表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒及其应用的制作方法

技术特征：

1.一种制备表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒的方法，其特征在于，所述表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒记为rLS-1VP1-2A-3VP1，是将DHAV-1型和DHAV-3型VP1基因串联后插入到NDV为载体，经拯救获得的重组病毒；所述制备方法包括如下步骤：

(1)采用SOE-PCR方法将DHAV-1型和DHAV-3型VP1基因进行连接，获得DHAV1VP1-2A-3VP1重组基因，具体包括：

(1a)分别以DHAV-1和DHAV-3为材料，利用RT-PCR方法分别扩增得到DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3 VP1基因；并以得到的两组PCR回收产物为模板，利用SOE-PCR方法获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1；

所述DHAV-1进行PCR扩增为DHAV-1VP1-2A基因的引物P1为：

上游引物：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’，

下游引物：5'-CTGATTGGAATCACCTTGATCTGTAGTAAT-3’，

其扩增产物DHAV-1VP1-2A的片段大小为1652bp；扩增产物DHAV-1VP1-2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述DHAV-3进行PCR扩增为DHAV-3 VP1基因的引物P2为：

上游引物：5'-ATTACTACAGATCAAGGTGATTCCAATCAGC-3’，

下游引物：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’，

扩增产物DHAV-3 VP1的片段大小为746bp；扩增产物DHAV-3 VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3 VP1基因进行SOE-PCR扩增获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1基因的引物P3为：

上游引物：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’，

下游引物：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’，

扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的片段大小为2368bp，扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

(1b)将回收的PCR产物，连接至pMD18-T-Vector，经EcoR I/Not I双酶切鉴定，鉴定正确的阳性重组子；

(2)将DHAV1VP1-2A-3VP1基因与LaSota株线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，构建表达DHAV-1VP1-2A-3VP1的重组NDV病毒载体，筛选出阳性克隆；

(3)拯救并获得重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

(2a)以重组质粒pLS-RFP为模板，利用设计的引物，在质粒pLS-RFP的RFP ORF的两端通过反向PCR扩增得到含有LaSota全长cDNA的线性化载体；

(2b)将步骤(1)得到的DHAV1VP1-2A-3VP1基因进行PCR扩增，得到的基因末端含有与LaSota线性化载体末端相同的15bp扩展序列；

(2c)经QIAEXII Gel Extraction Kit回收后，通过In-PCR Cloning Kit将DHAV1VP1-2A-3VP1基因与LaSota线性化载体连接；

(2d)将获得的连接产物转化至Stbl2感受态细胞，30℃培养24h，利用设计的引物进行PCR鉴定和DNA核苷酸序列鉴定，筛选出阳性克隆，命名为pLS-1VP1-2A-3VP1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2a)中，

所述反向PCR扩增得到含有LaSota全长cDNA的线性化载体步骤的引物为：

上游引物：5'-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-3’，

下游引物：5'-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-3’；

扩增产物片段大小为18.524kb；其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述步骤(2b)中，所述PCR扩增DHAV1VP1-2A-3VP1基因末端含有与LaSota线性化载体末端相同的15bp扩展序列引物为：

上游引物：5'-atagttgtagccaccATGGGTGATTCTAACCAGTTG-3’，

下游引物：5'-acggtagttacacacCTAAATCTCCAGATGGAGCTC-3’；

扩增产物的片段大小为2382bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述步骤(2d)中，所述重组质粒pLS-1VP1-2A-3VP1的PCR鉴定步骤的引物为：

上游引物：5'-GCTCCTAAGCAAGTTAGATGC-3’，

下游引物：5'-CCCAACTTGAAAGATGAATCC-3’；

扩增产物片段大小为3048bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中对重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救方法具体包括：

(3a)将表达T7聚合酶的重组牛痘病毒MVA/T7接种于长有90％单层HEp-2细胞的24孔板内，孵育1h后，将1.0μg pLS-1VP1-2A-3VP1、0.5μg pTM-NP、0.25μg pTM-P及0.05μg pTM-L辅助质粒共转染至HEp-2细胞，转染6h后，将转染的细胞用PBS洗涤，并加入含有2％FBS和抗生素的DMEM培养基；至转染72h后，反复冻融转染细胞3次，收获拯救的重组病毒；

(3b)将收获拯救的重组病毒接种至9日龄SPF鸡胚，收获血凝检测为阳性的尿囊液，过滤滤除去痘病毒后，在9日龄SPF鸡胚上连续传代，获得重组病毒，并命名为rLS-1VP1-2A-3VP1，于-80℃保存。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)之后还包括对所述重组病毒进行鉴定的步骤(4)，具体包括：

(4a)将E5代重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本重组毒rLS-RFP分别感染CEF单层细胞，每隔24h收集样品，每个时间点有两个独立重复实验，检测TCID50，以Log10TCID50/ml来表示病毒的效价，并绘制病毒的生长曲线；

(4b)将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本毒LaSota毒株分别感染CEF单层细胞，进行间接免疫荧光试验(IFA)分别检测DHAV-1VP1和DHAV-3VP1基因的表达；

(4c)将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1经点眼滴鼻免疫试验鸭，每羽1ml，一次免疫后10天后采血；将收集的血清于56℃灭活30min后，进行2倍系列稀释，分别与等量200ELD50的DHAV-1和DHAV-3病毒进行中和试验，按Reed-Muench法计算得出该重组毒免疫鸭血清抗DHAV-1和DHAV-3抗体平均效价。

6.权利要求1-5任一所述方法制备得到的表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒。

7.权利要求6所述的重组病毒用于制备预防和治疗鸭甲肝病毒和鸭新城疫病毒疫苗的用途。