本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种病毒的生产方法。
背景技术：
为确保动物来源产品的安全性，国家相关法规要求需对产品的纯化生产工艺进行病毒清除灭活验证，通过加入模型病毒证明工艺可以清除或灭活一定对数值的病毒，即在病毒清除、灭活步骤将病毒掺入到样本中进行灭活，再用指示细胞检测具感染性病毒的变化值，或其他检测手段检测样品中病毒的残余量。(pointstoconsiderinthemanufactureandtestingofmonoclonalantibodyproductsforhumanuse,1997),(pointstoconsiderinthecharacterizationofcelllinesusedtoproducebiologicals,1993),(ichq5a(r1)
掺入到样本中的病毒需满足两个条件，一是病毒中杂质含量低，以排除在感染性测试中非病毒可能导致的干扰、毒性，二是具感染性的病毒滴度高(大于7.0log10)，以满足病毒清除灭活要求的病毒对数下降值。
模型病毒之一，逆转录病毒，为rna包膜病毒，生产常用的细胞为musdunni细胞和minklung细胞(mrlander,skchattopadhyay.amusdunnicelllinethatlackssequencescloselyrelatedtoendogenousmurineleukemiavirusesandcanbeinfectedbyectropic,amphotropic,xenotropic,andminkcellfocus-formingviruses.jvirol.1984november；52(2):695–698.)。也有报道使用cho细胞(rongma,ming-gangbi,xiao-lancui.growthcurveofmurinexenotropicleukemiavirus-relatedvirusgrowninchinesehamsterovarycells.journalofthechinesemedicalassociation.2014january；77(1):44-48.)，(一种病毒原液的制备方法(申请号：cn201810584021))。用cho细胞生产逆转录病毒，病毒导致细胞病变，导致病毒收获液中宿主细胞成分、及血清蛋白高，增加病毒浓缩纯化难度，病毒液中复杂的成分将对病毒清除验证中造成干扰。采用minklung细胞、musdunni细胞，目前尚未建立持续性感染培养体系，难以持续获得大量病毒液，满足工业化的病毒清除验证对病毒的需求量。
对生产的病毒原液进行浓缩，多采用离心法，传统病毒离心的方法为蔗糖密度梯度离心法或cscl梯度离心法(t.e.o'connor1,f.j.rauscher1,r.f.zeigel.densitygradientcentrifugationofamurineleukemiavirus.science.1964may；144(3622):1144-1147)，(tadahironasukawajumpeiuchiyamaemailauthorsatoshitaharaguchisumireotatakakoujiharashigenobumatsuzakihironobumurakamikeijiroumizukamimasahirosakaguchi.viruspurificationbycscldensitygradientusinggeneralcentrifugation.archivesofvirology.2017nov；162(11):3523-3528)得到的病毒有蔗糖或cscl残留，残留物质也易对病毒清除验证中造成干扰，因此，蔗糖密度梯度离心法获得病毒液后需再次用超高速离心以除去蔗糖，离心力达100000g，此超高离心力下，rna包膜病毒表面的蛋白易被破坏，损失病毒活力(dorasviben,dubravko
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于，针对逆转录病毒生产，建立一种连续性感染培养体系，改良培养方法，持续性的获得宿主细胞成分少、血清含量低的病毒原液。
在获得上述病毒原液的基础上，摸索出合适的离心条件，不添加蔗糖或cscl，无残留，快速获得高浓度的病毒，病毒活力损失小。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种逆转录病毒生产方法，包括步骤：
(1)采用鼠源细胞培养病毒，鼠源细胞的初始培养基中含8％-10％的胎牛血清；培养过程中调整血清浓度有个递减的过程。
(2)待细胞生长好后，逐步用含较低浓度(3％-5％)胎牛血清的培养基更换含较高浓度血清的培养基，至少更换两次，待血清浓度低至2％及以下时，每天收获病毒培养上清。
(3)收获的培养上清经低速(1000-3000rpm/min)离心后收集上清，再采用高速离心(15500-20000rpm/min)离心2-3小时，获得病毒沉淀；重悬病毒沉淀，分装获得高浓度的病毒。
一种具体的实施方式中，所述方法还包括：步骤(4)病毒培养第一代结束后，不经细胞冻存复苏，将感染了病毒的鼠源细胞与未经病毒感染的细胞混合，并传至新的培养瓶中，采用与步骤(1)～(2)相同的培养方法开始下一代的病毒生产。
一种具体的实施方式中，所述步骤1)中，所述鼠源细胞可以为musdunni细胞。
一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，培养基更换次数可以为1次、2次、3次或更多次。
一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，培养基血清浓度的递减，递减的时间分别是在病毒培养以及病毒传代后的第二天、第五天。
一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，当血清浓度低至2％及以下时，每天收获病毒培养上清，并补充低浓度血清的培养基。
一种具体的实施方式中，低速离心的转速为1000-3000rpm/min。
一种具体的实施方式中，低速离心的时间为15-25min。
一种具体的实施方式中，高速离心的转速为的15500-20000rpm/min。
一种具体的实施方式中，高速离心的时间为2-3小时。
与现有技术相比较，本发明具有以下优势：
1.收获的病毒原液(病毒培养上清)中宿主细胞成分含量低，利于后续的病毒浓缩。采用鼠源细胞培养，病毒不使细胞产生病变，收获培养上清，与病毒致细胞病变裂解的培养方式相比，病毒原液中宿主细胞成分含量低。
2.收获的病毒原液中血清成分含量低，利于后续的病毒浓缩。早期培养使用血清比例高的培养基，有利于细胞生长以及病毒成分在细胞中合成，随后逐步降低培养基中血清的浓度。更换为低浓度血清的培养基后，大量病毒释放到培养基中时收获病毒液，所获病毒液血清成分含量低，利于病毒浓缩。
3.病毒培养，更换为低血清浓度的培养基，每天收获病毒液，培养的第一代结束后，可进行持续性的感染培养，不经细胞冻存复苏，培养周期快，每代可连续收获多次血清浓度低的病毒液，满足工业化的病毒清除验证对病毒的需求量。
4.浓缩病毒液的离心步骤简单，耗时短，病毒活力损失率低。本方法摸索出了合适的离心力和离心时间，在病毒原液杂质含量低的基础上，用低速离心去掉少量脱落的细胞后，直接用高速离心进行离心，沉淀病毒，操作步骤简单，耗时短，且无常用离心辅助试剂，如蔗糖、cscl残留，满足病毒清除验证中低ph灭活的要求。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.病毒培养
(1)细胞培养于培养瓶中，培养基含10％的血清。
(2)细胞培养的第二天，培养基稀释毒种后接种于培养瓶中，于co2培养箱中孵育2-5小时后，每个细胞培养瓶中补含10％血清的培养基。
(3)病毒培养的第二天，将培养基更换为5％血清的培养基，病毒培养的第五天，将培养基更换为2％血清的培养基。
(4)每天收集培养上清，4℃保存，以备离心，每次收集后补充2％血清的培养基。
(5)病毒培养第一代结束后，将感染了病毒的细胞与未经病毒感染的细胞混合，并传至新的培养瓶中，采用同样的培养方法开始下一代的病毒生产。
2.病毒离心浓缩
(6)将病毒液于2000rpm/min离心20min，收集离心上清。
(7)将病毒液15500离心2.5h后，重悬沉淀，分装并储存于-80℃。
检测试验和检测结果：
病毒培养上清收集期间，每天观察细胞生长状态。细胞生长良好，无细胞病变、裂解。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。