ArenimonasdonghaensisDSM18148蛋白的新用途的制作方法

本发明涉及streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的新用途，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：streptomyceshirsutusatcc19091蛋白是来源于streptomyceshirsutus的一种蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列2。用于其编码的基因序列为序列表中序列1。技术实现要素：本发明的目的是提供了streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的一种新用途，具体来说，是指其作为催化剂的用途。更进一步地，是用以催化l-赖氨酸盐酸盐或l-赖氨酸生物转化制备l-2-哌啶甲酸的反应。为了实现streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的催化作用，我们需要获得一种可以高效表达这一蛋白的菌体，从而以全细胞催化剂的形式将其加入到反应体系中。在本发明中，我们选定的用于高效表达streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的菌体为大肠杆菌。然而，在streptomyceshirsutusatcc19091中用以编码streptomyceshirsutusatcc19091蛋白的野生型基因序列gc含量过高，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整dna序列的gc含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。首先，我们利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3。按照图1的方式构建含有seqidno.3的表达质粒。挑取含有seqidno.3的表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。将所收集得到的大肠杆菌作为全细胞催化剂加入至l-赖氨酸盐酸盐生物转化制备l-2-哌啶甲酸的反应中，从而获得了一种高效率的生物催化系统。这一系统具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。附图说明图1为seqidno.3的表达质粒图谱图2为含有seqidno.3表达质粒的大肠杆菌的sds-page图谱。图3为生物转化反应的tlc图谱图4为l-2-哌啶甲酸的hplc谱图图5为l-2-哌啶甲酸的ms谱图具体实施方式为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。以下实施例中涉及到的tlc检测中：展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。以下实例中涉及到的lc-ms检测条件为：prevailc18色谱柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(elsd)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4l/min；进样体积：10μl。实施例1将streptomyceshirsutusatcc19091置于atccmedium196培养基中培养，控制温度为26.0℃，180rpm培养2天，离心收集沉淀，用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen，germany)提取纯化streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna。用pfu高保真酶对streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna进行pcr扩增，所用引物为shi-f5'atcttgcaagctgagcgcacg3'shi-r5'tcatcgtcgcgctccggc3'由于streptomyceshirsutusatcc19091的dna局部gc含量接近80％，故在扩增时添加终浓度0.5m的甜菜碱。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟，在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.1，相应的氨基酸序列为seqidno.2实施例2通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整dna序列的gc含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3。实施例3挑取含有seqidno.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。结果见图2，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。sds-page蛋白胶显示，含有seqidno.3表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。实施例4加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，50g/l含有seqidno.3表达质粒的菌体，55g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，当反应16小时时，检测结果如图3，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为32g/l。同时取样进行lc-ms检测，检测结果如图4，图5所示。当我们在体系中加入l-赖氨酸的时候，其快速转变为l-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。sequencelisting<110>南京诺云生物科技有限公司<120>arenimonasdonghaensisdsm18148蛋白的新用途<130>2016<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>1053<212>dna<213>arenimonasdonghaensis<400>1atgaccatgacccagctcaccacccaggacctgacccagatcgtcgcgacccacggcctg60ccgaccctgctcggccgcctggtggactacctggaggccgacttccggcgctgggaggac120ttcgacaagagcccgcgttcggcggcccactccccgggcggcgtgatcgaactgatgccg180gtcgccgataccaaggaatacagcttcaagtacgtcaacggccacccgggcaacaccaag240ctgggcctgtccaccgtggtggccttcggcgtgctcgccgacgtcgataccggcatgccg300accctgatcagcgaactgaccctgaccaccgcgctgcgcaccgccgccacctcggtgatg360gcggccaagctgctggcgcgcaaggattccaggaccatggcgctgatcggcaacggcgcc420cagagcgagttccaggcgctggccttccaccacctgctgggcatccaggaagtgcgtgtg480tacgacgtcgacccggccgccaccgacaagctggtgcgcaacctggccgcggccgcgccg540gaactgcgcgtggtgcgcagcaccggcgtcgcccaggccgtgcgcggcgccgacatcgtc600accaccgtcaccgcggacaaggccaatgccgacatcctgacgccggaaatgatcgagccg660ggcatgcacctcaacgccgtcggcggcgactgcccgggcaagaccgaactggccacggag720gtggtcgccaacgcctcggtgttcgtcgagttcgagccgcagtcgcgcatcgaaggcgag780gtgcagcagatgcccgccaactccccggtcaccgaactgtggcgcgtgctgaccatgcag840gccgccggccgccgcaacatcgccgaggtcaccctgttcgactcggtcggtttcgcgctg900gaggattattcggcgctgcgcctggtgcgcgattgcgccaaggaaatgggcctgggccgc960gaagccag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