一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法及应用与流程

本发明涉及一种羊膜制备方法及应用。
背景技术：
：围产期废弃的羊膜组织是重要的再生医学种子细胞来源之一，其来源广泛、易于获取且无伦理道德争议，是近年的研究热点。羊膜作为一种免疫豁免生物移植物，具有抗炎、抗粘连，减轻疼痛，促进上皮化等生物学特性，早在1910年开始就被应用于烧伤患者及其他外科手术，用于促进表皮化、减轻疼痛和预防感染。近年来，随着对羊膜的进一步认知及羊膜保存制备技术的发展，羊膜再次成为研究及应用的热点，被广泛应用于角膜重建、整形、烧伤救治等领域。通过美国NIH临床数据库检索到利用人羊膜进行创伤修复的临床试验有30余例，其中包含了糖尿病足溃疡、静脉溃疡、皮肤缺损、皮肤烧伤、角膜灼伤等多种难治愈创伤。由此可以看出人羊膜与羊膜细胞外基质作为创伤修复组织工程材料有良好的应用前景。人羊膜为同种异体天然可降解材料，具有良好的细胞及组织相容性，无血管基质中含有I、Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白及硫酸肝素蛋白多糖等成分有利于创周细胞的黏附、移行及上皮化，防止细胞凋亡，且无免疫原性。其内富含多种内源性生物活性因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成因子、转化生长因子β(TGF-β)、组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)、组织金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)、肝细胞生长因子(HGF)等，可以促进上皮形成、增生，使伤口快速愈合；通过清除炎症细胞降低炎症反应；抑制纤维组织过度增生，减少疤痕。既可以用作为伤口创面的覆盖物，也可以植入创口，做成引导皮肤再生的组织工程皮肤。目前羊膜作为皮肤组织修复材料，常用的技术为新鲜羊膜或深低温冷冻羊膜，但仍存在异体细胞引入免疫原性以及保存不便无法随用随取等特点。因此以脱细胞羊膜这种天然的细胞外基质皮肤修复材料作为组织工程产品已经成为重要的产品化策略之一。但目前已有的羊膜脱细胞方法仍然无法保证细胞完全脱除的基础上保证羊膜基质的完整性，尤其会对基底膜造成严重的破坏，影响种子细胞或体内内源细胞的粘附和迁移。专利公开号CN1757717A(干燥活性羊膜的制备方法)采用胰酶长时间处理结合细胞刮子或棉棒脱去上皮细胞，但长时间的胰酶消化会导致羊膜胶原结构的改变甚至降解，而物理刮除方法会严重破坏羊膜上皮细胞粘附的基底膜组分损伤。专利公开号CN102327640A(一种脱细胞羊膜的制备方法)采用SDS进行细胞裂解，促进羊膜上皮细胞的脱离，但SDS低浓度会限制羊膜细胞的去除效率，但高浓度SDS会造成羊膜基质的破坏。技术实现要素：本发明通过一种采用胰酶、去污剂、物理震荡、核酸降解等工艺相互结合的羊膜脱细胞方法，获得可用于糖尿病足溃疡、静脉溃疡、皮肤大面积缺损、皮肤烧伤等难愈合性皮肤损伤的修复，该方法与其他脱细胞羊膜制备方法不同的是能够在保证羊膜基质结构完整的前提下，达到细胞完全脱离的目的，且经过生物安全性和有效性评价，该方法获得的脱细胞羊膜无毒性、可在体内降解，且能够达到促进难愈合皮肤创面再生和修复的目的。本发明的一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法，它是按照以下步骤进行的：一、选择足月胎盘，钝性剥离羊膜组织，生理盐水清洗2～3遍，随后置于含抗生素生理盐水中浸泡10min进行消毒处理；二、将羊膜上皮面朝上平铺于无菌硝酸纤维膜上，在无菌条件下晾置1～2小时，制成羊膜贴片；三、将羊膜贴片置于质量体积百分浓度为0.25％～0.5％胰蛋白酶和0.2～0.5g/LEDTA·4Na混合消化液中，37℃摇床震荡消化10～30min，摇床转速为70～90rpm/min；四、采用TE缓冲液清洗步骤三消化后的羊膜贴片2～3次；五、将步骤四清洗后的羊膜贴片浸泡于TE-TritonX-100溶液中，在温度为25℃、转速为70～90rpm/min的条件下，震荡洗涤10～16h；六、再将步骤五的羊膜贴片在TE溶液中清洗5～8次；七、将步骤六清洗后的羊膜贴片置于核酸降解溶液中，在温度为37℃的条件下温浴2～4小时；八、将步骤七温浴处理后的羊膜贴片置于生理盐水中清洗3～5次；九、将步骤八清洗后的羊膜贴片经过冷冻干燥、封装和辐射照灭菌后保存。本发明包含以下有益效果：本发明提出的胰酶、去污剂、物理震荡结合的羊膜脱细胞方法，可以高效的去除羊膜细胞，并且保证羊膜基质的完整性，动物实验证明这种方法获得的脱细胞羊膜可以有效的促进难愈合皮肤创面的再生修复。安全性评价结果显示，这种脱细胞羊膜可满足于临床难愈合皮肤损伤的治疗。(1)羊膜组织上皮面朝上贴覆于硝酸纤维膜，可在无菌条件下晾置1-2小时，可使羊膜组织与硝酸纤维膜充分贴合，避免脱细胞过程中羊膜组织与硝酸纤维膜分离，制备成的羊膜贴片保持展开状，羊膜组织可以充分与脱细胞试剂接触，提高脱细胞效率。(2)羊膜组织采用0.25％～0.5％胰酶消化10-30min，短时间胰酶消化不会造成羊膜基质的降解，同时能够使大多数羊膜细胞从基质中脱离，或处于不稳定粘附状态。可以在后续清洗中完全脱除羊膜细胞。(3)在胰酶消化后，羊膜组织采用TE-TritonX-100溶液清洗，可以高效去除残余细胞和其他杂质成分，同时保证了羊膜基质的完整结构。(4)羊膜组织在脱除细胞后，在核酸降解溶液中37℃反应2-4小时，可以有效降解核酸成分，进一步去除脱细胞羊膜的免疫原性。(5)本发明采用的羊膜脱细胞技术，可以完全脱除羊膜细胞，获得具有完整基底膜和排列整齐胶原结构的羊膜基质材料。该材料经冷冻干燥、辐照灭菌后可长期保存，随取随用。羊膜组织厚度未随脱细胞过程而发生改变，无细胞毒性，可在体内良好降解，对难愈合创面有良好的修复作用。附图说明图1为新鲜羊膜组脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图2为SDS组羊膜制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图3为采用质量体积百分浓度为0.25％胰酶组制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图4为胰酶去污剂组制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图5为采用质量体积百分浓度为0.25％胰酶消化30min，制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图6为采用质量体积百分浓度为0.25％胰酶消化60min，制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图7为采用质量体积百分浓度为0.25％胰酶消化120min，制备的脱细胞羊膜HE染色(×200)图；图8为核酸降解的脱细胞羊膜HE染色(×400)图；图9为未核酸降解的脱细胞羊膜HE染色(×400)图；图10为脱细胞羊膜治疗大鼠难愈合皮肤创面图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、选择足月胎盘，钝性剥离羊膜组织，生理盐水清洗2～3遍，去除血块、胶质等杂质成分，随后置于含抗生素生理盐水中浸泡10min进行消毒处理；二、将羊膜上皮面朝上平铺于无菌硝酸纤维膜上，在无菌条件下晾置1～2小时，使羊膜与硝酸纤维膜紧密贴合，制成羊膜贴片，并裁剪至适当大小；三、将羊膜贴片置于质量体积百分浓度为0.25％～0.5％胰蛋白酶和0.2～0.5g/LEDTA·4Na混合消化液中，37℃摇床震荡消化10～30min，摇床转速为70～90rpm/min，使羊膜细胞自羊膜基质中有效分离；四、采用TE缓冲液清洗步骤三消化后的羊膜贴片2～3次，去除自羊膜贴片上消化分离的粘稠胶质及细胞团；五、将步骤四清洗后的羊膜贴片浸泡于TE-TritonX-100溶液中，在温度为25℃、转速为70～90rpm/min的条件下，震荡洗涤10～16h，充分去除羊膜贴片中的残余细胞与杂质；六、再将步骤五的羊膜贴片在TE溶液中清洗5～8次，充分去除留存于组织间的去污剂成分；七、将步骤六清洗后的羊膜贴片置于核酸降解溶液中，在温度为37℃的条件下温浴2～4小时，降解残留的核算组分，进一步降低羊膜基质的免疫原性；八、将步骤七温浴处理后的羊膜贴片置于生理盐水中清洗3～5次，使羊膜组织完全洁净，无其他残留物；九、将步骤八清洗后的羊膜贴片经过冷冻干燥、封装和辐射照灭菌后保存。采用钴60进行辐射照灭菌。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的含抗生素生理盐水中的抗生素含量为：浓度为50mg/L的青霉素、浓度为50mg/L的链霉素和浓度为2.5mg/L的两性霉素B。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二的晾置时间为1～1.5小时。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二的晾置时间为1.5～2小时。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二的晾置时间为1.2～1.6小时。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二的晾置时间为1.4～1.8小时。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三的消化时间为10～20min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三的消化时间为15～20min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三的消化时间为20～30min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三的消化时间为18～25min。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式十一：本实施方式一种用于皮肤难愈合创面修复的脱细胞羊膜的应用，它用于制备皮肤创面修复的组织工程材料。具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十一不同的是：所述的组织工程材料使用时，在无菌水或生理盐水中进行复水，复水后脱细胞羊膜用镊子从硝酸纤维膜上分离，填充覆盖至皮肤损伤部分，修复皮肤创面。其它与具体实施方式十一相同。本
发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。通过以下实施例验证本发明的有益效果：以下实施例的试剂配方如下：胰酶混合消化液：质量体积百分浓度为0.25％～0.5％胰蛋白酶；质量体积百分浓度为0.2～0.5g/LEDTA·4Na。TE缓冲液：浓度为10mM的TRIS-HCl，pH＝7.6；浓度为1mM的EDTA。TE-TritonX-100：TE缓冲液(pH＝7.6)；体积百分浓度为0.5％～1％TritonX-100(v/v)。核酸降解液：浓度为30U/mL的DNase；浓度为10U/mL的Rnase；浓度为50mM/L的Tris-HCl；浓度为10mM/L的MgCl2；浓度为30mg/mL的BSA；pH＝7.6。实施例1本实施例通过分析比较：新鲜羊膜、SDS处理羊膜、0.25％胰酶消化羊膜以及本发明的胰酶去污剂方式处理羊膜，对处理后的羊膜分别进行比较分析，羊膜脱细胞状态，具体如下：1)羊膜贴片的制备羊膜与硝酸纤维膜贴合后进行以下分组：未干燥组、干燥15分钟组、干燥1小时组、干燥2小时组，干燥3小时组。随后将羊膜贴片进行以上脱细胞处理，处理过程中发现，未干燥组由于羊膜与硝酸纤维膜连接松散，在胰酶消化过程中完全相互脱离，无法进行后续脱细胞工艺。干燥15分钟组羊膜与硝酸纤维膜连接相对松散，胰酶消化过程中有部分相互脱离，经去污剂处理后完全分离。干燥1小时和2小时组羊膜贴片仍保持未完全干燥状态，操作方便，在脱细胞过程中羊膜与硝酸纤维膜均紧密相连，达到理想的脱细胞效果。干燥3小时组由于干燥时间过长，羊膜贴片质地变脆，裁剪过程中易造成撕裂损伤，给脱细胞工艺带来不便。2)新鲜羊膜：将羊膜组织自胎盘上剥离后，生理盐水清洗2-3次，去除血凝块、胶质等杂质，用质量体积百分浓度为4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，HE染色。结果如图1所示，结果表明羊膜上皮细胞整齐排列于基底膜，间充质干细胞分布于成纤维细胞层的胶原结构中。细胞核为蓝色、细胞外基质为粉红色可明显区分，基底膜完整，胶原结构整齐、致密。3)SDS组羊膜：将羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于TE-0.03％SDS(w/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时，TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将羊膜组织自硝酸纤维膜上分离，用质量百分含量为4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，HE染色。结果如图2所示，结果表明，羊膜基底膜和成纤维细胞层均有细胞残留4)0.25％胰酶组羊膜：将羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于0.25％胰蛋白酶和浓度为0.2g/L的EDTA·4Na混合消化液中，37℃震荡消化2小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将羊膜组织自硝酸纤维膜上分离，用质量百分含量为4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，HE染色。结果如图3所示，结果表明，羊膜组织中无残留细胞，但羊膜基底膜和成纤维细胞层均有明显损伤，胶原结构中有空洞产生。5)胰酶去污剂组(即本发明的方法)：将羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将羊膜组织自硝酸纤维膜上分离，用质量体积百分浓度为4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，HE染色。结果如图4所示，结果表明，羊膜组织中无残留细胞，基底膜和成纤维细胞层结构完整，胶原组分排列紧密、有序。实施例2本实施例对羊膜消化时间进行优化分析，具体如下：羊膜贴片置于质量体积百分浓度为0.25％胰蛋白酶和浓度为0.2g/LEDTA·4Na混合消化液中，37℃震荡分别消化30分钟、1小时、2小时，TE缓冲液清洗后置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将羊膜组织自硝酸纤维膜上分离，4％多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，HE染色。结果如图5-7所示，表明胰酶消化作用时间在30分钟以上均能完全脱除细胞，其中30分钟的消化时间能够保证脱细胞羊膜具有最理想的完整结构，随着时间延长羊膜基底膜损伤，胶原组分逐渐丢失。实施例3本实施例对羊膜贴片进行核酸降解与未进行核酸降解比较分析，具体如下：羊膜贴片置于0.25％胰蛋白酶和0.2g/LEDTA·4Na混合消化液中，37℃震荡分别消化30分钟，TE缓冲液清洗后置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。羊膜贴片清洗后选择直接取材或核酸降解溶液中37℃反应3小时后进行取材，将脱细胞羊膜自硝酸纤维膜上分离后，进行常规固定、包埋及HE染色。结果如图8-9所示，结果表明脱细胞羊膜未经过核酸降解的脱细胞羊膜表面有明显的残余核酸组分；脱细胞羊膜进行核酸降解后能够完全去除核酸组分，进一步去除羊膜体内移植的免疫原性。实施例4厚度检测，具体操作如下：6)新鲜羊膜：将羊膜组织自胎盘上剥离后，生理盐水清洗2-3次，去除血凝块、胶质等杂质，用滤纸吸干羊膜表面水分，用厚度仪(精度0.01mm)夹住羊膜，测定5-7个不同位置的羊膜厚度，新鲜羊膜厚度为17.8。7)胰酶去污剂组：将羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将羊膜组织自硝酸纤维膜上分离，用滤纸吸干羊膜表面水分，用厚度仪(精度0.01mm)夹住羊膜，测定5-7个不同位置的羊膜厚度。结果如表1所示，结果表明，采用本实施例方法获得的脱细胞羊膜与新鲜羊膜相比无明显差异，结构未发生明显改变。表1脱细胞羊膜厚度测定新鲜羊膜脱细胞羊膜厚度(μm)17.8±4.918.25±3.1实施例5细胞毒性检测，具体操作如下：8)羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将脱细胞羊膜贴片经冷冻干燥、包装和钴60辐照灭菌。将羊膜贴片在生理盐水中复水后自硝酸纤维膜上分离，取40cm2左右羊膜组织加入5倍体积的DF12培养基中(含体积百分浓度为10％的FBS)，37℃浸提24小时。浸提液用DF12培养基(含体积百分浓度为10％的FBS)稀释，分别获得原浓度12.5％、50％、100％的羊膜组织浸提液，常规DF12培养基(含体积百分浓度为10％的FBS)作为对照组。人成纤维细胞分别在羊膜浸提液和DF12培养基中培养，分别在24小时、48小时、72小时消化获得细胞，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数。细胞相对生长率(RGR)＝实验组细胞数量/对照组细胞数量×100％结果表明，本实施例制备的脱细胞羊膜为低毒性或无毒性，符合国家第三类医疗器械生物学评价标准(GB/T16886.5-2003)。表2脱细胞羊膜体外毒性评定实施例6脱细胞羊膜修复大鼠难愈合皮肤创面，具体过程如下：9)羊膜在生理盐水中清洗后，上皮面朝上平铺于硝酸纤维膜上，制成羊膜贴片。羊膜贴片置于TE-0.5％tritonX-100(v/v)混合液中25℃震荡漂洗16小时。TE缓冲液清洗后，置于核酸降解溶液中37℃反应3小时。生理盐水清洗后，将脱细胞羊膜贴片经冷冻干燥、包装和钴60辐照灭菌。将羊膜贴片剪成直径为2cm2左右圆形备用。10)Wistar大鼠背部脱毛后，在脊柱两侧位置各剪掉直径1.5cm2左右圆形全层皮肤，皮肤创面外侧与医用硅胶圈缝合，制造难愈合皮肤创面。11)对照组：碘伏消毒处理，医用纱布包扎，每三天消毒换一次药。12)实验组：碘伏消毒处理，羊膜贴片无菌生理盐水中复水后将脱细胞羊膜与硝酸纤维膜分离，脱细胞羊膜平铺于伤口表面，使羊膜与创面完全接触，医用纱布包扎，每三天消毒换药一次。结果如图10所示，对难愈合创面有良好的修复作用。当前第1页1 2 3