固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异性检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异检测方法及试剂盒，特别涉及一种PCR检测方法及试剂盒。

背景技术：
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固氮施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)是一株1980年分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌，属于变形细菌γ亚群，是目前假单胞菌属中发现的少数具有固氮特性的农业微生物菌株之一。固氮施氏假单胞菌A1501在微好氧条件下具有良好的固氮活性，而且固氮产物能够迅速被水稻直接吸收利用，具有良好应用潜力的农业微生物。2005年完成了该菌的全基因组测序及功能注释工作。该基因组全长4567418bp，编码4146个ORFs，是国际上第一例完成全基因组测序的联合固氮菌。

在生物固氮研究中，采用生物技术选育高效固氮菌是提高田间应用效果的可行途径。随着固氮菌在农业生产上的推广应用，定会与大量人群接触而将其散布到自然环境中。由于这些菌株是通过基因工程选育的，可能引入人工重组DNA，因此对其安全性必须认真对待。而对菌的检测保证其安全性的重要工作内容。目前尚未有任何关于农业微生物菌株固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测方法及试剂盒，本发明的直接目的，是提供合适的用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测引物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明根据固氮施氏假单胞菌A1501菌株基因组序列特征，设计了用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测引物。经实验证实，所设计的引物对具有极好的扩增效果，可以用于固氮施氏假单胞菌A1501菌株的特异性检测。

所述引物是引物对1，其核苷酸序列为：

引物对1：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

用本发明提供的PCR检测引物，与本常规PCR检测试剂盒的其它成分，可组合为一种用于检测固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR检测试剂盒。

一种固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性的PCR定性检测方法，其特征在于使用前述的PCR检测引物对1。

本发明所述的检测方法的具体操作步骤如下：

(1)提取待检测样品的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，用所述引物对1建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增；

(3)根据是否能扩增出核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA片段的条带，鉴定被检测的样品是否为固氮施氏假单胞菌A1501菌株：

如果扩增出该条带，则确定是固氮施氏假单胞菌A1501；如果不能扩增出，则确定不是。

其中，所述提取待检测样品的DNA的方法，可以选用本领域从样本材料中提取DNA的任何方法，例如可以是CTAB法、溶菌酶法或SDS裂解法等。

本发明考察了PCR反应体系和扩增条件对检测效果有影响。发现PCR反应体系中引物的终浓度以及退火温度影响检测结果的特异性、灵敏度；在引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃时，检测结果的特异性最强，灵敏度最高。

本方法所述的PCR扩增体系为：反应体系的总体积为20.0μL，其中，10×PCR缓冲液2μL，dNTPs混合溶液2μL，10μmol/L SEQ ID No.1所示的引物1.0μL，10μmol/L SEQ ID No.2所示的引物1.0μL，5U/μL Go Taq酶0.2μL，25mg/L DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。

所述的PCR扩增条件优选为：96℃，5min；96℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5min。

本发明的效果：

采用本发明建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性PCR定性检测方法对多个菌株进行了检测，检测的菌株的包括：施氏假单胞菌P.stutzeri RCH2、施氏假单胞菌P.stutzeri CCUG29243、铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1、恶臭假单胞菌P.putida、荧光假单胞菌P.Fluorescens、大肠杆菌E.coli K12、枯草芽孢杆菌B.subtilis、耐辐射异常球菌D.radiodurans进行了定性检测。

定性PCR扩增结果表明，仅在固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(836bp)；并且通过测序分析证实转固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。而在其它所有菌株基因组中均没有扩增得到目的片段大小的片段。

以上实验结果表明：本发明所建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法具有较强的特异性。

附图说明

图1PCR反应体系中引物1终浓度和退火温度优化结果：M：Trans 2K plus II DNA Marker；1-5引物终浓度为0.1μM/L；1：55℃；2：56℃；3：58℃；4：60℃；5：62℃；6-10引物终浓度为0.2μM/L；6：55℃；7：56℃；8：58℃；9：60℃；10：62℃；11-15引物终浓度为0.5μM/L；11：55℃；12：56℃；13：58℃；14：60℃；15：62℃；16-20引物终浓度为1.0μM/L；16：55℃；17：56℃；18：58℃；19：60℃；20：62℃。

图2转化体方法特异性检测；M：Trans 2K plus II DNAMarker；1：空白对照；2：阴性对照；3：A1501样品；4-11：分别为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8。

实施例1基于固氮施氏假单胞菌A1501菌株基因组序列建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法

一、固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性检测引物的设计

根据固氮施氏假单胞菌A1501基因组特异性序列为靶序列设计4对转化体特异性引物，引物序列如下：

引物1：扩增产物片段大小为836bp

1-F：CGATTTCGGCTTCATCAATT(SEQ ID No.1)

1-R：TGCTGGCTCTGTTTCTCTGC(SEQ ID No.2)

二、菌株基因组DNA的提取与检测

1菌株DNA提取

(1)取细菌培养液1-5ml，离心去上清；

(2)1ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，并轻柔混合，65℃水浴40min，期间颠倒混匀数次；

(3)12000r/min离心15min。转移上清至一新离心管，加入等体积酚、氯仿-异戊醇(24：1)，充分混合。重复本操作1次；

(4)12000r/min离心10min，取上清，加入2/3体积异丙醇，1/10体积乙酸钠。-20℃放置2小时或更长时间；

(5)12000r/min离心10min，弃上清，加入500μL，70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。离心，弃上清，充分挥发乙醇，干燥DNA。

(6)加100μl水溶解DNA，用重蒸馏水将DNA溶液浓度调制为100ng/μl，储存于-20℃备用。

备注：CTAB提取缓冲液的配制

600mL蒸馏水中加入81.7g NaCl和20g CTAB,再加入100mL的1M Tris-HCl(pH 7.5)溶液，100mL的0.5M EDTA(pH 8.0)溶液，调pH至8.0，加水定容至1000mL。高温高压(103.4kPa/121℃)条件下灭菌20min后使用。

2 DNA检测

取5ul提取的DNA溶液，以1.0％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来判断DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度和纯度。

三、检测引物

所使用的检测引物为引物对1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。四、PCR反应体系和条件优化

调整优化PCR反应体系中引物的终浓度，设置0.1μM、0.2μM、0.5μM、1.0μM等4个浓度梯度，并以55℃、56℃、58℃、60℃、62℃为退火温度进行PCR反应的扩增。

结果表明，在所设的不同引物浓度和不同退火温度条件下均能扩增出预期大小的片段，但在引物终浓度为0.2μM、退火温度为56℃时效果最好(图1)。

经过优化，固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测的体系见表1，PCR反应程序见表2。

表1固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测体系

表2固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR反应程序

实施例2固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法的特异性分析

一、实验材料

样品1：施氏假单胞菌P.stutzeri RCH2。

样品2：施氏假单胞菌P.stutzeri CCUG29243。

样品3：铜绿假单胞菌P.aeruginosa PAO1。

样品4：恶臭假单胞菌P.putida。

样品5：荧光假单胞菌P.Fluorescens。

样品6：大肠杆菌E.coli K12。

样品7：枯草芽孢杆菌B.subtilis。

样品8：耐辐射异常球菌D.radiodurans。

以上实验材料由中国农科院生物技术研究所提供。

二、实验方法及结果

以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检测引物对，按照实施例2所建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株特异性定性PCR检测方法对各种材料进行扩增。结果表明，固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(836bp)，在其他样品基因组中均未扩增得到目的片段大小的片段(图2)。通过测序分析表明固氮施氏假单胞菌A1501基因组中扩增获得的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明，引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2建立的固氮施氏假单胞菌A1501菌株异性定性PCR检测方法具有高度特异性。