表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种共表达DHAV-1型和DHAV-3型的VP1基因的NDV重组病毒，并进一步公开其制备方法。

背景技术：

中国作为世界第一养鸭大国，流行性鸭甲型肝炎频繁发生，由于当前使用的卵黄抗体的防治效果并不稳定，致使鸭甲型肝炎的防控现状不容乐观，不仅给养鸭业造成极大的危害，也对我国食品安全造成一定的隐患。

鸭甲型肝炎主要由鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3)三种病毒引起，目前已知的国内流行毒株均以DHAV-1和DHAV-3为主。VP1基因作为DHAV主要的保护蛋白，编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，也成为了DHAV研究的首选基因。除此之外，目前也发现新城疫病毒(NDV)对鸭的养殖也存在较大的危害，其致病性也正逐渐增强。目前，鸭群感染新城疫病毒病例已有较多报道，其发病率高达20％-60％，死亡率可达10％-15％，个别鸭群的感染率甚至高达90％以上。可见，对于养鸭业的安全而言，不仅DHAV-1和DHAV-3病毒的防治十分重要，对于新城疫病毒的免疫预防也势在必行。

当前对于鸭甲肝病毒(DHAV)的预防主要依赖传统型疫苗，传统的灭活疫苗不仅生产成本高，而且抗体产生也较慢，养殖实验已证实其并不适于雏鸭的免疫预防。现有DHAV-1型弱毒苗根本无法保护日趋严重的DHAV-3病毒，而DHAV-3型弱毒苗尚未获得批准文号，因此，除了对于DHAV-3型病毒的弱毒苗需求迫切外，对于鸭甲肝病毒多价疫苗的需求也十分迫切。

随着分子生物学技术的大力发展，反向遗传操作技术已逐渐发展成熟，NDV被用作病毒载体以研制重组活疫苗的研究也越来越受到重视。现有研究已证实，NDV作为载体最大的优点是可以诱导体液免疫和细胞免疫，可在体内增殖并长期表达抗原基因，不会与宿主基因组整合，安全性要明显优于DNA病毒载体。GeJY等已成功构建了表达H5N1HA基因的重组NDV，能够同时抵抗速发型NDV以及同源和异源HPAIV的攻击。Huang Z H等也已构建的表达IBDV VP2蛋白的重组NDV，均能有效保护NDV强毒株和传染性法氏囊病毒超强毒株的攻击。上述研究均已证实NDV作为疫苗载体能够刺激机体产生较强的免疫反应，并且NDV作为疫苗载体在禽病预防及医学实践中已经显示出了其巨大优势及潜力，具有非常好的应用前景。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种共表达DHAV-1型和DHAV-3型的VP1基因的NDV重组病毒，有效用于当前鸭甲肝病毒和鸭新城疫的预防。

本发明所述的表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒记为rLS-1VP1-2A-3VP1，是将DHAV-1型和DHAV-3型VP1基因串联后插入到NDV为载体，经拯救获得的重组病毒。

本发明还公开了所述表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒的方法，包括如下步骤：

(1)采用SOE-PCR方法将DHAV-1型和DHAV-3型VP1基因进行连接，获得DHAV 1VP1-2A-3VP1重组基因；

(2)将DHAV 1VP1-2A-3VP1基因与LaSota株线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，构建表达DHAV-1VP1-2A-3VP1的重组NDV病毒载体，筛选出阳性克隆；

(3)拯救并获得重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1。

进一步的，所述步骤(1)中，所述获得DHAV 1VP1-2A-3VP1重组基因的步骤具体包括：

(1a)分别以DHAV-1和DHAV-3为材料，利用RT-PCR方法分别扩增得到DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3VP1基因；并以得到的两组PCR回收产物为模板，利用SOE-PCR方法扩增获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1；

(1b)将回收的PCR产物，连接至pMD18-T-Vector，经EcoR I/Not I双酶切鉴定，鉴定正确的阳性重组子。

更优的，所述步骤(1a)中，

所述DHAV-1进行PCR扩增为DHAV-1VP1-2A基因的引物P1为：

上游引物：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’(BamHI)，

下游引物：5'-CTGATTGGAATCACCTTGATCTGTAGTAAT-3’，

其扩增产物DHAV-1VP1-2A的片段大小为1652bp；扩增产物DHAV-1VP1-2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述DHAV-3进行PCR扩增为DHAV-3VP1基因的引物P2为：

上游引物：5'-ATTACTACAGATCAAGGTGATTCCAATCAGC-3’，

下游引物：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’(NOTI)，

扩增产物DHAV-3VP1的片段大小为746bp；扩增产物DHAV-3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3VP1基因进行SOE-PCR扩增获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1基因的引物P3为：

上游引物：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’(BamHI)，

下游引物：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’(NotI)，

扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的片段大小为2368bp，扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述步骤(2)具体包括：

(2a)以重组质粒pLS-RFP为模板，利用设计的引物，在质粒pLS-RFP的RFP ORF的两端通过反向PCR扩增得到含有LaSota全长cDNA的线性化载体；

(2b)将步骤(1)得到的DHAV 1VP1-2A-3VP1基因进行PCR扩增，得到的基因末端含有与LaSota线性化载体末端相同的15bp扩展序列；

(2c)经QIAEXII Gel Extraction Kit回收后，通过In-PCR Cloning Kit将DHAV 1VP1-2A-3VP1基因与LaSota线性化载体连接；

(2d)将获得的连接产物转化至Stbl2感受态细胞，30℃培养24h，利用设计的引物进行PCR鉴定和DNA核苷酸序列鉴定，筛选出阳性克隆，命名为pLS-1VP1-2A-3VP1。

更优的，所述步骤(2a)中：

所述反向PCR扩增得到含有LaSota全长cDNA的线性化载体步骤的引物为：

上游引物：5'-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-3’，

下游引物：5'-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-3’；

扩增产物片段大小为18.524kb；其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述步骤(2b)中，所述PCR扩增DHAV 1VP1-2A-3VP1基因末端含有与LaSota线性化载体末端相同的15bp扩展序列引物为：

上游引物：5'-atagttgtagccaccATGGGTGATTCTAACCAGTTG-3’，

下游引物：5'-acggtagttacacacCTAAATCTCCAGATGGAGCTC-3’；

扩增产物的片段大小为2382bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述步骤(2d)中，所述重组质粒pLS-1VP1-2A-3VP1的PCR鉴定步骤的引物为：

上游引物：5'-GCTCCTAAGCAAGTTAGATGC-3’，

下游引物：5'-CCCAACTTGAAAGATGAATCC-3’；

扩增产物片段大小为3048bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步的，所述步骤(3)中对重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救方法具体包括：

(3a)将表达T7聚合酶的重组牛痘病毒MVA/T7接种于长有90％单层HEp-2细胞的24孔板内，孵育1h后，将1.0μg pLS-1VP1-2A-3VP1、0.5μg pTM-NP、0.25μg pTM-P及0.05μg pTM-L辅助质粒共转染至HEp-2细胞，转染6h后，将转染的细胞用PBS洗涤，并加入含有2％FBS和抗生素的DMEM培养基；至转染72h后，反复冻融转染细胞3次，收获拯救的重组病毒；

(3b)将收获拯救的重组病毒接种至9日龄SPF鸡胚，收获血凝检测为阳性的尿囊液，过滤滤除去痘病毒后，在9日龄SPF鸡胚上连续传代，获得重组病毒，并命名为rLS-1VP1-2A-3VP1，于-80℃保存。

进一步的，所述步骤(3)之后还包括对所述重组病毒进行鉴定的步骤(4)，具体包括：

(4a)将E5代重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本重组毒rLS-RFP分别感染CEF单层细胞，每隔24h收集样品，每个时间点有两个独立重复实验，检测TCID50，以Log10TCID50/ml来表示病毒的效价，并绘制病毒的生长曲线；

(4b)将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本毒LaSota毒株分别感染CEF单层细胞，进行IFA分别检测DHAV-1VP1和DHAV-3VP1基因的表达；

(4c)将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1经点眼滴鼻免疫试验鸭，每羽1ml，一次免疫后10天后采血；将收集的血清于56℃灭活30min后，进行2倍系列稀释，分别与等量200ELD50的DHAV-1和DHAV-3病毒进行中和试验，按Reed-Muench法计算得出该重组毒免疫鸭血清抗DHAV-1和DHAV-3抗体平均效价。

本发明还公开了上述方法制备得到的表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒。

本发明还公开了所述的重组病毒用于制备预防和治疗鸭甲肝病毒和鸭新城疫疫苗的用途。

本发明所述重组病毒选择NDV(Lasota株)为载体，将DHAV-1型和DHAV-3型的VP1基因串联后插入到NDV(Lasota株)载体，利用表达T7聚合酶的重组牛痘病毒MVA/T7和辅助质粒，拯救出共表达DHAV-1型和DHAV-3型的VP1基因的NDV重组病毒，可用于鸭甲肝病毒(1型、3型)和鸭新城疫的预防，弥补当前DHAV-3疫苗的空白。同时，本发明所获得的多联疫苗的应用可降低疫苗生产成本、简化免疫程序、减少免疫应激，克服不同病毒弱毒苗间产生的干扰现象，促进养鸭业的健康发展。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1是为DHAV-1VP1-2A-3VP1的扩增电泳图，其中M为DNA Marker DL15000、1为DHAV-1VP1-2A的扩增结果、2为DHAV-3VP1的扩增结果、3为DHAV-1VP1-2A-3VP1的扩增结果；

图2是重组质粒pLS-1VP1-2A-3VP1的PCR鉴定电泳图，其中M为DNA Marker DL15000的结果、1为载体质粒pLS-RFP的结果、2为重组质粒pLS-1VP1-2A-3VP1的结果；

图3是重组病毒的1VP1-2A-3VP1基因的RT-PCR电泳图，其中M为DNA Marker DL15000、1为重组病毒rLS-1VP1-3VP1、2为重组病毒rLS-RFP；

图4是重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的生长曲线；

图5是间接免疫荧光检测DHAV 1VP1和DHAV 3VP1蛋白的表达结果(×200倍)，其中1为鼠抗DHAV-1血清与重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1；2为鼠抗DHAV-3血清与重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1；3为鼠抗DHAV-1血清与LaSota；4为鼠抗DHAV-3血清与LaSota。

具体实施方式

实施例1DHAV-1型、DHAV-3型的VP1基因的连接

参照GenBank收录的鸭肝炎病毒DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3VP1基因核苷酸序列，分别以DHAV-1和DHAV-3为材料，利用常规RT-PCR方法分别扩增得到DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3VP1基因。根据说明书，利用Trizol试剂提取DHAV-1和DHAV-3病毒RNA，利用下述1VP1-2A-F/1VP1-2A-SOE-R、3VP1-SOE-F/3VP1-R引物分别扩增得到DHAV-1VP1-2A和DHAV-3VP1基因。

所述DHAV-1进行PCR扩增为DHAV-1VP1-2A基因的引物P1为：

1VP1-2A-F：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’(BamHI)，

1VP1-2A-SOE-R：5'-CTGATTGGAATCACCTTGATCTGTAGTAAT-3’；

其扩增产物DHAV-1VP1-2A的片段大小为1652bp；扩增产物DHAV-1VP1-2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述DHAV-3进行PCR扩增为DHAV-3VP1基因的引物P2为：

3VP1-SOE-F：5'-ATTACTACAGATCAAGGTGATTCCAATCAGC-3’，

3VP1-R：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’(NOTI)。

扩增产物DHAV-3VP1的片段大小为746bp；扩增产物DHAV-3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

经凝胶回收后，以上述得到的两组PCR回收产物为模板，以1VP1-2A-F和3VP1-R为引物进行融合基因DHAV 1VP1-2A-3VP1目的片段的扩增(结果见图1)，利用PCR方法融合获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1。

所述DHAV-1VP1-2A基因和DHAV-3VP1基因进行PCR扩增融合获得重组基因DHAV-1VP1-2A-3VP1基因的引物P3为：

1VP1-2A-F：5'-TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG-3’(BamHI)，

3VP1-R：5'-AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT-3’(NotI)；

扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的片段大小为2368bp，扩增产物DHAV-1VP1-2A-3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

将回收的PCR产物，连接至pMD18-T-Vector，经EcoR I/Not I双酶切鉴定，鉴定正确的阳性重组子pT-1VP1-2A-3VP1送上海英潍捷基贸易有限公司测序。

实施例2表达DHAV-1VP1-2A-3VP1重组新城疫病毒的构建

以含有LaSota全长cDNA的重组质粒pLS-RFP(P基因和F基因间插有RFP报告基因)为模板，利用自行设计的引物LS-P-up和LS-F-down在质粒pLS-RFP的RFP ORF的两端通过反向PCR扩增得到含有LaSota全长cDNA的线性化载体：

LS-P-up：5'-GGTGGCTACAACTATCAACTAAACT-3’，

LS-F-down：5'-GTGTGTAACTACCGTGTACTAAGC-3’；

扩增产物片段大小为18.524kb；其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

利用特异性引物plant-VP1-F和plant-VP1-R扩增DHAV 1VP1-2A-3VP1基因，得到的基因末端含有与LaSota线性化载体末端相相同的15bp扩展序列：

plant-VP1-F：5'-atagttgtagccaccATGGGTGATTCTAACCAGTTG-3’，

plant-VP1-R：5'-acggtagttacacacCTAAATCTCCAGATGGAGCTC-3’；

扩增产物的片段大小为2382bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

经QIAEXII Gel Extraction Kit回收后，通过In-PCR Cloning Kit将DHAV 1VP1-2A-3VP1基因与LaSota线性化载体连接；并将连接产物转化Stbl2感受态细胞，30℃培养24h，通过引物LS-J-up、LS-J-down进行PCR鉴定(结果见图2)，筛选出阳性克隆，命名为pLS-1VP1-2A-3VP1；

LS-J-up：5'-GCTCCTAAGCAAGTTAGATGC-3’，

LS-J-down：5'-CCCAACTTGAAAGATGAATCC-3’；

扩增产物片段大小为3048bp；所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例3重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1的拯救

将表达T7聚合酶的重组牛痘病毒MVA/T7(MOI＝3)接种于长有90％单层HEp-2细胞的24孔板内，孵育1h后，按照LipofectamineTM2000(Invitrogen)说明书将1.0μg pLS-1VP1-2A-3VP1、0.5μg pTM-NP、0.25μg pTM-P及0.05μg pTM-L辅助质粒共转染HEp-2细胞。转染6h后，将转染的细胞用PBS洗一次，加入含有2％FBS和抗生素的DMEM培养基。转染72h后，反复冻融3次转染细胞，收获拯救的重组病毒，并将其接种9日龄SPF鸡胚，收获尿囊液，将血凝(HA)检测为阳性的尿囊液用0.22um的过滤器过滤除去痘病毒，并在9日龄SPF鸡胚上连续传代，收获的病毒保存在-80℃，将重组病毒命名为rLS-1VP1-2A-3VP1。重组病毒在SPF鸡胚连续传代的前4代HA试验结果分别为4log2、6log2、8log2、8log2。

实施例4重组病毒的RT-PCR鉴定

将rLS-1VP1-2A-3VP1在9日龄SPF鸡胚连续传代5次，采用TRIzol法提取鸡胚尿囊液重组病毒RNA，以plant-VP1-F和plant-VP1-R为引物，利用RT-PCR方法扩增出2345bp的目的产物(结果见图3)，进一步测序结果显示，重组病毒基因组的预期位点正确插入了DHAV 1VP-2A-3VP1基因。

实施例5重组病毒滴定、致病性及生长动力学检测

重组病毒效价和滴定分别通过HA、鸡胚半数感染量(EID50)和组织半数感染量(TCID50)来测定。致病性分析按O.I.E标准分别通过平均鸡胚致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉内致病指数(IVPI)等致病性试验来评估。将E5代重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本重组毒rLS-RFP分别感染CEF单层细胞(MOI＝0.01)，每隔24h收集样品，每个时间点有两个独立重复实验，检测TCID50，以Log10TCID50/ml来表示病毒的效价，并绘制病毒的生长曲线，其体外生长动力学与亲本病毒rLS-RFP相似(结果见图4)。

重组病毒株rLS-1VP1-2A-3VP1第五代的EID50为107.2/0.1ml；MDT大于120h，ICPI和IVPI均为0，按照OIE判定标准(MDT≥90h，ICPI＜0.5，IVPI＝0)，rLS-1VP1-2A-3VP1仍为弱毒株，且保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性(结果见下表1)。

表1重组新城疫病毒生物学特性鉴定

实施例6间接免疫荧光试验(IFA)

将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1和亲本毒LaSota毒株(MO＝1.0)分别感染CEF单层细胞，37℃培养24h，用预冷的丙酮乙醇(3:2)室温固定7min，以鼠抗DHAV-1高免血清和鼠抗DHAV-3高免血清为一抗，以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，进行IFA分别检测DHAV-1VP1和DHAV-3VP1基因的表达。结果显示以鼠抗DHAV-1和鼠抗DHAV-3高免血清为一抗检测rLS-1VP1-2A-3VP1感染细胞均成呈阳性荧光反应；而以鼠抗DHAV-1和鼠抗DHAV-3高免血清为一抗检测LaSota感染细胞未观察到阳性反应；正常细胞均呈阴性反应(结果见图5)。

实施例7种鸭免疫试验

将E5代重组毒rLS-1VP1-2A-3VP1(病毒毒价107.2EID50/0.1ml)经点眼滴鼻免疫试验鸭，每羽1ml，免疫后10天后采血。将收集的血清于56℃灭活30min后，进行2倍系列稀释，分别与等量200ELD50的DHAV-1和DHAV-3病毒混匀，37℃作用1h，每组接种5枚鸭胚，0.2mL/胚。同时设病毒对照组和生理盐水对照组，37℃恒温孵化观察7d，按Reed-Muench法计算得出该重组毒血清抗DHAV-1和DHAV-3抗体平均中和效价均大于1：16。

可见，本发明所述重组病毒可有效用于预防和治疗鸭甲肝病毒和鸭新城疫疫苗。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。