一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY、HN-QYY-gE-及其构建方法和应用与流程

本发明属于猪伪狂犬病病毒技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy、hn-qyy-ge^-及其构建方法和应用。

背景技术：

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，prv）引起的猪的急性、高度接触性传染病。该病呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。prv可感染多种动物，比如犬、猫、狐和水貂等，猪、牛、羊等家畜感染此病，可造成巨大的经济损失。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，并且病毒可以潜伏感染在猪体内，严重威胁我国和世界养殖业的发展。但是，从2011年开始，prv在我国的几个养殖场暴发，而且发病程度极其严重，并迅速扩大到了河南、河北等北方省市。被感染的动物临床症状复杂，包括高烧、厌食、咳嗽、发抖、腹泻和全身性神经症状。感染的猪憔悴，外表薄弱，最终死亡。令人感到意外的是，育肥猪也在这个疫情期间发生死亡，死亡率大约为10%到30%。通过对9个省20个猪场采的540分血清进行了伪狂犬野毒的抗体水平检测，阳性率达52%，而河南省的某些猪场prv阳性率甚至达到了94%，通过临床试验证明，传统的prv疫苗不能够对现行的毒株产生有效的保护。因此，猪伪狂犬病的暴发证明传统的prv疫苗并不适合当下流行的伪狂犬病，需要进一步研究其致病机理和开发更为有效的疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy、hn-qyy-ge^-及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2017年12月22日，保藏编号：cgmccno.15192。

一种猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年01月02日，保藏编号：cgmccno.15200。

所述猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-的构建方法，步骤如下：

（1）、将保藏编号为cgmccno.15192的变异株hn-qyy接种至长满单层的vero细胞，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，反复冻融，离心，取上清，酚氯仿方法提取变异株hn-qyy病毒基因组dna，保存备用；

（2）、以变异株hn-qyy病毒基因组dna为模板，利用引物gel-f/gel-r和ger-f/ger-r分别pcr扩增ge基因上下游同源臂gel和ger，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化pcr产物，测定dna含量，保存备用；

其中，引物序列分别为：

gel-f：如seqidno.1所示；gel-r：如seqidno.2所示；

ger-f：如seqidno.3所示；ger-r：如seqidno.4所示；

（3）、ecori和spei双酶切gel，spei和hindiii双酶切ger，ecori和hindiii双酶切pmd18-t载体，回收酶切后的gel、ger、pmd18-t；

（4）、将回收后的gel和ger连接到回收后的pmd18-t上，之后进行质粒转化，菌液pcr筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pge；

（5）、spei单酶切质粒pge，纯化后去磷酸化，再次纯化；

（6）、nhei和spei双酶切pegfp-n1载体，回收酶切后的pegfp-n1；将回收后的pegfp-n1连接到去磷酸化后的pge上，之后进行质粒转化，菌液pcr筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pge-egfp；

（7）、构建重组荧光病毒hn-qyy-ge^-/egfp⁺

将步骤（1）所得变异株hn-qyy病毒基因组dna、pge-egfp共转染至293t细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均出现绿色荧光，获得重组荧光病毒hn-qyy-ge^-/egfp⁺；

（8）、去除绿色荧光基因

将hn-qyy-ge^-/egfp⁺和pcglobin2-cre质粒共转染至293t细胞，空斑纯化，直至所有细胞病变均不带荧光，获得猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-。

一种所述猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-在制备猪伪狂犬病灭活疫苗中的应用。

本发明的有益效果：

（1）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy为当前的流行毒株，能够有效预防猪伪狂犬病的发生；

（2）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-具有良好的免疫原性，能够刺激机体产生较高的中和抗体；

（3）、本发明猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-缺失了ge基因，能够在后期的抗体检测中有效地区分野毒和疫苗毒，为猪伪狂犬病的预防和净化提供了有效的方法。

附图说明

图1：猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy的ge基因pcr鉴定，m：2000dnamarker；1：hn-qyyge基因的pcr扩增；2：vero细胞对照；

图2：pge和pge-egfp质粒的pcr鉴定，m：15000bpdnamarker；1：pge的pcr扩增；2：pge-egfp的pcr扩增；

图3：猪伪狂犬病病毒ge缺失株hn-qyy-ge^-的pcr鉴定，m：250bpdnamarker，1：ge-f/ge-r对hn-qyy-ge^-ge基因的pcr扩增，2：gel-f/ger-r对hn-qyy-ge^-的pcr扩增；3：gel-f/ger-r对hn-qyy-ge^-/egfp⁺的pcr扩增。

具体实施方式

实施例1--猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy的分离鉴定

申请人在2012年从河南省洛阳市某猪场采集发病猪的脑组织，剪碎，按质量/体积比g/ml1∶5加入灭菌pbs溶解，用组织匀浆机打碎，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min；取上清，用0.22μm一次性滤器过滤除菌，将所得的组织液按体积比1∶5接种到长满单层的vero细胞上，待病变达到80%时收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，将病毒液8000rpm离心10min，取上清，重新接种长满单层的vero细胞，盲传5代（从出现病变的代次起），当病变稳定后，收获病毒，空斑纯化，即得猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy并-70℃保存。

用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy病毒基因组dna，具体步骤为：

（1）、将空斑纯化后的病毒液-70℃、室温反复冻融3次；

（2）、取病毒液上清350μl加到1.5ml离心管，在管中加350μlripa裂解液和10μl蛋白酶k于56℃水浴2h；

（3）、加入700μl的tris饱和酚，混匀3min，然后4℃离心机中12000rpm离心10min；

（4）、吸取上层液体加入新的离心管，再加入700μl的tris饱和酚、氯仿和异戊醇的混合液（tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，体积比），混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（5）、吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1，体积比），混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（6）、吸取上清液加入新的离心管，加入等体积的氯仿，混匀3min，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（7）、吸取上清液400μl加入新的离心管，然后加入2.5体积倍的经过-20℃冷冻的无水乙醇，-20℃沉淀2h；

（8）、将样品取出，4℃离心机中12000rpm离心20min，弃上清，留白色沉淀，加1000μl经过-20℃冷冻的75v%乙醇，上下颠倒混匀，4℃离心机中12000rpm离心10min；

（9）、将酒精弃去，静止3min，待酒精挥发完毕，加入30μl的te溶液，4℃溶解30min，即可得到dna，-20℃保存备用。

猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy的鉴定采用ge基因pcr方法，引物如表1所示。ge基因pcr反应体系为：2xgcbuffer25μl，dntp(10mmol/μl)1μl，taqdna聚合酶（5u/μl）0.5μl，上下游引物（5od）各1μl，dna模板（100μg/ml）4μl，灭菌双蒸水补足至50μl；反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃10min；pcr产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1，表明所分离的毒株为猪伪狂犬病病毒变异株。

实施例2--猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-的构建方法

构建步骤如下：

（1）、t25细胞瓶中vero细胞长满单层后，弃去营养液，用无菌pbs洗涤2次，接种30μl实施例1所得变异株hn-qyy，37℃co2培养箱中孵育1h，弃去病毒液，加入6ml的维持液（含2%胎牛血清的dmem），继续37℃co2培养箱中培养，当细胞出现80%以上病变的时候，收获病毒液，-70℃、室温反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，酚氯仿方法提取变异株hn-qyy病毒基因组dna，-20℃保存备用；

（2）、以变异株hn-qyy病毒基因组dna为模板，利用引物gel-f/gel-r和ger-f/ger-r分别pcr扩增ge基因上下游同源臂gel和ger，琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化pcr产物，测定dna含量，-20℃保存备用；

其中，引物序列如表2所示：

pcr扩增反应体系为：2xgcbuffer25μl，dntp（10mmol/μl）1μl，taqdna聚合酶（5u/μl）0.5μl，上下游引物（5od）各1μl，dna模板（100μg/ml）4μl，补水至50μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环；最后72℃延伸10min；

（3）、ecori和spei双酶切gel，spei和hindiii双酶切ger，ecori和hindiii双酶切pmd18-t载体，回收酶切后的gel、ger、pmd18-t，-20℃保存备用；；

其中，酶切体系分别为：ecori（15u/μl）1.5μl，spei（15u/μl）1.5μl，片段gel3μg，10×buffer5μl，补水至50μl；spei（15u/μl）1.5μl，hindiii（15u/μl）1.5μl，片段ger3μg，10×buffer5μl，补水至50μl；ecori（15u/μl）1μl，hindiii（15u/μl）1μl，pmd18-t载体2μg，10×buffer5μl，补水至50μl；酶切条件均为：37℃水浴锅中孵育4h；

（4）、将回收后的gel和ger连接到回收后的pmd18-t上，之后进行质粒转化，菌液pcr筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pge，-20℃保存备用；

其中，连接体系为：t4dna连接酶（350u/μl）1μl，10×t4ligasebuffer1μl，基因片段与载体片段（以摩尔比计，gel∶ger∶pmd18-t=5∶5∶1），补水至10μl；连接条件为：16℃连接16h；

质粒转化的具体步骤为：取出大肠杆菌感受态细胞dh5α100μl，置于冰水混合物中，将10μl连接产物全部加入感受态细胞中，轻轻震荡混匀，静置30min；之后将感受态细胞置于42℃，热激90s，再置于冰水混合物中静置5min，加入1ml不含抗性的lb培养基，37℃、200rpm摇床培养1h，然后离心，留200μl上清液，混合均匀，取100μl上清的菌液均匀涂在含有氨苄青霉素（amp+）抗性的固体lb平板（氨苄青霉素含量100μg/ml，下同）上，37℃恒温培养16h，挑取菌落至1ml含有amp+抗性的lb培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h，制备成菌液，进行菌液pcr；

菌液pcr扩增体系：2xgcbuffer25μl，dntp（10mmol/μl）1μl，taqdna聚合酶（5u/μl）0.5μl，引物gel-f和ger-r（5od）各1μl，菌液4μl，补水至50μl；pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸150s，30个循环；最后72℃延伸10min；之后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2），挑取电泳条带位置在2600bp的菌液为阳性菌液；

扩大培养步骤为：将阳性菌液按体积比1∶100接至15mllb培养基中，37℃摇床200r/min摇菌14h；

（5）、spei单酶切质粒pge，纯化后去磷酸化，再用pcr产物试剂盒进行纯化，-20℃保存备用；

其中，酶切体系为：spei（15u/μl）2μl，质粒pge4μg，10×buffer5μl，补水至50μl；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

去磷酸化体系为：去磷酸化酶（1u/μl）2μl，酶切后的质粒pge2μg，10×buffer5μl，补水至50μl；去磷酸化条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

（6）、nhei和spei双酶切pegfp-n1载体（购自湖南丰晖生物科技有限公司），回收酶切后的egfp-n1片段；将回收后的egfp-n1片段连接到去磷酸化后的pge上，之后进行质粒转化，菌液pcr筛选阳性克隆，将与阳性克隆相对的菌液进行扩大培养，提取质粒，该质粒命名为pge-egfp；

其中，酶切体系为：nhei（15u/μl）1μl，spei（15u/μl）1μl，pegfp-n12μg，10×buffer5μl，补水至50μl；酶切条件为：37℃水浴锅中孵育3h；

连接体系为：t4dna连接酶（350u/μl）1μl，10×t4ligasebuffer1μl，基因片段与载体片段（以摩尔比计，egfp-n1∶pge=5∶1），补水至10μl；连接条件为：16℃连接16h；

质粒转化、菌液pcr和扩大培养的步骤同步骤（4），只是菌液pcr在用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定（见图2）后，挑取电泳条带位置在4500bp左右的菌液为阳性菌液；

（7）、构建重组荧光病毒hn-qyy-ge^-/egfp⁺

采用脂质体lipofectaminetm2000将hn-qyy病毒基因组、pge-egfp按照1μg∶3μg的比例进行转染：首先将六孔板中生长至80%的293t细胞弃去营养液，每孔添加1ml的无血清dmem，37℃co2培养箱中孵育1h；取两只离心管，每只加300μl无血清无双抗dmem，然后第一管加步骤（1）所得变异株hn-qyy病毒基因组dna1μg，脂质体3μl，第二管加质粒pge-egfp3μg，脂质体9μl，第一管和第二管全部震荡混匀，静置5min，之后将两管合并为一管，吹打混匀，静止30min，加入到293t细胞中，37℃co2培养箱中孵育6h，弃去培养液，换成含2%胎牛血清的dmem，37℃co2培养箱中继续培养，36h后收获，-70℃、室温反复冻融后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收毒；

空斑纯化：取病毒液，离心，取上清将上清液按10倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，每孔1000μl，吸附1h后弃去病毒液，加入2%琼脂糖与2×dmem（含2%胎牛血清）以体积比1∶1组成的混合物2ml，待出现细胞病变时，在荧光显微镜下挑取最高稀释度中带荧光的空斑，并再次按照10倍倍比稀释接种于生长至单层的vero细胞六孔板，待细胞出现绿色荧光病变时，选择稀释度最大的孔挑取带绿色荧光的空斑继续接种vero细胞，如此纯化至所有空斑均出现绿色荧光的病变，利用引物gel-f/ger-r对其进行pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤（4）菌液pcr扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为hn-qyy-ge^-/egfp⁺；

在vero细胞上扩增病毒，具体步骤为：当t25细胞瓶中vero细胞生长至单层，弃去旧的培养液，用无血清的dmem2ml将20μl的病毒液稀释，加入到细胞瓶中，37℃co2培养箱中孵育1h，换成含2%胎牛血清的dmem，37℃co2培养箱中继续培养，细胞病变80%时后收获，-70℃、室温反复冻融，取适量病毒液，酚氯仿抽提dna，测定含量，-20℃保存备用；

（8）、去除绿色荧光基因

将hn-qyy-ge^-/egfp⁺和pcglobin2-cre质粒按照1μg∶3μg的比例按照步骤（7）的方法转染至80%的293t细胞，36h后收获，-70℃、室温反复冻融3次后，接种长满单层的vero细胞，待细胞出现80%的病变时收获病毒液；按照步骤（7）的方法空斑纯化病毒，直至所有的细胞病变均不带荧光，利用引物gel-f/ger-r对其进行pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同步骤（4）菌液pcr扩增体系及条件，见图3），将此代病毒保存，命名为猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-。

用酚氯仿法抽提猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy-ge^-病毒基因组dna，利用引物ge-f和ge-r对其ge基因进行pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定（扩增体系及条件同实施例1中hn-qyy的ge基因pcr扩增体系及条件，见图3），结果表明：hn-qyy-ge^-成功缺失了ge基因。

实施例3--猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的制备

将实施例2所得hn-qyy-ge^-接种至长满单层的vero细胞，待细胞达到80%以上的病变时收毒，-70℃、室温反复冻融三次，测定tcid50。将病毒液8000rpm离心10min，取上清，加入β-丙内酯，使其终浓度为0.2v%，置4℃灭活48h，每1h摇晃一次；灭活后在37℃水浴2h，使β-丙内酯完全水解，然后将灭活后的病毒液与montanideisa201佐剂按照按体积比1∶1的比例混合乳化，制得猪伪狂犬病灭活疫苗，灭活前病毒含量应≧10^7.5tcid50/ml，制备的灭活疫苗按照《中国兽药典》附录进行检验，合格后4℃备用。

其中，病毒含量tcid50的测定按下述方法进行：

tcid50测定在96孔微量细胞培养板上进行，将hn-qyy-ge^-病毒液用不含血清的dmem作10^-1～10^-8倍比系列稀释，取10^-4～10^-85个稀释度，每个稀释度分别接种已长成良好单层的vero细胞各6个孔，每个孔加100μl的病毒液，置37℃孵育1h，直接补加100μl的维持液（含2%胎牛血清的dmem），置37℃培养，经72h观察每孔细胞的病变情况，以细胞圆缩变形、脱落的病变达到50%以上判为阳性孔，按reed-muench氏法计算病毒在vero细胞的tcid50。

实施例4—猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的安全性检验

1、材料：350g以上的豚鼠。

2、方法：取豚鼠10只，分为两组，第一组每只豚鼠注射实施例3所得猪伪狂犬病病毒灭活疫苗1ml，第二组注射无菌pbs1ml，观察豚鼠的症状，连续观察7天。

3、结果：豚鼠注射疫苗后，无任何症状，饮食正常，注射部位没有鼓包和坏死等不良反应，证明制备的灭活疫苗安全性好。

实施例5--猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的最小免疫剂量试验

1、材料：21日龄的仔猪。

2、方法：将20头prv病原与抗体阴性的21日龄的仔猪随机分成4组，每组5头；第一组、第二组和第三组每头分别注射实施例3所得猪伪狂犬病病毒灭活疫苗1、2和3ml/头，免疫后2周进行第二次免疫，免疫剂量和方法同一免，第四组为不免疫的对照组。二免后4周进行攻毒，滴鼻接种实施例1所得hn-qyy株1ml（病毒含量为10⁶tcid50），观察临床表现。

3、结果：各组仔猪在接种疫苗后无炎症和过敏反应，无异常症状；第一组仔猪攻毒后有1头精神沉郁、厌食和较轻的神经症状，保护率达到80%；第二组和第三组仔猪攻毒后仅仅有个别仔猪出现发热，但是无任何其他症状，保护率达到100%；第四组仔猪攻毒后体温升高至41℃，具有典型的神经症状，其中4头死亡，发病率100%。结果见表3，表明灭活疫苗的最小免疫剂量为1ml/头。

实施例6--猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的免疫效力试验

1、材料：21日龄的仔猪。

2、方法：将15头prv病原与抗体阴性的21日龄的仔猪随机分成3组，每组5头。第一组和第二组每头分别注射实施例3所得猪伪狂犬病病毒灭活疫苗2ml，2周后对第一组进行二次免疫，免疫剂量和方法同一免，第三组为不免疫的对照组。二免后4周进行攻毒，滴鼻接种实施例1所得hn-qyy株1ml（病毒含量为10⁶tcid50），观察临床表现和死亡情况。

3、结果：各组仔猪在接种疫苗后均无炎症和过敏反应，无其他异常。第一组仔猪攻毒后无任何异常临床症状，保护率达到100%，第二组仔猪攻毒后有3头有精神沉郁和轻微的神经症状，保护率为40%，第三组为仔猪攻毒后体温上升到42℃，并且有典型的神经症状，4头仔猪最后死亡，保护率为0%。结果见表4，表明免疫剂量为2ml，免疫两次能够产生良好的免疫效果。

实施例7--猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的中和抗体试验测定

1、材料

40日龄仔猪40头，商品灭活疫苗（猪伪狂犬灭活疫苗鄂a株，中牧实业股份有限公司，灭活前的病毒含量≥10^6.5tcid50/0.1ml），商品化活疫苗（猪伪狂犬活疫苗sa215株，四川华神兽用生物制品有限公司，每头份病毒含量≥10⁵pfu），实施例3所得猪伪狂犬病病毒灭活疫苗。

2、方法

将20头21日龄仔猪（猪伪狂犬抗体、猪圆环病毒2型抗体、猪瘟病毒抗体和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒抗体阴性）随机分成4组，每组5头。第一组免疫施例3所得猪伪狂犬病病毒灭活疫苗2ml/头，2周后进行二免；第二组免疫商品灭活疫苗，每头免疫2ml，2周后进行二免；第三组免疫商品活疫苗，每头滴鼻2ml，2周后进行二免；第四组为不做免疫的对照组。每组免疫前采血，之后每隔2周采血，测定中和抗体。

中和抗体的测定：

采用固定病毒稀释血清法：在96孔细胞培养板各孔中加入用细胞生长液稀释的vero细胞(1万/孔)，置37℃co2培养箱培养24h，待细胞长成单层。用不加血清的dmem将实施例1中的hn-qyy株病毒液稀释成含200tcid50/0.1ml，置于无菌生理盐水瓶中，4℃备用。另取96孔细胞培养板，将待检血清样品100µl，用不加血清的dmem进行2倍比稀释(比如2¹～2¹⁰)，再往各孔中加入含200tcid50/0.1ml病毒液100µl，置37℃co2培养箱作用1小时。从最高稀释倍数开始，吸取经病毒中和后的各稀释度血清液100µl，依次转移到已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，再往各孔中补加含2%胎牛血清的dmem100µl，第11列为细胞对照即在已铺好单层vero细胞培养板中只加细胞维持液（2%胎牛血清的dmem）200µl，第12列为病毒对照即在已铺好单层vero细胞培养板中只加含200tcid50/0.1ml的病毒液200µl。置37℃co2培养箱中继续培养至96h判定结果，以出现病变的稀释度前面的稀释度为中和效价。

3、结果：

仔猪的抗体水平见表5，第一组在二免后6周和8周抗体水平最高，达到了7log2；第二组在二免后6周抗体水平最高，达到5log2；第三组的抗体水平在二免后4周后维持在4log2，第四组的抗体水为0。可以看出，第一组和第二组的抗体均呈现逐渐升高的趋势，在二免后8周略降低，而本发明猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的抗体水平稍高于商品灭活疫苗和商品活疫苗。

序列表

<110>河南农业大学

<120>一种猪伪狂犬病病毒变异株hn-qyy、hn-qyy-ge-及其构建方法和应用

<160>6

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