一种分泌抗盐霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗盐霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其特别适于动物源性食品中盐霉素残留量的检测。

背景技术：

盐霉素属于一种离子载体的聚醚类抗生素，它能够通过影响细胞内外离子的传递从而起到杀菌的作用，常用于防治家畜的球虫病及仔猪和育肥猪的生产促进剂。但是近年来，一些畜牧业主为了追求高效益而大量使用抗生素，甚至在休药期还滥用抗生素，非法使用违禁药物导致食品中抗生素残留超标的现象越来越多，严重影响了自然环境和人类身体健康。因此，我国政府制定了越来越严格的监控计划，一些传统的检测方法已经无法适应监管部门的日常检测要求。因此，开发出一种能够快速检测肉制品中盐霉素残留的方法，对于保证我国食品安全具有重要意义。

目前，检测盐霉素比较常用的方法有高效液相色谱柱后衍生化法、柱前衍生化法、液相色谱-质谱法，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。基层实验室大批量检测样本应用的一般是免疫方法，因此获得一株具有特异性亲和力的抗盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株是非常重要的。本发明制备出一种分泌盐霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其应用于免疫产品，测定动物源性食品中盐霉素药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一株对盐霉素具有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明提供一株盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对盐霉素具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立盐霉素总量的免疫学检测方法，包括酶联免疫试剂盒、胶体金检测试纸条、免疫亲和柱等。

本发明的技术方案：一株盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为yms-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16811。

盐霉素单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.16811的盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株yms-1所分泌产生。

所述的盐霉素单克隆抗体的应用，用于食品安全中盐霉素含量的检测。

本发明提供的细胞株yms-1的制备步骤为：

(1)人工抗原的制备与鉴定：盐霉素和水合肼等物质反应，得到盐霉素半抗原，半抗原与蛋白质偶联，制备出人工抗原，即免疫原、包被原；

(2)单克隆抗体的制备：通过免疫小鼠，得到单克隆抗体；

(3)细胞株yms-1的制备：通过细胞融合和克隆化，得到盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株yms-1。

(4)细胞株yms-1的应用：应用于酶联免疫试剂盒。

(5)细胞株yms-1的应用：应用于胶体金免疫层析试纸条。

(6)细胞株yms-1的应用：应用于化学发光免疫检测试剂盒、免疫磁珠分离富集试剂盒、磁颗粒化学发光试剂盒、时间分辨荧光免疫层析试纸条、荧光微球免疫层析试纸条、免疫亲和柱等其他免疫检测产品。

附图说明

图1：盐霉素半抗原合成路线图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1盐霉素试剂盒组分的制备

1、盐霉素半抗原的制备

取盐霉素0.75g，加乙醇50ml溶解，取水合肼0.13g，加1ml水溶解，混入到乙醇溶液中，60℃搅拌4h，停止反应，旋蒸，除去乙醇，加水50ml，乙酸乙酯50×3，萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干，二氯甲烷/正己烷(v/v，1/4)80ml重结晶，得到肼基化盐霉素0.7g，收率92％；

取肼基化盐霉素0.7g，加乙腈60ml溶解，加koh0.53g，加无水碘化钠0.22g，充分搅拌后，加4-溴丁醛0.37g，70℃加热搅拌反应10h；停止反应，旋蒸除去乙腈，加水80ml，加乙酸乙酯120ml萃取，有机相无水硫酸镁干燥，蒸干，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，3/1)洗脱分离，得到丁醛-盐霉素产物0.69g，收率90.78％。

2、抗原的制备

免疫原制备——盐霉素半抗原与牛血清白蛋白(bsa)偶联得到免疫原。

取丁醛-盐霉素半抗原产物62mg，加乙醇2ml溶解，澄清，得到a液；取牛血清白蛋白(bsa)100mg，加0.02mol/l7ml碳酸钾溶液溶解，得到b液，在搅拌下，将a液缓慢滴加到b液中，4℃搅拌24h，加6mg硼氢化钠，恢复到室温，继续搅拌3h；0.02mol/lpb缓冲液透析纯化三天，每天换液3次，得到盐霉素-bsa免疫原，-20℃保存，备用。

包被原制备——盐霉素半抗原与卵清蛋白(ova)偶联得到免疫原。

取丁醛-盐霉素半抗原产物18mg，加乙醇1ml溶解，澄清，得到a液；取卵清白蛋白(ova)100mg，加0.02mol/l7ml碳酸钾溶液溶解，得到b液，在搅拌下，将a液缓慢滴加到b液中，4℃搅拌24h，加4.6mg硼氢化钠，恢复到室温，继续搅拌3h；0.02mol/lpb缓冲液透析纯化三天，每天换液3次，得到盐霉素-ova包被原，-20℃保存，备用。

3、盐霉素单克隆抗体的制备

动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8∶1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌盐霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

生物材料样品保藏：一株盐霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株yms-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.16811。保藏日期为2018年11月20日。

细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

4、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

5、酶标记抗抗体的制备

将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(hrp)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4∶1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；

(2)降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。

6、酶标板的制备

用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2检测盐霉素的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测盐霉素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被盐霉素偶联抗原的酶标板；

(2)盐霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/l、1μg/l、3μg/l、9μg/l、27μg/l、81μg/l；

(3)盐霉素单克隆抗体工作液；

(4)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(5)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/l硫酸；

(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)复溶液为ph值为7.0、0.02mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3动物源性食品中盐霉素的检测

1、样品前处理

称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml肌肉样本提取液，用振荡器振荡至均匀，3000g室温离心5分钟；取1ml上清液加入加入330μl样本稀释液混匀；取50μl用于分析。

2、用试剂盒检测

加入标准品/样本50μl到对应的微孔中。加入抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干。加入酶标二抗浓缩液50μl/孔，25℃避光环境中反应30min。洗板。加入底物液a液50μl/孔，再加入底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，置25℃避光环境中反应15min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔od值。

3、检测结果分析

标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以盐霉素标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中盐霉素的实际浓度。

实施例4盐霉素技术参数的确定试验

1、试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为1～81μg/l，ic50(50％抑制浓度)浮动范围为3.5～7.1μg/l；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果显示，该方法对动物源性食品的检测限为5μg/kg。

2、样本精密度和准确度试验

以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(rsd％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差rsd％＝sd/x×100％，其中sd为标准偏差，x为测定数据的平均值。

按10μg/kg、20μg/kg两个浓度的盐霉素分别对鸡肉、猪肉样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。

表1精密度及准确度试验

按10μg/kg、20μg/kg两个浓度的盐霉素分别对鸡肉、猪肉样品进行添加回收测定，平均回收率在81.7％～91.2％之间；批内、批间相对标准偏差均小于10％。

3、试剂盒稳定性试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、盐霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以上。

实施例5胶体金免疫层析试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备喷涂有盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有盐霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和pvc底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg的标准向胶体金溶液中加入盐霉素单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温-800.05％～0.2％(质量分数)、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。

2、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、ph为7.2、0.5mol/l的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用isoflow点膜仪将制备好的盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

3、反应膜的制备

将盐霉素半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将盐霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

4、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、ph7.2、0.1mol/l磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。

5、试纸条的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在pvc底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。

实施例6样品中盐霉素残留的检测

1、用试纸条进行检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5～10min，判定结果。

2、分析检测结果

阴性(-)：t线和c线都显色，表示样品中盐霉素浓度低于检测限。

阳性(+)：t线无显色c线显色，表示样品中盐霉素浓度等于或高于检测限。

无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

实施例7样品检测实例

1、检测限试验

取空白鸡肉、猪肉样本，分别添加盐霉素至终浓度为15、20、25ng/ml，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测鸡肉、猪肉样本时，根据试纸条显示判断检测限，表明本试纸条对鸡肉、猪肉中盐霉素的检测限为20ng/ml。

2、假阳性率、假阴性率试验

分别取已知盐霉素含量大于检测限的鸡肉、猪肉阳性样本各20份和含量小于检测限的阴性样本各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见下表。

表2假阳性率、假阴性率试验结果

结果表明：分别用3个批次生产的试纸条检测阳性鸡肉、猪肉样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；分别检测20份阴性鸡肉、猪肉样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测盐霉素的试纸条可以对鸡肉、猪肉中盐霉素残留进行快速检测。

3、特异性试验

用盐霉素试纸条检测500ng/ml的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物。结果显示，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对500ng/ml的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物无交叉反应。