李斯特菌噬菌体组合物及其应用的制作方法

本发明涉及李斯特菌噬菌体菌株及其混合物作为食品添加成分在固态及液态食品中的应用，尤其是能够特异性裂解食品中污染的多种李斯特菌的噬菌体混合物的应用。属于生物工程领域。

背景技术：

李斯特菌(listeria)是一种能够引起动物和人李斯特菌病的革兰氏阳性细菌，其中单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes,lm)是最重要的食源性人兽共患病原，感染后主要表现为胃肠炎、败血症、脑膜脑炎和流产等，死亡率高达25-30％。在自然界中，lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰场废弃物及动物源食品中(肉、奶及其制品、海产品等)，且在低温环境中仍可生长繁殖(如2～8℃)，是冷藏食品以及即食(ready-to-eat,rte)食品中威胁人类健康的重要病原菌之一。国内主要城市食品污染调查研究显示，北京8类食品中，lm平均检出率为21.5％；河南省熟肉制品中检出率为16.98％；威海市12类产品中检出率达9.09％。在国外，美国和加拿大曾爆发过6起重大的李斯特菌病，而这都与食用了污染李斯特菌的食品有关。

噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，又称细菌病毒。具有裂解性的噬菌体能够感染细菌并在细菌体内快速增殖，使之裂解。lm噬菌体可以特异性感染并裂解lm，因而具有杀菌作用。在食品尤其是即食性食品中，噬菌体能够作为加工助剂或添加成分来控制lm污染，减少化学杀菌防腐剂的使用，保障食品安全、绿色，具有良好的开发和应用价值。

噬菌体能够有效抑制单核细胞增生性李斯特菌，但由于其特异性，从而在实际应用中出现抑制效率不完全等特点，因此，通过李斯特菌噬菌体作用宿主范围的差异进行组合，能够有效提高噬菌体的裂菌效率，从而解决实际应用过程中抑制不完全等现状，有效控制食源性单核细胞增生性李斯特菌的污染。

技术实现要素：

本发明的目的在于：开发对李斯特菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种食源性李斯特菌，为目前防控食品中李斯特菌污染提供一种安全、无毒副作用的噬菌体产品来源。

本发明的目的是这样实现的：一种噬菌体组合物，其特征在于：所述的组合物包括：单核细胞增生性李斯特菌噬菌体cctccno：m2010003、单核细胞增生性李斯特噬菌体cctccno：m2018644及单核细胞增生性李斯特噬菌体cctccno：m2018645，对单核细胞增生性李斯特菌具有实质性裂解作用。

所述的一种噬菌体组合物，其特征在于所述的单核细胞增生性李斯特菌噬菌体cctccno：m2010003、单核细胞增生性李斯特噬菌体cctccno：m2018644)和单核细胞增生性李斯特噬菌体cctccno：m2018645，按体积比1:1:1混合而成。

所述的噬菌体组合物在制备作为李斯特菌抑制剂中的应用。

所述噬菌体组合物的培养物作为李斯特菌抑制剂中的应用。

所述的应用指的是将噬菌体组合物制成喷洒液或淋洗液，用于对食品、食品生产环境或生产器具的喷洒或消杀，防止食品加工过程中造成的李斯特菌污染。

所述的食品，由肉类，或蛋类，或奶制品，或粮食，或蔬菜，或它们之间的组合加工的固体或液体类食品。

将纯化的噬菌体组合物或噬菌体的培养物与赋形剂复配后作为李斯特菌的抑制剂的应用。

所述的赋形剂为制药领域普遍使用的缓冲液、金属离子、表面活性剂、明胶、海藻酸盐。

有益效果

李斯特菌噬菌体lipg2-5,vb-lmom-sh3-3及vb-lmom-nj05均能够有效抑制单核细胞增生性李斯特菌的生长，3种噬菌体作用宿主范围及效率不同。通过将噬菌体进行组合，其作用宿主范围更广，效率更高，在作用3h即可有效抑制宿主生长，其相对单一噬菌体在实际环境中作用效果更佳。

单核细胞增生性李斯特噬菌体vb-lmom-sh3-3(listeriamonocytogenesphagevb-lomm-sh3-3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏时间为2018.9.20,保藏号为cctccno：m2018644。单核细胞增生性李斯特噬菌体vb-lmom-nj05(listeriamonocytogenesphagevb-lmom-nj05)，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏时间为2018.9.20，保藏号cctccno：m2018645。

附图说明

图1噬菌体纯化检测结果a.lipg2-5,b.vb-lmom-sh3-3,c.vb-lmom-nj05

图2噬菌体基因组酶切结果m.dnamarker,1.vb-lmom-nj05,2.vb-lmom-sh3-3,3.lipg2-5

图3噬菌体组合物体外杀菌检测结果

图4噬菌体在即食食品中灭菌检测结果

图5噬菌体在加工环境中的灭菌检测结果。

具体实施方式

本发明试验用噬菌体宿主菌单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes，保藏号：gim1.228)，威尔氏李斯特菌(listeriawelshimeri，保藏号：gim1.231)及英诺克李斯特菌(listeriainnocua，保藏号：gim1.230)购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；表1中单核细胞增生性李斯特菌分离株lm008等来源于扬州疾病预防控制中心。bhi(脑心浸液购自bd公司)，λ噬菌体基因组dna快速提取试剂盒购自艾比根生物技术有限公司。

实施例1、噬菌体分离制备及纯化

噬菌体分离

本发明样品采自猪肉屠宰加工环境污水，3000×g.min^-1离心20min，再用0.22μm滤膜过滤上清。取10ml过滤上清，加入1ml噬菌体宿主菌过夜培养物，再加入无菌cacl2母液至终浓度1.25mm混匀后，加入20mlbhi培养基，室温作用30min，再放置于30℃，待培养至6～8h后，取上述培养物以13000×g.min^-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体原液。

取噬菌体原液0.1ml，进行10倍稀释，取稀释液各0.1ml与过夜培养的宿主菌液0.1ml混匀，加入约5ml0.7％lb培养基，混匀后迅速倾倒入bhi培养基平板上层，摇匀平置5min，待其凝固，置于30℃温箱培养12h后观察，获得形成噬菌斑的双层平板。

噬菌体纯化

取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4mlbhi培养基重悬，加0.1ml噬菌体30℃温育30min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mlbhi培养基，30℃静置培养6-8h；取上述培养物以13000×g.min^-1，4℃，离心30min，取上清；再用0.22μm滤膜过滤上清，形成噬菌体悬液。加rnasea、dnaseⅰ至1μg/ml，37℃温育30min；加9.3gpeg8000，5.8gnacl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000×g.min^-120min，去上清液；加2mlsm液，充分洗溶管壁及沉淀；通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬液中的peg和细胞碎片，回收噬菌体颗粒，获得纯化的噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体(如图1所示)。

实施例2、噬菌体基因组鉴定

按照λ噬菌体基因组dna快速提取试剂盒提取噬菌体基因组dna，具体按说明进行。将基因组dna定量后，用限制性内切酶hindiii进行酶切，核酸电泳分析噬菌体基因组组成。

结果如图2所示，3株噬菌体基因组均为双链dna，通过限制性内切酶hindiii消化后，噬菌体基因组产生大小不等条带。从图中可以看出，与lipg2-5相比较，vb-lmom-sh3-3及vb-lmom-nj05条带具有一定相似性但却不同，因此，3株噬菌体基因组组成不同。

上述两种噬菌体经过鉴定并保藏，其中单核细胞增生性李斯特噬菌体vb-lmom-sh3-3(listeriamonocytogenesphagevb-lomm-sh3-3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏时间为2018.9.20,保藏号为cctccno：m2018644。单核细胞增生性李斯特噬菌体vb-lmom-nj05(listeriamonocytogenesphagevb-lmom-nj05)，保藏于中国典型培养物保藏中心，中国武汉，武汉大学，保藏时间为2018.9.20，保藏号cctccno：m2018645。

实施例3、噬菌体作用宿主谱系分析

按文献(zhanghui,baohongduo,billingtoncraig,etal.isolationandlyticactivityofthelisteriabacteriophageendolysinlysz5againstlisteriamonocytogenesinsoyamilk.foodmicrobiology,2012,31:133-136.)记载的方法对三种噬菌体进行裂解谱系分析，结果见表1.

表1噬菌体裂解谱系分析结果

注：++反应强阳性，+反应阳性，-不反应

由表1可以看出，三种噬菌体均对单核细胞增生性李斯特菌具有良好的裂解活性，其中噬菌体vb-lomm-sh3-3和lipg2-5单核细胞增生性李斯特菌、英诺克李斯特菌及威尔氏李斯特菌均具有良好的裂解活性，三株菌对不同菌株间的裂解活性具有一定互补性，从而能够扩大裂解范围。

实施例4、噬菌体组合体外杀菌效果

取培养至对数生长期的宿主菌菌液，测定其od600值，分别将其调整至od600约为0.4；再分别取3种噬菌体各100μl按1:1:1混合(每种噬菌体效价约为10⁹pfu/ml)；取宿主菌液2ml与300μl混合噬菌体颠倒混匀，同时设置单一噬菌体对照，在室温下静置。从0h开始测od600值，每0.5h测定一次，测至5h。

结果如图3所示：噬菌体均能有效抑制李斯特菌，在作用1h后加入噬菌体组合物组中宿主菌较对照组减少，作用3h时已降至约0.18，而此时对照组宿主菌浓度已升至0.94以上，而此时单一噬菌体组中宿主菌数量亦有下降，但仍高于组合物组；作用至5h，加有噬菌体的混合液已显著澄清，而对照组菌液混浊，od值已达1.05，表明噬菌体组合物作用更快，裂解效率更高。

实施例5、噬菌体组合物在食品中的杀菌效果

生鱼片，将其切成约面积为1.5cm×1.5cm的小块(约1g)，将肉块过火焰灭菌；制备3×10⁵cfu/ml李斯特菌液；制备3×10⁸pfu/ml的噬菌体组合物(每种噬菌体约1×10⁹pfu混合后，sm调至1ml)。无菌室温环境下，将混合菌液以20μl(1×10⁴cfu/ml)滴于肉块表面，约15min后，滴20μl噬菌体，同时设立宿主菌对照；将制备好的样品置于8～10℃环境中，分别于24h，48h，72h后检测宿主菌数量。

如图4中所示，8～10℃环境作用24h后，与对照组相比较，宿主菌数量下降1.5log；48h后，宿主菌数量减少2.3log；至72h，与对照组起始数量比较下降3.49log，呈极显著性差异。

实施例6、噬菌体在加工器械中的杀菌作用

挑取单核增生性李斯特菌单克隆，经过夜培养后，调整期浓度为10⁴cfu/ml，喷洒在加工用刀具表面；然后将噬菌体组合物以10⁶pfu/ml、10⁷pfu/ml浓度对刀具实施喷洒消杀，分别于24h、48h及72h检测宿主菌的数量。

检测结果如图5显示，在以10⁶pfu/ml和10⁷pfu/ml浓度噬菌体实施喷洒消杀48min后，刀具表面宿主菌显著下降，作用72h已检测不到宿主菌。因此以浓度≥10⁶pfu/ml噬菌体能够有效的杀灭器具表面污染的李斯特菌。

实施例7、噬菌体安全性实验

8周龄雌性spf级balb/c小鼠，26g±2g，共20只，购自扬州大学比较医学中心。随机分为2组，各10只；其中一组口服噬菌体组合物10⁹pfu/0.1ml/只；对照组口服等体积pbs。连续口服7d，脱劲致死小鼠，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。

结果显示，此计量的噬菌体对小鼠日常行为没有影响，解剖检查无异常，且在饲喂结束两天后，在小鼠粪便中检测不到噬菌体。