一种测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质及其制备和应用的制作方法

本发明核磁测定领域，具体涉及一种测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质。

背景技术：

核磁共振波谱学在有机化合物的结构鉴定中具有不可或缺的作用，作为经典的核磁共振参数化学位移(δ)，耦合常数(j)以及noe(nuclearoverhausereffectorenhancement)效应，是有机化学家日常实验中必用的信息用来推测绝大部分的有机小分子和生物大分子的结构。然而，这些各向同性参数在化合物结构鉴定方面也存在着固有的局限。

残留偶极耦合(residualdipolarcoupling,rdc)[tjandra,n.；bax,a.science,1997,278,1111.]可以提供两个直接相连或者非直接相连的核之间的结构信息，其大小与两个核之间的距离以及两个核之间的键矢量相对于外界静磁场的角度有关。其值与原子的空间排列相关，反映了分子的构造，构型以及优势构象，是研究分子立体结构的一个新的重要的核磁共振参数，与noe和3j耦合常数的短程信息互补。

然而，残留各向异性参数的采集需要将待测样品置于一定定向程度的各向异性环境体系中，与各向同性的溶液体系和强各向异性的固体有别，即所谓“半液半固”体系。调控分子在一定程度的定向本身极具挑战性，而对于有机分子的检测，不像同位素标记的蛋白，背景的需要扣除，不能兼容定向介质浓度过高，而且有机分子的极性范围广，徒增了其分析检测的难度，因此发展十分缓慢。自rdc在弱液晶定向体系(水相)被检测以后，随后液晶和凝胶定向介质得以发展，其应用金鳞乍现[a,venditti,v.；egner,t.k.；clore,g.m.；chem.rev.,2016,116,6305.；b,tolman,j.r.；ruan,k.chem.rev.,2006,106,1720.；c,prestegard,j.h.；bougault,c.m.；kishorea.i.chem.rev.,2004,104,3519.d,schmidts,v.magn.reson.chem.,2017,55,54.；eg.luy.b.annu.rep.nmrspectrosc.,2009,68,193.fmevers,e.etal.,j.am.chem.soc.,2016,138,12324.；g,waratchareeyakul,w.；j.nat.prod.,2017,doi:10.1021/acs.jnatprod.6b00906.]。事实上，1963年在液晶体系中就检测了nmr图谱，但由于定向太强，耦合复杂，难以解析，未能挖掘应用[a.saupe.phys.rev.lett.1963,11,462.]。可是就目前所使用的弱定向溶致液晶体系屈指可数[prestegard,j.h.；bougault,c.m.；kishorea.i.chem.rev.,2004,104,3519.]，水相中有pf1噬菌体(hansen,m.r.；mueller,l.；pardi,a.nat.struct.biol.1998,5,1065.)，dmpc:dhpc胶粒(bicelle)[a,venditti,v.；egner,t.k.；clore,g.m.；chem.rev.,2016,116,6305.]，ottingphasec12e5:hexanol液晶[rückert,m.otting,g.j.am.chem.soc.,2000,122,7793]，dna-based液晶[douglas,s.m.；chou,j.j.；shih,w.m.pnas,2007,104,6644.]；氧化石墨烯go液晶[lei,x.x.etal.,j.am.chem.soc.,2014,136,11280.]；有机溶剂氯仿体系的pblg高分子液晶[schmidts,v.magn.reson.chem.,2017,55,54.]；dmso体系基于高分子嫁接的go液晶[zong,w.etal,angew.chem.int.ed.2016,55,3690.]。目前尚缺中等极性的具有广泛溶解能力的甲醇体系。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质，本发明提供了一种低浓度、易得的、可商业化的多肽自组装体系的液晶，并将其应用于有机溶剂体系的核磁共振残留偶极耦合测定。

本发明提供了一种测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质，包括：有机溶剂和溶解在有机溶剂中的多肽，其中，该多肽的序列为aaklvff(或者ala-ala-lys-leu-val-phe-phe；丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸；名字为丙氨酰-丙氨酰-赖氨酰-亮氨酰-缬氨酰-苯丙氨酰-苯丙氨酸)，其结构如下所示：

上述定向介质中个，多肽分子自主装的液晶即为核磁共振定向介质，其特征是液晶表现为多肽的自主装体，其能够定向有机溶剂体系的分子，实现核磁共振残留偶极耦合值的测定。

优选地，所述多肽在所述测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质中的浓度为5mg-40mg/ml。

优选地，所述有机溶剂含有甲醇或氘代甲醇。

优选地，所述有机溶剂还含有丙酮、氘代丙酮、二甲基亚砜或氘代二甲基亚砜的其中之一或其组合。进一步优选地，所述有机溶剂中甲醇或氘代甲醇的体积百分比含量不低于70％。

优选地，所述测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质的温度为-20～50℃。

本发明还提供上述的测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质的制备方法，取多肽溶解于有机溶剂中。

优选地，上述的制备方法，包括如下步骤：取多肽，加入有机溶剂，放置并冰箱保存，并不时取出上下来回混匀，在剪切力的作用，促进液晶的组装，至多肽粉末将完全溶解，并组装成流动性很好的液晶相。

本发明还提供上述的测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质的应用：将待测物溶解到所述测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质中，进行核磁共振实验测定待测物的残留偶极耦合值。

本发明提供多肽液晶作为测定核磁共振残留偶极耦合的定向介质的应用，所述多肽液晶包括：有机溶剂和溶解在有机溶剂中的多肽，其中，该多肽的序列为aaklvff，其结构如下所示：

所述多肽液晶中多肽的浓度为5mg-40mg/ml。所述有机溶剂含有甲醇或氘代甲醇。优选地，所述有机溶剂还含有丙酮、氘代丙酮、二甲基亚砜或氘代二甲基亚砜的其中之一或其组合。进一步优选地，所述有机溶剂中甲醇或氘代甲醇的体积百分比含量不低于70％。

本发明能够达到以下效果：

本发明的核磁共振残留偶极耦合的定向介质是以多肽为单体进行自组装，在甲醇及其与丙酮等溶剂的混合液中形成溶致液晶，通过该溶致液晶溶解中等极性的有机分子，实现对中等极性的有机分子的一定程度的定向作用，实现核磁共振残留偶极耦合测定，从而进行有机分子或天然产物的构型测定。

附图说明

图1a为多肽粉末在核磁管里及加入甲醇形成液晶的样品。

图1b为液晶样品氘核磁共振实验，四极裂分为18.30hz。

图2是各种浓度多肽液晶在293k下的氘实验。

图3为赤霉酸在40mg/ml多肽液晶中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

图4为赤霉酸ga3的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

图5.蒿甲醚在40mg/ml多肽液晶中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

图6为蒿甲醚ga3的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

图7为巨大戟醇在40mg/ml多肽液晶中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

图8为巨大戟醇的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

图9为银杏内酯b在16mg/ml多肽液晶中(灰色)和氘代甲醇(70％)和氘代丙酮(30％)混合溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

图10为银杏内酯b的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

图11为放线菌素d在40mg/ml多肽液晶中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

图12为放线菌素d的rdc检测值与其晶体与dna复合结构的计算值的线性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

1、多肽液晶的配置形成

本发明的以下实施例中所用的多肽的序列为aaklvff(或者ala-ala-lys-leu-val-phe-phe；丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸；名字为丙氨酰-丙氨酰-赖氨酰-亮氨酰-缬氨酰-苯丙氨酰-苯丙氨酸)，其结构如下所示：

称取20mg多肽粉末(aaklvff)置于5mm的核磁管中，加入500ul的氘代甲醇溶解，放置并冰箱保存，并不时取出上下来回混匀，在剪切力的作用，能促进液晶的组装。3天左右，多肽粉末将完全溶解，并组装成流动性很好的液晶相，通过氘核磁共振实验测试，四极裂分值为18.3hz，证实为具有各项异性的液晶相。即可进行有机分析的核磁共振残留偶极耦合测定。结果如图1a，图1b和图2所示，图1a为多肽粉末在核磁管里及加入甲醇形成液晶的样品，图1b，为液晶样品氘核磁共振实验，四极裂分为18.30hz。

配制不同浓度的液晶(多肽溶于氘代甲醇，操作步骤同上)，在293k下的进行氘实验，结果如图2所示，随着浓度的增加定向强度增加，表现出可以调节定向程度的能力；即使多肽的浓度在6mg/ml都能形成液晶相，而且稳定。

2、为证实多肽溶于甲醇体系溶液形成的液晶作为定向介质的实用性，以下将用几个例子说明：

分别选取植物激素赤霉酸(ga3)，抗疟疾药蒿甲醚(artemether)，天然产物巨大戟醇(ingenol)，银杏内酯b(ginkgolideb)和抗癌药物放线菌素d(actinomycind)为模式分子。其中，植物激素赤霉酸(ga3)，抗疟疾药蒿甲醚(artemether)，天然产物巨大戟醇(ingenol)和抗癌药物放线菌素d(actinomycind)分别溶解与甲醇体系液晶(多肽溶于氘代甲醇，操作步骤同上，多肽在氘代甲醇中的浓度为40mg/ml)中。由于银杏内酯在甲醇的溶解性比较差，因此，银杏内酯b溶解在甲醇与丙酮混合体系的液晶中(多肽溶于氘代甲醇和氘代丙酮的混合溶液中(其中氘代甲醇所占的体积百分比含量为70％)，操作步骤同上，多肽在氘代甲醇和氘代丙酮混合溶液中的浓度为40mg/ml)。

3、核磁共振实验条件

核磁共振实验在brukeravance600mhz谱仪上进行(600.11mhz，¹hnmr；92.12mhz，²hnmr150.91mhz，¹³cnmr。参数的设置如下：1h谱谱宽10ppm，13碳谱谱宽140ppm,弛豫延时(rd)为2s，采样点数为4k，累加次数为2次。二维实验脉冲序列为clip-hsqc，直接维在10ppm谱宽采用4k的数据点，一键的耦合常数采用145hz，在傅立叶变换前f2和f1维的窗函数分别采用1hz和0.3hz，数据的处理软件采用brukertopspin3.5pl6。各取10mg样品溶解于不同浓度的液晶定向介质。

4、计算方法

结构能量和频率优化中的dft计算采用gamess2014版本[m.w.schmidt,etal,j.comput.chem.1993,14,1347.]，机组与理论采用b3pw91-d3[l.goerigk,s.grimme,chem.chem.phys.2011,13,6670.]/pcseg-1[f.jensen,j.chem.theorycomput.2014,10,1074.]。核磁共振残留偶极耦合rdc的计算拟合采用mspin软件[navarro-vàzquez,a.magn.reson.chem.2012,50,s73.]。

5、实施例分析

实施例1

植物激素赤霉酸测试

图3为赤霉酸在40mg/ml多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

表1，赤霉酸在各项异性的多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)和各项同性氘代甲醇溶液中的c-h一键耦合值、rdc以及计算的rdc值。

赤霉酸ga3的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图见图4。

实施例2

抗疟疾药蒿甲醚测试

图5为蒿甲醚在40mg/ml多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

表2，蒿甲醚在各项异性的多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)和各项同性氘代甲醇溶液中的c-h一键耦合值、rdc以及计算的rdc值。

图6为蒿甲醚ga3的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

实施例3

天然产物巨大戟醇ingenol测试

图7.巨大戟醇在40mg/ml多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)中(灰色)和各项氘代同性甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

表3，巨大戟醇在各项异性的多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)和各项氘代同性甲醇溶液中的c-h一键耦合值、rdc以及计算的rdc值。

图8，巨大戟醇的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

实施例4

天然产物银杏内酯b测试

图9为银杏内酯b在16mg/ml多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇和氘代丙酮的混合溶液)中(灰色)以及氘代甲醇(70v％)和氘代丙酮(30v％)混合溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

表4，银杏内酯b在各项异性的多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇和氘代丙酮的混合溶液)和各项同性溶液(氘代甲醇(70v％)和氘代丙酮(30v％)混合溶液)中的c-h一键耦合值、rdc以及计算的rdc值。

图10，银杏内酯b的rdc检测值与其晶体结构-基础上的dft优化结构的计算值的线性图。

实施例5

抗癌药物放线菌素d测试

图11为放线菌素d在40mg/ml多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)中(灰色)和各项同性氘代甲醇溶液中(黑色)局部clip-hsqc图。

表5，放线菌素d在各项异性的多肽液晶(多肽溶于氘代甲醇)和各项同性氘代甲醇溶液中的c-h一键耦合值、rdc以及计算的rdc值。

图12为放线菌素d的rdc检测值与其晶体与dna复合结构的计算值的线性图6，结论

从以上5个实施例演示的结果，证实该多肽液晶可实现在甲醇体系中rdc采集，且它能与丙酮一定比例相兼容，具有广谱性。采集了蒿甲醚、赤霉素、巨大戟醇、银杏内酯b、放线菌素d等分子的rdc值，经计算其结果与它们的单晶结构吻合。它的优点是临界浓度低，可简单通过浓度调节定向强度以适合于不同尺寸大小，不同耦合体系的分子；制备简单；流动性好，线性窄，测定精度高；可通过柱层析回收待测样品；可实现商品化。组装体微弱的背景峰可在二维实验中区分，或待测样品浓度较高，不受干扰。反映了该液晶体系具有广泛的应用性，它弥补了长期以来聚谷氨酸苄酯pblg只能使用在氯仿体系，且临界浓度高达16w/w％，定向强度太强，不能调节，无法使用含有强耦合体系的分子等缺点。可能为rdc成为日常检测奠定基础，具有广泛的应用前景。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。