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒以及粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体以及测序载体。
此外，所述表达载体可以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域是众所周知的，并且在，例如sambrook等人的(2001年，《分子克隆实验指南(molecularcloning：alaboratorymanual)》，纽约冷泉港实验室)中和其它病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括，但不限于逆转录酶病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒以及慢病毒。一般而言，合适的载体含有复制起点功能(在至少一种有机体中)、启动子序列、便利限制性内切酶位点以及一种或多种可选择性标记物(例如wo01/96584、wo01/29058以及美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用来将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录酶病毒提供用于基因递送系统的便利平台。可使用本领域已知的技术将所选基因插入载体中并包装到逆转录酶病毒颗粒中。然后可将重组病毒分离并体内或活体外递送到对象的细胞。许多逆转录酶病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些是位于起始位点上游30至110bp处的区域，尽管最近显示许多启动子在起始位点下游也含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是可变的，以便在各元件倒转或彼此相对移动时保持启动子的功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加到相隔50bp。根据启动子，各元件似乎可协同地或独立地起作用来激活转录。制造cart细胞的方法在本领域中是已知的(参见，例如美国专利8,906,682)。
在t细胞是cart细胞的实施例中，本发明的抗原结合基团的选择将取决于待治疗癌症的特定类型肿瘤抗原在本领域中是已知的，并且包括，例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(cea)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(afp)、凝集素反应性afp、甲状腺球蛋白、rage-1、mn-caix、人端粒酶反转录酶、rulru2(as)、肠道羧酸酯酶、muthsp70-2、m-csf、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、lage-1a、p53、prostein、psma、her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-上皮癌肿瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinb2、cd22、胰岛素生长因子(igf-1)、igf-ii、igf-i受体以及间皮素抗体。
在一个实施例中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可充当免疫攻击目标抗原的许多蛋白。这些分子包括，但不限于组织-特异性抗原，例如黑色素瘤中的mart-1、酪氨酸酶以及gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸磷酸酶(pap)和前列腺-特异性抗原(psa)。其它目标分子属于转化相关的分子(例如致癌基因her-2/neu/erbb-2)的组。又一组目标抗原是肿瘤胎儿抗原，例如癌胚抗原(cea)。在b细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性免疫球蛋白构成真正肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原，所述抗原对于单独的肿瘤是独特的。cd19、cdd20、ror1、cd22、cd23、λ/κ轻链这样的b细胞分化抗原是b细胞淋巴瘤中目标抗原的其它候选。
所提及的肿瘤抗原的类型还可以是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关的抗原(taa)。tsa对于肿瘤细胞是独特的，并且不会发生在机体内的其它细胞上。在不能诱导对抗原的免疫抗性状态的条件下，taa对于肿瘤细胞并不是独特的，而是也在正常细胞上表达。肿瘤上的抗原的表达可在使得免疫系统能够对抗原产生响应的条件下发生。taa可以是在胎儿发育过程中当免疫系统不成熟并且不能响应时在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但是在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
tsa或taa抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，例如mart-1/melana(mart-1)、gp100(pmel17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2；肿瘤特异性多向抗原，例如mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、p15；过表达的胚胎抗原，例如cea；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、ras、her-2/neu；从染色体易位产生的独特肿瘤抗原，例如bcr-abl、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；以及病毒抗原，例如eb病毒抗原ebva和人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其它大的基于蛋白的抗原包括tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、nm-23h1、psa、tag-72、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、β-连环蛋白、cdk4、mum-1、p15、p16、43-9f、5t4、791tgp72、α-胎蛋白、β-hcg、bca224、btaa、ca125、ca15-3\ca27/29\bcaa、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\p1、co-029、fgf-5、c250、ga733\epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90、mac-2结合蛋白\亲环蛋白c-相关的蛋白、taal6、tag72、tlp以及tps、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素抗体、cd33/il3ra、c-met、psma、糖脂f77、egrviii、gd-2、my-eso-1tcr、magea3tcr以及其它。
感染性疾病
对感染性疾病的免疫响应涉及抗病原体与抗炎响应的平衡。t细胞特别涉及这一复杂的平衡。能够诱发t细胞响应的感染性病原体可以是细菌、病毒、寄生虫或真菌.treg细胞已经被与幽门螺旋杆菌感染(lundgrena等人《感染免疫学(infectimmun)》2003；71：1755-62.)、乙型肝炎病毒(hbv)感染以及丙型肝炎病毒感染(hcv)(cabrerar等人，《肝脏病学(hepatology)》2004：40：1062-71.；stoopjn等人《肝脏病学(hepatology)》2005：41：771-8.；sugimotok等人，《肝脏病学(hepatology)》2003：38：1437-48.)的慢性化相关联。特定的t细胞亚群的这一增加可通过不适当地抑制记忆性t细胞响应导致这些感染的持久性质。本发明的组合物可用来特异性地扩增特定的t细胞亚群，并且可用于治疗这种感染性疾病。
感染性疾病可通过与病原体直接接触引起，并在人与人之间传播，从动物传播到人，或从母体传播到未出生儿。感染性疾病可替代性地通过间接接触传播，例如与门把手、桌子、柜台或水龙头手柄这样的感染表面的接触。感染性疾病可进一步通过昆虫叮咬或食品污染传播。像hiv或aids这样的某些自身免疫紊乱，以及一些癌症可增加对感染性疾病的易感性。抑制免疫系统的某些治疗方案也可增强对感染性疾病的易感性。实例感染性疾病包括：天花、疟疾、结核病、斑疹伤寒、鼠疫、白喉、伤寒、霍乱、痢疾、肺炎。
如以上所述，存在几种机制，通过其选择性扩增t细胞可用来治疗疾病状态。在感染性疾病状态中，被感染的患者对感染性因子没有足够的免疫。本发明的方法可用来选择性地扩增来自对特定的感染性因子免疫的供体的异体t记忆性细胞，并用于过继性t细胞转移。然后可将来自经受过感染性因子的供体的外部扩增的t细胞输注到被感染的患者中。在某些实施例中，t细胞以1×105、1×106、1×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1×1012个细胞给对象施用。然后对感染性抗原有适应力的供体记忆性t细胞可帮助增强患者中的自体免疫响应。
本发明用来治疗感染性疾病的可替代方法包括选择性扩增自体或异体th17细胞，分别用于再输注或过继性细胞转移。使用本文所述的方法，t细胞可从患者分离的血液或组织外部扩增。然后可给患者输注这些扩增的t细胞，以帮助诱导b细胞分泌针对特定感染性抗原(例如链球菌m-蛋白、奈瑟菌属菌毛、伯氏疏螺旋体脂蛋白vise、类鼻疽伯克氏菌多糖抗原、烟曲霉半乳甘露聚糖或土拉热弗朗西丝菌脂多糖)的抗体。在某些实施例中，t细胞以1×105、1×106、1×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1×1012个细胞给对象施用。
辅助疗法
可建议现有的疗法用于许多以上所列疾病状态。通过本发明扩增的t细胞亚群在一些情况下可作为单独的替代疗法使用，或者连同其它已知疗法一起使用。t细胞疗法可在施用其它疗法之前、同时或之后施用
本发明的方法还可与疫苗一起使用，以增强抗原的反应性并增强体内效果。在一个实施例中，本发明的组合物与会增加体内t细胞的组合物(例如il-2、il-4、il-7、il-10、il-12和/或il-15)一起给患者施用。此外，考虑到通过本发明扩增的t细胞在体内具有较长的半衰期，这些细胞可通过携带期望的目标核酸序列并可能置于癌症、疾病或感染位点来充当如以上所述的基因治疗的完美载体。因此，通过本发明扩增的细胞可与疫苗、一种或多种细胞因子、一种或多种治疗抗体等一起递送到患者。实际上，会受益于更鲁棒的t细胞群的任何疗法均可与本发明的组合物一起使用。
v.本发明的试剂盒
本文还提供试剂盒，其包含(i)用来将t细胞从对象分离的组合物；(ii)用来活体外培养t细胞的组合物；(iii)用来选择性扩增一种或多种t细胞亚群(例如th17、treg、记忆性t细胞等)的组合物。本发明的试剂盒可任选地包括用来再活化treg细胞的组合物。
试剂盒可还包括使用试剂盒的书面说明，例如关于洗涤步骤、培养条件以及为了选择性扩增特定的t细胞亚群使用本发明的组合物培育分离的t细胞的持续时间的说明。
意图是，在整个该说明书中给出的每个最大数值限度包括每个数值下限，就如同本文中明确地写出了这种数值下限一样。在整个该说明书中给出的每个最小数值限度将包括每个数值上限，就如同本文中明确地写出了这种数值上限一样。在整个该说明书中给出的每个数值范围将包括落入这种较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，就如同本文中明确地写出了所有这种较窄的数值范围一样。
实例
可通过参考以下实例进一步理解本发明，以下实例以举例的方式提供，并不旨在进行限制。
实例1.初始t细胞和培养条件。
在知情同意的情况下，将外周血液单核细胞(pbmc)从健康供体的血沉棕黄层或单采成分血液(aphaeresis)(hemacarecorp.，美国加利福尼亚州，以及astartebiologics，llc，美国华盛顿州)分离。在使用cmvpp65肽nlvpmvatv(astartebiologicsllc)进行刺激之后，将抗原特异性记忆性t细胞在来自巨细胞病毒(cmv)阳性供体的pbmc中富集。调节性t细胞(treg)通过基于cd4、cd25以及cd127抗体标记的荧光活化细胞分选从淘析和cd4-富集的(
t细胞直接从pbmc活化，或者使用具有所述的各种配体组成和化学计量的
流式分选的t调节性细胞(treg)在含有100ng/ml的雷帕霉素(phz1235赛默飞世尔科技公司，美国纽约)和300iuil-2/ml(赛默飞世尔科技公司，美国纽约)的培养基中扩增，而cmv刺激的t细胞则在100iuil-2/ml中扩增。th17/tc17细胞如paulos等人的(paulos等人，《科学转化医学(sciencetransl.med)》55：55ra78(2010))中所述在抗il-4和抗ifn-γ中和性抗体(赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州)的存在下在含有极化细胞因子(il-6、il-1β、il-23以及tgf-β，均来自美国加利福尼亚州的赛默飞世尔科技公司)的培养基中扩增。100iuil-2/ml在活化后第3天添加。
实例2.使用各种配体组成和比例的基于
将
实例3.t细胞的刺激和扩增。
t细胞直接从pbmc活化，或者通过每细胞添加一个
实例4.抗体和流式细胞法分析。
以下抗体用于treg分析：cd4percp(invitrogen，mhcd0431)、cd25apc(invitrogen，mhcd2505)以及cd127pe(invitrogen，a18684)。细胞内foxp3表达在固定/透化(ebioscience)之后通过alexafluor488(bd560047)进行分析。在bdlsrii(bdbiosciences)上收集流式细胞法数据，并使用facsdiva软件(bdbiosciences)对其进行分析。根据其前向和尺寸散射特征淋巴细胞被门控。适当的不相关的同种型对照用来设置阴性门(igg2apercp(赛默飞世尔科技公司，目录号ma1-10426)、igg1apc(赛默飞世尔科技公司，目录号mg105)、igg1pe(赛默飞世尔科技公司，目录号mg104)以及igg1alexafluor488(bdbiosciences，目录号557702))。
cmv-特异性的cd8+t细胞使用pro5pentamerapc(nlvpmvatv/a*02：01)(proimmune，英国牛津)和cd8-pe(赛默飞世尔科技公司，目录号mhcd0804)和适当的同种型对照(igg1pe，赛默飞世尔科技公司，目录号mg104)来确认。
pma/伊屋诺霉素活化的th17细胞中的细胞内il-17表达在固定/透化(ebioscience)之后使用il-17a-pe(目录号a18695，克隆：4h1524，molecularprobes)和适当的同种型对照(igg2bpe，目录号400313biolegend)检测。在bdlsrii(bdbiosciences)上收集流式细胞法数据，并使用facsdiva软件(bdbiosciences)对其进行分析。
实例5.通过流式细胞法的功能。
在使用含有蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素和莫能菌素的细胞刺激混合物试剂盒(cellstimulationcocktailkit)(ebioscience，目录号00-4971)进行pma/伊屋诺霉素([1}dynabeads
实例6.treg的活化和扩增
如图1所示，cd4+cd25+cd127低/-流式细胞法分选的treg(约90％foxp3+细胞)使用
实例7.经抗原刺激过的(cmv特异性记忆)t细胞的活化和扩增
如图2中所见，cmv特异性记忆性t细胞在活化后第10天的扩增倍数与由与增加量的激动性cd3抗体缀合的
实例8.th17细胞的活化、极化以及扩增
t细胞使用th17-极化条件培养，并使用与针对cd3/icos(与各种量的抗cd3抗体缀合；1.5和0.06，以及两种不同的icos克隆)或cd3/cd28(cts珠粒)的抗体缀合的
只有使用
实例9：珠粒：细胞比对产生il-17的细胞的选择性扩增的影响。
t细胞从三个供体(a、b以及c)收集。通过白细胞去除术从健康供体收集pbmc，并以菲科尔-甲泛影酸钠密度梯度对其进一步纯化。astartebiologics(normalpbmc)。根据提供的说明书使用
负分离的cd3+t细胞使用
实例10：产生th17细胞的方案。
引言
在过继性转移到带有肿瘤的小鼠中之后，分泌il-17a(th17和tc17细胞)的t细胞使肿瘤退化的程度比分泌th1或tc1细胞的非极化的t细胞或ifn-γ更大(muranski等人，《血液(blood)》，112：362-73，(2008)，nelson等人，《免疫学杂志(jimmunol)》，194：1737-47(2015)，guedan等人，《血液(blood)》，124：1070-80(2014))。调节人类th17细胞的产生的因素仍然是一个争论话题，并且已经报道th17细胞的分化由各种转录因子控制，包括rorγt、irf4、runx1、batf以及stat3(nalbant和eskier，《前言生物科学(front.biosci.)》(elite编辑)，8：427-35(2016))。期望确认可针对过继性细胞转移扩增th17细胞的鲁棒培养条件。
已经报道了证明会产生th17细胞的可替代途径和方案：i)在il-1β、il-6、il-23以及tgf-β的存在下进行cd5或cd6共刺激(dewit等人，《血液(blood)》，118：6107-14(2011))，ii)进行slamf3和slamf6以及ag-介导的cd3/tcr刺激(chatterjee等人，《免疫学杂志(jimmunol)》，188：1206-12(2012))，iii)激动剂对芳基烃受体(arh)的作用(veldhoen等人，《试验医学杂志(jexpmed)》，206：43-9(2009)，以及iv)胆固醇前体，其充当强有力的维甲酸受体相关孤儿受体(ror)激动剂(hu等人，《国家化学生物学(natchembiol)》，11：141-147(2015))。但是，通常使用的培养基rpmi仅支持低水平的th17极化。富含芳族氨基酸(芳基烃受体(ahr)激动剂的前体)的其它培养基一直引起更高的th17扩增，并证明ahr活化是必要的th17极化。rorγt对于th17细胞是最重要的转录因子。当注射到小鼠中时，rorγt激动剂会产生升高水平的th17细胞因子，增加cd137这样的共刺激受体的水平，并降低共抑制受体pd-1的表达(hu等人，《rorg激动剂调节免疫检查点受体以增强抗肿瘤免疫(rorgagonistregulateimmunecheckpointreceptorstoenhanceanti-tumorimmunity)》aacr摘要#565，新奥尔良2016年)。此外，使用rorγt激动剂体外处理的t细胞在过继性转移之后保持低的pd-1表达。
在极化条件(包括使用ahr激动剂)下进行低cd3强度活化和cd5共刺激之后发现显著的t细胞的th17极化。
材料和方法
初始t细胞和培养条件：在知情同意的情况下，将外周血液单核细胞(pbmc)从健康供体的血沉棕黄层或单血液成分采血(astartebiologics美国华盛顿州)分离。负分离的t细胞(
通用方案：如在paulos等人，《科学转化医学(scitranslmed)》，2：55ra78，(2010)中所述，th17/tc17细胞在含有极化细胞因子(il-6、il-1β、il-23以及tgf-β(目录号il6-phc066、il-1β-phc0816、il23-phc9324以及tgf-β-phg9214，赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆))的培养基中在抗il-4和抗ifn-γ中和性抗体(目录号ac0642和ach4032，赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)的存在下扩增。添加极化细胞因子和抗体仅用于初始活化(第0至3天)。将细胞分开，并从活化3天后开始保持在含有100iuil-2/ml和il-23的培养基中。
刺激性dynabeads：刺激性抗cd3抗体和缀合到dynospheres的其共缀合的共刺激配体的相对量概括于表5中。
表5.dynabeadsth17扩增剂原型和对照
th17细胞的极化和扩增。通过负分离(
表6.极化剂和它们的功能
极化剂t细胞上的活性
流式细胞法、表型以及功能：在pma/伊屋诺霉素(含有蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素和莫能菌素的cellstimulationcocktailkit，目录号00-4971，ebioscience)活化的th17细胞中的细胞内细胞因子表达使用il-17a-pe(目录号a18695，克隆：4h1524，molecularprobes)和il17-f、ifn-γ以及适当的同种型对照(igg2bpe，目录号400313biolegend)检测。流式细胞法数据在bdlsrii(bdbiosciences)上收集，并使用facsdiva软件(bdbiosciences)进行分析。
结果和讨论
i)中和性抗体的作用
在th17细胞极化方案中使用αil-4/α-ifnγ抗体以封闭th1/th2极化。
在cd3/cd28活化之后引入封闭抗体以便改进th17的产生。临床级的封闭抗体是昂贵的，并且会给th17细胞的产生方案增加复杂性。
方案变换：t细胞使用优化的条件利用
结论：与cd3/cd28相比，通过cd3/icos的刺激产生更高分数的产生il-17的t细胞(cd4细胞的42.5％相对于cd4细胞的16.5％)。使用
ii)cd5共刺激的影响
已经报道，通过提高il-23r的表达，cd5会促进th17的产生，从而产生相对于cd28共刺激而言持久的stat3活化和增强水平的ror-γt(dewit等人，《血液(blood)》，118：6107-14(2011))。
方案变换：使用
结论：如通过il-17的产生和ccr4/ccr6的共表达所确定，通过cd3/cd5的刺激会产生与cd3/icos相比类似的或稍高的th17轮廓，并且比cd3/cd28刺激更佳。
iii)ahr激动剂的影响
已经显示ahr配体ficz(5，11-二氢吲哚并(3,2-b)咔唑-6-甲醛)会上调th17程式(veldhoen等人，《实验医学杂志(j.exp.med.)》，206：43-9(2009)。
方案变换：使用
结论：ficz在通过cd5而不是icos共刺激的t细胞上具有良好的活性。与标准极化条件相比，ficz、il-1β和il-6方案会产生更少的产生il-17的细胞，并需要优化。
实例11：使用dynabeadstmtreg珠粒扩增treg细胞(＞80％foxp3)
分选的treg细胞(＞80％foxp3)在x-vivo15+5％ctsimmunecellserumreplacement(x-vivotm15/cts)中稀释至2百万个细胞/ml。通过磁性分离将dynabeadstm洗涤一次，并在x-vivotm15/cts中将珠粒稀释至4百万/ml。将对照珠粒洗涤一次，并在具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts中将珠粒稀释至4百万/ml。然后将相等量的细胞、x-vivotm15/cts以及珠粒添加到48孔板的孔中，直到总体积为400μl。每个样品-式三份进行设置。
第0天：如以上，在48-孔板中使用具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts制备treg扩增混合物。
第2天：将200μlx-vivotm15/cts和300u/mlril2添加到每个孔中，并将所得细胞悬浮液混合。
第3至12天：每天通过显微镜估计细胞密度。当达到大约150万至200万个细胞/cm2的密度时，将细胞转移到更大的孔中或烧瓶中。根据需要添加新制的具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts。
第5天：将250μlx-vivotm15/cts从每个样品除去，并添加250μl新制的具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts。然后将细胞悬浮液混合。
第7天：确定孔的体积和细胞计数。当达到大约150万至200万个细胞/cm2的细胞密度时，将细胞转移到更大的孔/烧瓶中，并添加新制的具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts。
第9天：再次添加新制的具有300u/mlril2的x-vivotm15/cts，并将细胞悬浮液混合。
第12天：确定每个孔中的体积，并对细胞进行计数。使用表9中列出的试剂和100,000至200,000个细胞进行foxp3染色。
通过将固定/透化(1份)与固定透化稀释剂(3份)混合制备固定/透化溶液。通过将透化浓缩物(1份)与水(9份)混合制备固定/透化缓冲液/洗液。每天制备新制品。通常对10万至20万个细胞进行染色。
细胞使用1mldpbs/0.1％has洗涤一次，并以350xg离心8分钟以除去上清液。
对细胞进行波动涡旋，然后通过涡旋混合。添加1ml固定/透化(1x)溶液，并再次对细胞进行涡旋。然后将细胞悬浮液在4℃下培育60分钟。然后添加2ml透化缓冲液/洗液(1x)，并在4℃下以400xg将悬浮液离心8分钟以除去上清液。将添加透化缓冲液/洗液接着进行离心的操作重复1次。
然后将染色混合物50μl(2.5μlcd4percp、2.5μlcd25apc、5μlfoxp3af488、2μlcd127pe+38μl透化缓冲液/洗液(1x))添加到样品，接着在4℃下培育30分钟。然后通过流式细胞法对样品进行分析。
其它实施例
尽管本发明已经结合其详述进行了描述，但是以上描述旨在对本发明的范围进行说明而不是对其进行限制，本发明的范围由所附权利要求书的范围界定其它方面、优势以及修改在以下权利要求书的范围内。
本文中提及的专利和科学文献确立本领域技术人员能够获得的知识。本文中引用的所有美国专利和公开的或未公开的美国专利申请通过引用并入本文。
尽管已经参考特定实施例具体表明和描述了本发明，但是本领域技术人员应理解，可在不偏离所附权利要求书包括的本发明范围的情况下在其中进行各种形式和细节的改变。
以下条款代表本发明的示例性主题：
条款1.一种用来选择性地扩增t细胞亚群成员的方法，所述方法包含将混合t细胞群暴露于：
(a)第一试剂，其为t细胞亚群成员提供初级活化信号，从而活化t细胞，以及
(b)第二试剂和第三试剂，它们各自均会刺激t细胞亚群成员上的两种或更多种不同辅助分子，从而刺激(a)中所活化的t细胞的增殖，其中第一试剂、第二试剂以及第三试剂的比例被调节，以相对于其它t细胞亚群成员选择性地诱导t细胞亚群成员扩增。
条款2.根据条款1所述的方法，其中所述第一试剂是抗cd3抗体。
条款3.根据条款1或2所述的方法，其中所述第二试剂是抗体。
条款4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述第三试剂是抗体或非抗体蛋白。
条款5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述非抗体蛋白是趋化因子或细胞因子。
条款6.根据条款4所述的方法，其中所述趋化因子或细胞因子是一种或多种蛋白，所述蛋白选自由以下组成的群组：
(a)白细胞介素-1α、
(b)白细胞介素-2、
(c)白细胞介素-4、
(d)白细胞介素-1β、
(e)白细胞介素-6、
(f)白细胞介素-12、
(g)白细胞介素-15、
(h)白细胞介素-18、
(i)白细胞介素-21、
(j)白细胞介素-7、
(k)白细胞介素-23以及
(1)转化生长因子β1。
条款7.根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一试剂、第二试剂以及第三试剂的比例被调节使得与第二或第三试剂相比第一试剂的浓度较低。
条款8.根据条款7所述的方法，其中第一试剂的较低浓度为约0.34单位。
条款9.根据条款8所述的方法，其中所述第一试剂是浓度为约0.34单位的抗cd3抗体，并且第二试剂是浓度为3.4单位的抗cd28抗体。
条款10.根据前述条款中任一项所述的方法，其中选择性扩增的t细胞亚群为treg细胞。
条款11.根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一试剂的较低浓度为约0.01单位。
条款12.根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一试剂是浓度为约0.01单位的抗cd3抗体，第二试剂是抗cd28抗体，并且第三试剂是抗cd137抗体。
条款13.根据前述条款中任一项所述的方法，其中选择性扩增的t细胞亚群为记忆性t细胞。
条款14.根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一试剂的较低浓度为约0.06单位。
条款15.根据前述条款中任一项所述的方法，其中第一试剂是浓度为约0.34单位的抗cd3抗体，并且第二试剂是抗icos或抗cd5抗体。
条款16.根据前述条款中任一项所述的方法，其中选择性扩增的t细胞亚群为th17细胞。
条款17.根据一种用来选择性地扩增t细胞亚群的方法，所述方法包含
(a)将t细胞活体外暴露于cd3、cd28、抗cd5、抗icos和/或cd137信号，和
(b)以容许扩增th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞的方式培养所述t细胞。
条款18.根据条款17所述的方法，其中cd3、cd28以及cd137信号由抗cd3、抗cd28和/或抗cd137抗体介导。
条款19.根据条款17或18所述的方法，其中抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体针对记忆性t细胞的扩增在包括0.01单位至1.5单位的浓度的范围内使用。
条款20.根据条款17或18所述的方法，其中抗cd3、抗cd28、抗cd5、抗icos以及抗cd137抗体针对th17细胞的扩增在包括0.06单位至1.5单位的浓度的范围内使用。
条款21.根据条款17或18所述的方法，其中抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体针对treg细胞的扩增在包括约0.34单位至3.41单位的浓度的范围内使用。
条款22.根据条款17至21中任一项所述的方法，其中与抗cd28和抗cd137抗体的浓度相比抗cd3抗体在较低的浓度下使用。
条款23.根据条款17至22中任一项所述的方法，其中t细胞使用cd3选择来分离。
条款24.根据条款17至23中任一项所述的方法，其中所述th17细胞为cd3+、cd8/cd4+/，并且会产生il-17细胞因子。
条款25.根据条款17至24中任一项所述的方法，其中所述th17细胞能够产生il-17、il-21和/或il-22。
条款26.根据条款17至25中任一项所述的方法，其中所述记忆性t细胞选自由以下组成的群组：干细胞样记忆性t细胞、中枢记忆性t细胞以及效应记忆性t细胞。
条款27.根据条款26所述的方法，其中所述干细胞样记忆性细胞具有以下标记物中的一种或多种：cd3+、cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+、il-7rα+、il-2rβ、cxcr3以及lfa-1。
条款28.根据条款26所述的方法，其中所述中枢记忆性细胞具有以下标记物中的一种或多种：cd3+、ccr7+、cd45ra-、cd45ro+、cd62l+(l-选择素)、cd27+以及cd28+。
条款29.根据条款28所述的方法，其中所述中枢记忆性细胞能够产生il-2。
条款30.根据条款26所述的方法，其中所述效应记忆性细胞具有以下标记物中的一种或多种：cd28+/-、cd27+/-、cd3+、cd4+、cd8+、ccr7-、cd45ra-、cd45ro+。
条款31.条款26或30的方法，其中所述效应记忆性细胞为能够产生ifnγ和il-4的细胞。
条款32.根据条款17至24中任一项所述的方法，其中所述treg细胞具有以下标记物中的一种或多种：cd4+、cd25+、foxp3+以及cd127阴性/低。
条款33.一种用来选择性地扩增t调节性细胞的方法，所述方法包含：
(a)将t细胞活体外暴露于cd3和cd28信号，和
(b)以容许扩增t调节性细胞的方式培养所述t细胞。
条款34.根据条款33所述的方法，其中cd3和cd28信号由抗cd3和抗cd28抗体介导。
条款35.根据条款34所述的方法，其中抗cd3和抗cd28抗体在包括0.34至3.4单位的浓度范围的范围内使用。
条款36.根据条款34或35所述的方法，其中与抗cd28和/或抗体的浓度相比抗cd3抗体在较低的浓度下使用。
条款37.一种用来选择性地扩增th17细胞的方法，所述方法包含：
(a)将cd3+t细胞活体外暴露于cd3、cd28、抗cd5、和/或icos信号，和
(b)以容许扩增th17细胞的方式培养所述cd3+t细胞，
其中cd3、cd28、cd5和/或icos的量不同。
条款38.根据条款37所述的方法，其中cd3、cd28、cd5以及icos信号由抗cd3、抗cd28、抗cd5以及抗icos抗体介导。
条款39.根据条款37或38所述的方法，其中抗cd3、抗cd28、抗cd5以及抗icos抗体针对th17细胞的扩增在包括0.06至1.5单位的浓度范围的范围内使用。
条款40.根据条款37、28或39中任一项所述的方法，其中抗cd3抗体与抗cd28、抗cd5和/或抗icos抗体的浓度相比在较低的浓度下使用。
条款41.一种用来选择性地扩增经抗原刺激过的t细胞的方法，所述方法包含：
(a)将t细胞活体外暴露于cd3、cd28、cd27和/或cd137信号，和
(b)以容许扩增经抗原刺激过的t细胞的方式培养所述t细胞。
条款42.根据条款41所述的方法，其中cd3、cd28和cd27和/或抗cd137信号由抗cd3、抗cd28、抗cd27和/或抗cd137抗体提供。
条款43.根据条款41或42所述的方法，其中抗cd3、抗cd28、抗cd27以及抗cd137抗体在包括0.01-1.5单位的浓度范围的范围内使用。
条款44.根据条款41、42或43中任一项所述的方法，其中抗cd3抗体与抗cd28和/或抗cd137抗体的浓度相比在较低的浓度下使用。
条款45.一种组合物，其包含cd3+(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有(a)抗cd3抗体和(b)能够选择性扩增t细胞亚群的抗cd28、抗cd137或icos抗体，其中所存在的(a)抗cd3抗体与(b)抗cd28、抗cd137或icos抗体的量不同。
条款46.根据条款45所述的组合物，其中t细胞亚群选自由以下组成的群组：th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。
条款47.根据条款45或46所述的组合物，其中抗cd3、抗cd28、抗cd27以及抗cd137抗体针对记忆性t细胞的扩增在包括0.01至1.5单位的浓度范围的范围内使用。
条款48.根据条款45、46或47中任一项所述的组合物，其中抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体针对th17细胞的扩增在包括0.06至1.5单位的浓度范围的范围内使用。
条款49.根据条款45至48中任一项所述的组合物，其中抗cd3和抗cd28抗体针对treg细胞的扩增在包括0.34至3.41单位的浓度范围的范围内使用。
条款50.根据条款45至49中任一项所述的组合物，其中抗cd3抗体与抗cd28和抗cd137抗体的浓度相比在较低的浓度下使用。
条款51.一种组合物，其包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增th17细胞的抗cd3、抗cd5、抗cd28、抗icos以及抗cd137抗体，其中所述th17细胞能够产生一种或多种效应细胞因子，并且其中珠粒上存在的抗cd3与抗cd5/icos/cd28/cd137抗体的量不同。
条款52.根据条款51所述的组合物，其中所述一种或多种效应细胞因子选自由以下组成的群组：il-17、il-21以及il-22。
条款53.一种组合物，其包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性扩增经抗原刺激过的记忆性t细胞的抗cd3、抗cd28以及抗cd137抗体，其中t细胞能够识别特异性抗原，并且其中珠粒上存在的抗cd3与抗cd28抗体的量不同。
条款54.根据条款53所述的组合物，其中所述特异性抗原选自由以下组成的群组：病毒抗原、细菌、真菌、原生动物以及癌症抗原。
条款55.根据条款54所述的组合物，其中所述病毒抗原选自由以下组成的群组：cmv、ebv、流感以及hiv。
条款56.根据条款53所述的组合物，其中所述抗原选自由以下组成的群组：链球菌m-蛋白、奈瑟菌属菌毛、伯氏疏螺旋体脂蛋白vise、类鼻疽伯克氏菌多糖抗原、烟曲霉半乳甘露聚糖以及土拉热弗朗西丝菌脂多糖。
条款57.一种组合物，其包含(1)t细胞和(2)珠粒，所述珠粒含有能够选择性地扩增调节性t细胞的抗cd3和抗cd28抗体，其中珠粒上存在的抗cd3与抗cd28抗体的量不同。
条款58.根据条款57所述的组合物，其中所述调节性t细胞为cd4+cd25+foxp3+cd127低/阴性。
条款59.根据条款57或58的组合物，其中所述调节性t细胞的活性包含抑制活性。
条款60.一种治疗有此需要的个体的方法，所述方法包含给所述个体施用药学上可接受的组合物，所述组合物包含th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。
条款61.根据条款60所述的方法，其中所述有此需要的个体受到癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病或感染性疾病的影响。
条款62.根据条款61所述的方法，其中所述癌症为肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌以及皮肤癌。
条款63.根据条款61的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的群组：糖尿病；类风湿性关节炎；炎性肠病；家族性地中海热；新生儿发作多系统炎性疾病；肿瘤坏死因子(tnf)受体-相关的周期性综合症(traps)；白细胞介素-1受体拮抗剂缺失(dira)；全身性红斑狼疮；眼色素层炎；以及白塞氏病。
条款64.一种重建有此需要的个体的免疫系统的方法，所述方法包含给所述个体施用药学上可接受的组合物，所述组合物包含th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。
条款65.一种为有需要的个体提供过继性免疫疗法的方法，所述方法包含给所述个体施用药学上可接受的组合物，所述组合物包含th17细胞、经抗原刺激过的t细胞和/或调节性t细胞。
条款66.根据条款60至65中任一项所述的方法，其中所述t细胞被基因修饰。
条款67.根据条款66所述的方法，其中所述基因修饰为嵌合抗原受体。
条款68.根据条款66所述的方法，其中所述基因修饰为基因修饰的t细胞受体。
条款69.一种用来选择性地改变样品中两种t细胞亚型的比例的方法，所述方法包含将包含混合t细胞群的样品与至少两种刺激剂接触，其中所述刺激剂为混合群中的t细胞提供不同量的信号，其中一种t细胞亚型与第二种t细胞亚型相比会选择性地扩增。
条款70.根据条款69所述的方法，其中所述样品包含从个体得到的血沉棕黄层细胞。
条款71.根据条款69或70所述的方法，其中至少两种刺激信号刺激cd3和cd28受体。
条款72.根据条款69、70或71所述的方法，其中至少一种t细胞亚型被选择性地从混合群除去。
条款73.根据条款69至72中任一项所述的方法，其中tregt细胞相对于混合群中所有的t细胞的比例被增加。
条款74.根据条款69至73中任一项所述的方法，其中样品中记忆性t细胞的总数被降低。
条款75.条款69至74中任一项所述的方法，其中刺激信号cd3的量小于cd28刺激信号的一半。
条款76.一种扩增th17细胞的方法，所述方法包含：
(a)将t细胞群活体外暴露于cd3和cd5信号，和
(b)在容许扩增th17细胞的条件下培养t细胞群，
其中所述t细胞群暴露于芳基烃受体激动剂或者未暴露于外源性白细胞介素-23。
条款77.根据条款76所述的方法，其中所述t细胞群为不同t细胞类型的混合群。
条款78.根据条款76或77所述的方法，其进一步包含将t细胞群与一种或多种极化剂接触。
条款79.根据条款76、77或78的方法，其进一步包含接触，其中一种或多种极化剂为一种或多种选自由以下组成的群组的因子：白细胞介素-1β、白细胞介素-23、肿瘤生长因子-β、白细胞介素-6、白细胞介素-21、白细胞介素-2、抗白细胞介素-4抗体以及抗干扰素γ抗体。
条款80.根据条款76至79中任一项所述的方法，其中所述t细胞群进一步暴露于芳基烃受体激动剂。
条款81.根据条款80的方法，其中所述芳基烃受体激动剂为6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑(ficz)。
条款82.根据条款69至81中任一项所述的方法，其中所述t细胞群进一步暴露于白细胞介素-1β和白细胞介素-6。
条款83.根据条款69至82中任一项所述的方法，其中所述th17细胞被工程化以表达一种或多种嵌合抗原受体。
条款84.根据条款83的方法，其中所述一种或多种嵌合抗原受体中的至少一种对哺乳动物细胞的细胞表面抗原具有特异性。
条款85.根据条款69至84中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞的细胞表面抗原是与肿瘤细胞相关的抗原。
条款86.一种组合物，其包含cd3信号、cd5信号、芳基烃受体激动剂以及一种或多种细胞因子。
条款87.根据条款86所述的组合物，其中所述一种或多种细胞因子包含白细胞介素-1β和白细胞介素-6。
条款88.根据条款86或87的组合物，其进一步包含t细胞群。
条款89.根据条款86、87或89所述的组合物，其中cd3信号为抗cd3抗体。
条款90.根据条款86至89中任一项所述的组合物，其中cd5信号为抗cd5抗体。
条款91.一种组合物，其包含t细胞群、cd3信号、cd5信号、芳基烃受体激动剂以及一种或多种细胞因子。
条款92.根据条款91的组合物，其中所述t细胞群存在于包含以下的混合物中：
(a)“血沉棕黄层”样品，
(b)含有大于80％的混合t细胞的白细胞样品，
(c)含有大于80％的cd4+t细胞的样品，或者
(d)含有大于80％的th17细胞的样品。
条款93.一种分离和活化来自混合细胞群的t细胞的方法，所述方法包含：
(a)在容许t细胞与固体载体结合并活化同一t细胞的条件下，使混合细胞群与固体载体接触，所述固体载体具有与其结合的至少第一配体，所述第一配体对位于混合细胞群中存在的t细胞上的蛋白具有结合亲和力，以及
(b)将与固体载体结合的t细胞从未与固体载体结合的t细胞分离，以获得纯化t细胞群。
条款94.根据条款93所述的方法，其中固体载体具有与其结合的至少第一配体和第二配体，其中第一配体和第二配体中的每一个对位于混合细胞群中存在的单独的t细胞上的不同蛋白均具有结合亲和力。
条款95.根据条款94所述的方法，其中第一配体为抗cd3抗体或抗cd4抗体，并且其中第二配体为选自由以下组成的群组的配体：
(a)抗cd5抗体、
(b)抗cd28抗体、
(c)抗cd137抗体以及
(d)抗icos抗体。
条款96.根据条款93、94或95所述的方法，其进一步包含将步骤(b)中获得的纯化t细胞群的细胞从固体载体释放。
条款97.根据条款96所述的方法，其进一步包含扩增所释放的t细胞。
条款98.根据条款97所述的方法，其中所释放的t细胞的扩增在培养基中发生。
条款99.根据条款98所述的方法，其中培养基中存在一种或多种趋化因子或细胞因子。
条款100.根据条款93至99中任一项所述的方法，其中步骤(a)中存在所述一种或多种趋化因子或细胞因子。
条款101.根据条款100所述的方法，其中所述一种或多种趋化因子或细胞因子选自由以下组成的群组：：
(a)白细胞介素-1α、
(b)白细胞介素-2、
(c)白细胞介素-4、
(d)白细胞介素-1β、
(e)白细胞介素-6、
(f)白细胞介素-12、
(g)白细胞介素-15、
(h)白细胞介素-18、
(i)白细胞介素-21以及
(j)转化生长因子β1。
条款102.一种用来活化和扩增t细胞的方法，所述方法包含将混合t细胞群与以下接触：
(a)第一试剂，其通过刺激t细胞亚群成员上的分子为t细胞亚群成员提供初级活化信号，和
(b)第二试剂，其刺激与被第一试剂刺激的分子不同的t细胞亚群成员上的分子，
由此，群中的t细胞被活化和扩增，
其中第一试剂和第二试剂与一种或多种固体载体结合，
其中t细胞维持在容许扩增的条件下，并且
其中固体载体在小于120小时的时间段之后被从与t细胞的接触移除。
条款103.根据条款102所述的方法，其中第一试剂是抗cd3抗体。
条款104.根据条款102或103所述的方法，其中第二试剂是抗体。
条款105.根据条款102、103或104所述的方法，其中t细胞与第三试剂接触，第三试剂是抗体或非抗体蛋白。
条款106.根据条款105所述的方法，所述非抗体蛋白是趋化因子或细胞因子。