一株犬细小病毒毒株及其基因序列的扩增和应用的制作方法

本发明涉及病毒技术领域，特别是指一株犬细小病毒毒株及其基因序列的扩增和应用。

背景技术：

犬细小病毒病（canineparvovirus）是犬细小病毒（cpv）引起的一种急性、高接触性传染病，其以出血性肠炎和心肌炎为主要发病形势，并伴有剧烈呕吐、便血、食欲不振、精神沉郁等临床症状。该病于1978年，在国外患肠炎犬中首次分离，并随后在世界范围内逐渐报道，国内首次于1983年徐汉坤等正式报道了该病的流行。在国内与犬瘟热、犬冠状病毒病并称为犬类三大传染病，严重危害到我国的养犬业与宠物行业，并每年造成巨大的经济损失。

cpv为无囊膜、单链dna病毒。病毒基因组由5323个碱基组成，含有两个主要的开放性阅读框（orf），分别编码两个非结构蛋白ns1和ns2与三个结构蛋白vp1、vp2和vp3。病毒衣壳由60个结构蛋白组成，其中vp2是病毒衣壳中最主要的结构蛋白，占病毒衣壳的90%，约有53~54个。在vp2基因的n端以及蛋白转角区loop1和loop3存在重要的抗原表位，因此vp2的序列发生氨基酸替代，可能引起病毒抗原性的改变。其基因组两端存在两个发卡结构（3’y型和5’u型）在病毒复制过程中起着重要的作用，并且这两个发卡结构也阻碍了病毒基因组的全序列测序及分析。

目前cpv的预防主要以免疫接种为主，但即使进行有效的疫苗接种，该病依然在世界范围内广泛流行。自1978年该病毒被首次分离以来，病毒先后进行了多次基因变异，产生了3种主要抗原变异型cpv-2a、cpv-2b和cpv-2c，其中变异型cpv-2a和cpv-2b主要在一些亚洲国家流行，变异型cpv-2c主要分布与欧洲及美洲各国。近年研究发现新的变异型newcpv-2a、newcpv-2b和newcpv-2c在亚洲、美洲和欧洲等地的开始出现。研究发现，vp2基因的定向漂移引起了各种变异型的产生，cpv-2a的vp2蛋白相较于cpv-2，发生了met⁸⁷leu、ile¹⁰¹thr、ala³⁰⁰gly、asp³⁰⁵tyr以及val⁵⁵⁵ile氨基酸突变;而cpv-2b相较于cpv-2a其vp2蛋白多了asn⁴²⁶asp氨基酸突变，但并没有发生val⁵⁵⁵ile的氨基酸突变;cpv-2c相较于cpv-2b其vp2蛋白在发生cpv-2b相同的氨基酸突变外，还在asp⁴²⁶glu和ser²⁹⁷ala发生了突变，这些突变从而导致了一些生物学性质发生改变，例如猫转铁蛋白结合受体能力、抗原反应性以及猫的致病性。通过与cpv-2a、cpv-2b相比较发现，新变异准newcpv-2a／2b的vp2在aa²⁹⁷发生了ser²⁹⁷ala的突变，该位点的氨基酸突变可作为判断newcpv-2a/2b的标志。另外，某些newcpv-2a和newcpv-2b还发生了phe²⁶⁷tyr、tyr³²⁴ile和thr⁴⁴⁰ala突变。cpv虽作为dna病毒，但是它的复制过程依然依赖于宿主细胞，并且由于其作为单链dna，可能在复制过程中复制效率及纠错能力不高，导致该病毒基因组碱基突变率高于一般dna病毒，与某些rna病毒相当，为7.1×10^-3~0.7×10^-3。该特点导致病毒对环境与宿主的适应性及逃避宿主免疫应答能力的的提高，大大提升了cpv的进化效率及在宿主动物中的传播能力。

cpv全基因组5’端和3’端存在有末端回文序列形成的末端发卡结构，在病毒的复制过程中起着起始和包装信号等重要作用。目前为止，因为两端发卡结构的克隆与测序的困难性，导致基因组数据库中仅仅存在几株完整的cpv全基因组序列，这严重阻碍了cpv全基因组及感染机制的研究工作。

本研究从经cpv胶体金试纸鉴定阳性的病犬粪便中成功分离出株cpv，通过对该病毒的全基因组测序、理化性质及血凝抑制试验等方面鉴定为cpv，并命名为cpv-hn1。对犬基因组测序分析，以期了解目前河南地区的流行趋势，为该病的治疗与预防提供参考和依据。

技术实现要素：

本发明提出一株犬细小病毒毒株及其基因序列的扩增和应用，解决了动物犬细小病毒测序难、预防难的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一株犬细小病毒毒株（canineparvovirus，cpv），所述毒株的保藏号为cctccno：v201873，保藏日期：2018年12月18号，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉市武昌珞珈山，犬细小病毒毒株基因序列的全长5052bp如seqidno：1所示。

所述犬细小病毒毒株对1%猪红细胞产生的凝集效价为1:256，犬细小病毒毒株的tcid50为10^-4.85/0.1ml。

所述的犬细小病毒毒株基因序列的扩增，所述犬细小病毒毒株基因序列的扩增分段进行，包括y型发卡结构扩增、u型发卡结构扩增和编码区序列扩增。

y型发卡结构扩增的引物为y1引物对和y2引物对；u型发卡结构扩增的引物为u1引物对和u2引物对；编码区序列扩增的引物为a1-5引物对。

所述y1引物对上游引物为ttagaaccaactgaccaagttcacg、下游引物为cgtaggcagcgcgcgc；y2引物对上游引物为gctgcgcgcgctgcctac、下游引物为taccgaacaaagagtcaccaacca。

所述u1引物对上游引物为caataactgtaagaaatagaagaac、下游引物为catagcggtctggttgattaagca；u2引物对上游引物为ctatgcggtctggttgattaagcg、下游引物为aagtatcaatctgtctttaagggggg。

所述a1-a5引物对的上游引物和下游引物见下表：

所述的犬细小病毒毒株作为制备疫苗的应用，所述疫苗为亚单位疫苗或灭活疫苗。

所述亚单位疫苗是指以犬细小病毒毒株cpv-hn1为模板表达其具有抗原性的结构蛋白，与纳米硅佐剂混合制备亚单位疫苗。

所述灭活疫苗是指对犬细小病毒毒株cpv-hn1进行灭活使其成为无毒毒株，与纳米硅佐剂混合制备灭活疫苗。

本发明的有益效果在于：通过对其生物信息学分析，发现cpv-hn1是一株全新的犬细小病毒毒株，并且为目前病毒的流行变异情况提供了方向；并通过感染细胞等试验，证明其增殖速度快、病毒滴度高，是很好的疫苗株的选择，应用范围广泛，不仅可以借此建立攻毒模型用于研究试验，还可以在生产开发上制备新型犬细小病毒疫苗，为目前疫苗开放上提供优质的材料基础和选择空间。

本发明从患病犬粪便中成功分离出一株cpv毒株，克隆并测序出末端两个发卡结构，成功拼接出完整cpv全基因组序列。通过对该分离株的pcr鉴定、血凝与血凝抑制试验、病毒分离试验及病毒理化性质试验证明该分离株是cpv，命名为cpv/hn1株。对该分离株的全基因组克隆及测序，显示该分离株为cpv-2a亚型。cpv/hn1毒株的成功分离，为河南cpv的流行、遗传进化等研究提供理论数据，同时为cpv的感染机制研究奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为鉴定引物pcr产物1%凝胶电泳图，m:2000dnamark；1、2：ns1、vp2扩增目的片段；n:阴性对照。

图2为cpv/hn-1分离株在f81细胞上的变化，a:f81细胞病变b:正常细胞对照。

图3为编码区pcr产物1%凝胶电泳图。

图4为y型u型发卡结构pcr产物1%凝胶电泳图；m:2000dnamark，1、2、3、4:y1、y2、u1、u2扩增目的片段，n:阴性对照。

图5为cpv-hn1与国内14株分离株核苷酸同源性分析。

图6为cpv-hn1与国内14株分离株进化树分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

材料与方法

1.1细胞、试剂

胎牛血清购自hyclone公司；dmem高糖细胞培养液购自hyclone公司；蛋白酶k购自promega公司；琼脂糖购自promega公司；dnamarkerdl2000、pmt-18t载体购自大连宝生物公司；dna凝胶回收试剂盒与dh5α感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司；去质粒提取试剂盒购自omega；dna提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；f81细胞本实验室保存。其它常规试剂均为分析纯。

病料收集

病料来自于郑州市某动物医院，收集经cpv胶体金试纸鉴定阳性的病犬粪便。于f81细胞上分离。

粪便处理

将病犬的粪便用pbs按照1:10的比例稀释，再加等量的氯仿混匀，加入双抗，4℃过夜。8000r/min离心10分钟，取上清液，0.22μm滤器过滤除菌，－80℃保存备用。

样品dna提取

处理好的样品取一部分按照生工dna提取试剂盒操作说明，提取样品的全dna，－40℃保存备用。

鉴定

根据genbank登陆的cpv-lz2(登陆号：jq268284)，针对病毒ns1、vp2区域，运用primer5.0软件设计两对检测引物ns1，vp2（表1）。引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

采用50μl的pcr扩增体系：taqmix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，最后用灭菌双蒸水添加至50μl。反应条件为：94℃5min；94℃30s；60℃30s；72℃40s，35个循环；72℃10min，4℃保存。取pcr产物8μl于1％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，并用dna凝胶回收试剂盒回收纯化。纯化后产物连接到pmd18-t载体上，转化至dh-5α感受态细胞，涂板于amp+琼脂平板上，37℃培养箱过夜。挑选单个菌落扩大培养，菌液pcr鉴定为阳性的菌液送往武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

表1.cpv鉴定引物

1.6分离病毒

处理好的病毒样品10倍稀释同步接种于f81细胞，另设有不接毒的细胞阴性对照，于37℃细胞培养箱培养。每日观察细胞病变并记录，待cpe达到80%时，收取病毒，并盲传5代，病毒液－70℃保存。

试验

根据cpv可以凝集猪红细胞这一特性，制备1%猪红细胞悬液，取5代病毒，按ha-hi试验的操作方法鉴定病毒的血凝性。

50

取5代病毒，按照tcid50操作方法，运用reed-muench法测定病毒的tcid50。

理化性质试验

用20%乙醚处理病毒进行脂溶剂敏感试验^[10]；用ph=3的酸处理病毒进行耐酸性试验；56℃加热30min，对病毒进行耐热性试验。同时每组试验都设立阴性对照组，分别测定阴性对照组与试验组的tcid50。

全基因组测序

根据genbank登陆的cpv-lz2(登陆号：jq268284)，运用primer5.0软件设计9对测序引物（表2）。其中y1，y2用于y型发卡结构（序列如seqidno：2所示）扩增，u1，u2用于u型发卡结构（序列如seqidno：3所示）扩增，a1-5用于编码区序列扩增，所以引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

编码区片段扩增采用50μl的pcr扩增体系：taqmix25μl，上下游引物各2μl，模板4μl，最后用灭菌双蒸水添加至50μl。反应条件为：94℃5min；94℃30s；60℃30s；72℃40s，35个循环；72℃10min，4℃保存。取pcr产物8μl于1％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，并用dna凝胶回收试剂盒回收纯化。两端发卡结构片段扩增反应条件为：25μl反应体系，模版dna2μl，上游引物1μl，dntp2μl，5xgcbuffer5μl，98℃5min，迅速置于冰上5min，加入primestarhsdnapolymerase0.5μl，72℃3min;加入下游引物1μl，补充灭菌双蒸水至25μl。扩增体系98℃45s，98℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min，4℃保存。取pcr产物8μl于1％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，并用dna凝胶回收试剂盒回收纯化。

纯化后产物连接到pmd18-t载体上，转化至dh-5α感受态细胞，涂板于amp+琼脂平板上，37℃培养箱过夜。挑选单个菌落扩大培养，菌液pcr鉴定为阳性的菌液送往武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

表2.cpv全基因组引物

1.11全基因组序列分析

将扩增片段用dnastar软件进行序列拼接，拼接好的全基因组序列（序列如seqidno:1所示）与genbank上登录的14株国内参考株（表3），运用megalign软件进行核苷酸同源性比对分析。

表3参考毒株信息

1.12亚单位疫苗制备

1.12.1原核表达载体的构建

利用rt-pcr技术，扩增并克隆出犬细小病毒结构蛋白vp2基因，连接原核表达载体pet-28a，转入大肠杆菌中进行表达，随后进行蛋白分析纯化。

犬细小病毒纳米硅佐剂亚单位疫苗的制备

取纯化后的蛋白与70nm纳米硅佐剂按照1:2的比例配置，纳米硅的终浓度为1mg/ml，充分震荡混匀，4℃静置，即完成犬细小病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备。

灭活疫苗制备

1.13.1病毒纯化

纯化病毒采用差速离心法，将增殖后的病毒液8000rpm离心30min，取上清液30000rpm超速离心3h，弃上清，适量pbs重悬沉淀，重复两次，适量pbs重悬沉淀置于8000rpm离心30min，取上清，收获纯化后的病毒液，-20℃分装保存。

病毒的灭活

取5ml病毒液加入10ul甲醛溶液，充分混匀放入37℃恒温箱进行灭活，每2h摇晃混匀。不同时间点（12h、16h、20h、24h、36h、48h）收取病毒，加入0.2%的焦亚硫酸钠作为终止剂进行终止灭活。并对不同时间点收取病毒进行灭活效果监测，确定灭活时间。

犬细小病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备

灭活好的病毒液与70nm纳米硅佐剂按照1:2的比例配置，纳米硅的终浓度为1mg/ml，充分震荡混匀，4℃静置，即完成犬细小病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备。

结果

2.1pcr鉴定结果

pcr扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测，ns1与vp2分别显示324bp和388bp的核酸电泳条带，与预期值大小相符（图1），并测序结果与参考株成功比对。

病毒分离培养

将处理好的病毒样品10倍稀释后，同步接种于f81细胞，盲传至2代48h，细胞出现脱落、拉网、聚集、变形等明显细胞病变，继续盲传到第5代，均产生典型cpe(图2a)，未接毒的空白细胞对照组呈梭型，生长良好，形态正常，细胞连接紧密，未出现任何细胞病变（图2b）。收获每代病毒，－80℃保存，将其命名为cpv-hn-1。

血凝试验结果

cpv/hn-1分离株第5代病毒，可以对1%猪红细胞产生凝集，且凝集效价为1:256。

病毒tcid50测定结果

按照reed-muench法计算cpv-hn-1分离株病毒的tcid50为10^-4.85/0.1ml。

理化性质试验结果

经乙醚、酸（ph=3.0）、加热处理后，分离株的tcid50均无明显变化，处理组与对应的未处理对照组tcid50均无显著差异，说明该分离株对酸、热和有机溶剂均具有较强抵抗力，这与文献报道相符合。

纳米二氧化硅的制备

颗粒直径70nm的纳米二氧化硅购自南京东检生物有限公司。

分离株全基因组克隆结果及序列分析

cpv-hn-1分离株编码区pcr扩增结果如图3，y型、u型发卡结构pcr扩增结果如图4。拼接得到全基因组序列总长为5052bp，与模版序列成功比对，其中u型发卡结构全长188bp，y型发卡结构全长120bp，orf1全长2007bp编码非结构蛋白ns1，orf2全长2257bp编码结构蛋白vp1、vp2。通过与genbank上登录的国内14株cpv核苷酸序列比对，核苷酸同源性在96.4％～99.7％之间，其中与广州分离株cpv-sc02/jx660690.1/2012同源性最低为96.4%，与河北分离株cpv-hb3/kr002794.1/2013同源性最高为99.7%，如图5。此外，cpv/hn1分离株同河北吉林等北方地区分离株具有较高的同源性，因此推测该分离毒株由北方地区毒株遗传进化而来。

cpv全基因组进化树分析如图6所示，cpv/hn1分离株与河北毒株cpv-hb3/kr002794.1/2013、吉林毒株cpv-jl4/kr002797.1/2016、兰州毒株cpv-lz1/jq268283.1/2017处于同一分支且同属于cpv-2a亚型，具有较近的亲缘关系，与国内上海等分离株亲缘关系较远。总体而言，该分离株同河北等北方地区亲缘关系较近，同国内南方地区分离株亲缘关系疏远，推测该分离株由北方地区分离株进化而来。

综上结果，说明cpv-hn1分离株可能由于河北分离株cpv-hb3/kr002794.1/2013的遗传进化而来。

结论

cpv全基因组5’端和3’端存在有末端回文序列形成的末端发卡结构，在病毒的复制过程中起着起始和包装信号等重要作用。目前为止，因为两端发卡结构的克隆与测序的困难性，导致基因组数据库中仅仅存在几株完整的cpv全基因组序列，这严重阻碍了cpv全基因组及感染机制的研究工作。结合文献报道，最终克隆并测序出末端两个发卡结构，成功拼接出完整cpv全基因组序列。

本发明从患病犬粪便中成功分离出一株cpv毒株，通过对该分离株的pcr鉴定、血凝与血凝抑制试验、病毒分离试验及病毒理化性质试验证明该分离株是cpv，命名为cpv/hn1株。对该分离株的全基因组克隆及测序，显示该分离株为cpv-2a亚型，通过与14株国内cpv流行毒株全基因组序列核苷酸同源性分析，显示同源性在96.4％～99.9％之间，其中与河北分离株cpv-hb3/kr002794.1/2013河北分离株同源性最高为99.7%。cpv/hn1毒株的成功分离，为河南cpv的流行、遗传进化等研究提供理论数据，同时为cpv的感染机制研究奠定基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>河南农业大学

<120>一株犬细小病毒毒株及其基因序列的扩增和应用

<160>3

<210>1

<211>5052

<212>dna

<213>犬细小病毒（canineparvovirus，cpv）

<220>

<221>gene

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