一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术：

双氯芬酸（diclofenac，dcf）属于非甾体抗炎药。具有抗炎、镇痛及解热作用。用于风湿性关节炎、粘连性脊椎炎、非炎性关节痛、关节炎、非关节性风湿病、非关节性炎症引起的疼痛，各种神经痛、癌症疼痛、创伤后疼痛及各种炎症所致发热等。其镇痛、消炎及解热作用比吲哚美辛强2~2.5倍，比阿司匹林强26~50倍。主要作用机制是抑制前列腺素合成酶，使前列腺素生物合成受阻。特点为药效强，不良反应少，剂量小，个体差异小。

双氯芬酸已被广泛应用于农业、畜禽和饲料等领域。因此双氯芬酸在自来水中一般都有一定的残留，而人体摄入双氯芬酸过多会对人类的肝肾等器官造成代谢负担，若在自来水中，有过多双氯芬酸残留，则有害于人类健康。国家标准gb/t29691-2013将双氯芬酸(dcf)作为允许使用的饲料添加剂，同时也规定了其最高允许使用限量（0.02mg/kg）和最高允许残留量（0.1mg/kg）。但是这些标准都采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对dcf的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（elisa）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对双氯芬酸的高特异性单克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对双氯芬酸具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立双氯芬酸的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株a号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2018年5月24日，保藏编号cgmccno.17301。

双氯芬酸单克隆抗体，它由所述保藏编号cgmccno.17301的双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株a号分泌产生。

所述双氯芬酸单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中双氯芬酸残留的分析检测。

本发明提供的双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株a号的制备基本步骤为：

（1）半抗原的制备：

原药mol.wt:278.13

由于dcf化学结构式中含有活泼基团（羧基），因此本发明将原药直接作为半抗原。

（2）完全抗原dcf-bsa的制备：本发明采用碳二亚胺（edc）将dcf半抗原的羧基与载体蛋白上的氨基偶联以制备完全抗原。称取双氯芬酸1.4mg，加入500μldmf溶解，充分溶解后向其中加入edc2.5mg和nhs1.6mg，并于30℃搅拌6h，作为a液。称取6mg的bsa，加入5mlcb溶解，作为b液。将a液滴加入b液中，偶联12h，混合液用0.01mpbs溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原dcf-bsa，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；

（3）小鼠的免疫：将dcf-bsa完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（peg4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（hat培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用ht培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-elisa法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得dcf的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株a号；

（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-elisa测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株a号分泌的单克隆抗体，对dcf具有较好的特异性和检测灵敏度（ic50值为2.0ng/ml），可实现对鸡肉和鸡的肝脏、饲料中dcf残留量的检测，为食品中dcf残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株a号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2018年5月24日，保藏编号cgmccno.17301。

附图说明

图1是双氯芬酸单克隆抗体杂交瘤细胞株a号单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将双氯芬酸完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过ic-elisa筛选细胞上清，最终得到了针对双氯芬酸具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

实施例1杂交瘤细胞株a号的制备

（1）完全抗原的合成：称取双氯芬酸1.4mg，加入500μldmf溶解，充分溶解后向其中加入edc2.5mg和nhs1.6mg，并于30℃搅拌6h，作为a液。称取6mg的bsa，加入5mlcb溶解，作为b液。将a液滴加入b液中，偶联12h，然后用0.01mpbs溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原dcf-bsa，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；

（2）动物免疫：将dcf-bsa完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对balb/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-elisa）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0瘤细胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培养基在5%co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到（1-4）×10⁷，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1ml的peg4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mlrpmi-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mlrpmi-1640培养基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心（800rpm，10min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清、2%50×hat的rpmi-1640选择性培养基（hat培养基），按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5%co2培养箱中培养；

（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用hat培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液（ht培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-elisa法筛选出阳性细胞孔，第二步选用双氯芬酸为标准品，用ic-elisa法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对双氯芬酸标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得双氯芬酸单克隆抗体细胞株a号；

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶双氯芬酸杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀igg型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

添加回收试验：

5.1包被：将包被原dcf-bsa用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液从1μg/ml开始3倍比稀释，100μl/孔，37℃反应2h；

5.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

5.3封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

5.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反应30min；

5.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37℃避光反应15min；

5.6终止和测定：每孔加入50μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。

用ic-elisa测定单克隆抗体双氯芬酸的ic50为：2.0ng/ml，说明对双氯芬酸有很好的灵敏度，可用于双氯芬酸免疫分析检测。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用。

磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2-7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐温20的pbs；

tmb显色液：a液：na2hpo4^.12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比5：1混合即为tmb显色液，现用现混。