用于转基因大米精准定量检测的内标基因引物探针、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于转基因大米内标基因sps成分检测的寡核苷酸引物和荧光标记探针，包含所述引物探针的试剂盒，用于测定转基因大米内标基因sps成分的数字pcr检测方法以及样品中转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测转基因大米内标基因sps成分中的应用。

背景技术：

随着转基因产品的大量研究及其在日常生活中的广泛应用，转基因产品对人类健康以及生存环境所带来的安全性问题已经引起世人的广泛关注及争论。因此，世界各国在积极研究转基因技术的同时，也对各种转基因食品的检测分析方法进行了大量研究。但由于转基因种类多，数量大，尤其是很多转基因食品经过深加工和各种条件处理保存后，转基因成分大量降解，检测难度加大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新和发展各种转基因食品的检测技术，以加强转基因食品监督、监测和管理，减少其商品化可能带来的风险，同时保护公众健康、保护广大消费者知情权和选择权。

目前，世界各国出于经济、卫生、环保等各种目的纷纷对转基因生物及其产品加强管理和检测。包括中国在内的50个左右国家和地区相继颁布并实行了“转基因标识制度”，对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。近年来，随着各国有关gmo（geneticallymodifiedorganism）标签法的建立和不断完善，对食品中的gmo含量下限已有所规定。很多国家不但要求对转基因食品进行定性检测，还需要对食品中的gmo含量进行定量检测，以便标识,其标识的阈值一般在0.9%–5%之间。而建立转基因产品的检测技术标准尤其是精准定量检测技术是实施转基因产品标识的技术前提。因此，转基因成分的精准定量技术将随着全世界标识制度的完善和发展日趋重要。

数字pcr(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)作为更精确和更灵敏的dna定量检测新技术，实现了单分子dna的绝对定量。dpcr是在普通数字pcr基础上建立起来的dna绝对定量方法，解决了普通数字pcr所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题，并可减少其带来的基体效应。dpcr具有测量独立性与无需任何校准物的特点。

我国转基因水稻研究处于国际领先水平，dpcr技术的出现为大米转基因成分定量检测开辟了新的途径，使得食品中大米转基因成分的定量分析与溯源成为可能。利用dpcr技术提升定量检测方法的准确性与实用价值将成为转基因精准定量检测技术发展的一个重要方向。在定量pcr检测转基因水稻外源基因过程中，首先需要选取具有物种专一性且拷贝数稳定、不显示等位基因变化的保守内标基因来作为对照，这对大米转基因成分的定量分析时具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，提供精准定量检测转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物和荧光标记探针。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量测定转基因大米内标基因sps成分的数字pcr检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量测定转基因大米内标基因sps成分的数字pcr检测方法。

本发明的还一个目的在于，提供转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物和探针在精准定量检测食品中转基因大米内标基因sps成分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据转基因大米sps外源插入位点与大米基因组交界处设计了能特异性鉴别转基因大米内标基因sps成分的寡核苷酸引物对和探针，能从样品dna中高效特异扩增出一段较短的转基因大米特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于数字pcr方法检测转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对和荧光标记探针，所述引物对和探针是根据转基因大米内标基因sps与其他品系转基因作物具有差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为sps-f3gaggtcaccaaggctgccagtg（seqidno.1）,所述下游引物为sps-r3gcactcctgattcttccaggcttc（seqidno.2）；所述探针为sps-p3taggcttcccagcaggcaaccaa

（seqidno.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。在一个实施方案中，本发明提供的转基因大米特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于数字pcr方法定量检测转基因大米内标基因sps成分的组合物，所述组合物包含转基因大米特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述转基因大米特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为seqidno.1，所述下游引物的碱基序列为seqidno.2；所述探针的碱基序列为seqidno.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供转基因大米内标基因sps成分的数字pcr定量检测方法，所述方法包括使用针对转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对和探针是根据转基因大米内标基因sps的唯一性而设计。在一个实施方案中，本发明的转基因大米内标基因sps成分的数字pcr定量检测方法中，所使用的转基因大米特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为seqidno.1，所述下游引物的碱基序列为seqidno.2；所述探针的碱基序列为seqidno.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。在一个实施方案中，所述的pcr扩增条件为95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50个循环；98℃10min（1℃/s）。

在一个实施方案中，本发明的转基因大米数字pcr定量检测方法还进一步包括确定特异性寡核苷酸引物和探针组合的定量检测限的步骤。在一个实施方案中，所述数字pcr检测方法定量检测出转基因大米内标基因sps成分的检测灵敏度为1copy/μl。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于精准定量检测转基因大米内标基因sps成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于数字pcr方法检测转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒优选实施方案中，本发明的转基因大米内标基因sps成分定量检测特异性寡核苷酸引物对是根据该品系特异性基因与其他任何一种转基因作物的序列均具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的转基因大米特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为seqidno.1，所述下游引物的碱基序列为seqidno.2；所述试剂盒中探针的碱基序列为seqidno.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于精准定量检测转基因大米内标基因sps成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于数字pcr方法鉴别转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含转基因大米特异性寡核苷酸引物对seqidno.1、seqidno.2和转基因大米特异性探针seqidno.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测转基因大米内标基因sps成分的数字pcr扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的pcr扩增条件是95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50个循环；98℃10min（1℃/s）。在一个具体的实施方案中，本发明用于转基因大米内标基因sps成分定量检测的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于数字pcr方法检测转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中转基因大米内标基因sps成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供果汁中转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对seqidno.1、seqidno.2和转基因大米特异性探针seqidno.3，在转基因大米its基因探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在定量检测转基因大米内标基因sps成分的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的转基因大米特异性寡核苷酸引物对和探针。更优选的，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的转基因大米特异性寡核苷酸引物对和探针在检测转基因大米内标基因sps成分中的应用。

本发明以转基因常见受体水稻品种“明恢63”及具有商业化前景的各品系转基因大米为参考模板，根据该品系特异性基因序列与其他转基因作物基因具有差异性的特点设计引物，利用数字pcr法定量检测样品中的转基因大米内标基因sps成分。

数字pcr技术(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)是通过将微量样品分级作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不会超过1个后，再将所有细分试样同时在相同条件下进行pcr放大，按照泊松分布原理逐个进行计数的一种技术，是一种绝对定量测量方法。

本发明的数字pcr检测方法不依赖于扩增曲线的循环阈值，也不需要看家基因和标准曲线，是dna绝对定量方法，具有结果可靠和准确灵敏等优点。本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的精准定量和低含量灵敏定性检测，具有定量结果准确、检测灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本发明的数字pcr检测方法和pcr检测试剂盒，可对转基因大米内标基因sps成分进行精准定量检测，其定量检测限能达到单拷贝/μl，适合用于国内外市场上米制品中转基因大米内标基因sps成分的实际定量检测需求。

附图说明

图1显示的是通过实时荧光pcr扩增转基因大米内标基因sps序列的结果，其中基线上方为非转基因大米“明恢63”、转基因大米tt51-1、克螟稻、科丰6号、m12、t1c-19、t2a-1、ll601、ll62、g6h1样品的扩增曲线，基线下方为非转基因大豆、转基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、非转基因玉米、转基因玉米nk603、mon88017及空白对照（无菌双蒸水）。

图2显示的是数字pcr精准定量检测大米sps及其他常见作物的结果图，其中从左到右依次为非转基因大米“明恢63”、转基因大米tt51-1、克螟稻、科丰6号、m12、t1c-19、t2a-1、ll601、ll62、g6h1、非转基因大豆、转基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、非转基因玉米、转基因玉米nk603、mon88017及空白对照（无菌双蒸水）的数字pcr微滴分布图。

表1是对数字pcr精准定量检测转基因大米内标基因sps成分的准确性和灵敏度进行评价，将转基因大米样品基因组dna原液分别稀释2.5倍、5倍和10倍，每个梯度重复3次实验。

图3是利用本发明建立的数字pcr技术对理论含量为1.00copies/μl的sps低含量模拟样品进行精准定量的数字pcr微滴分布图。从左到右，分别为10个平行，每个平行均进行了2次重复实验。

图4是利用本发明建立的数字pcr技术对理论含量为1.00copies/μl的sps低含量模拟样品进行精准定量的数字pcr微滴分布图。从左到右，分别为6个平行，每个平行均进行了2次重复试验。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本发明的发明人首次通过实时荧光pcr（探针法）扩增转基因大米内标基因sps。所使用的转基因大米内标基因sps引物探针序列为上游引物rb-f2ctagaggatcccggacgagtg（seqidno.1），下游引物rb-r2atgagtggtagcgtccagaaggaaa（seqidno.2）；探针为rb-p2ctggggcagataagcagtagtggtggg（seqidno.3）。

1.所使用的检测主要仪器：

微量移液器（eppendorf）、荧光定量pcr仪（ab7500）、高速台式离心机(12000r/min)、电泳仪(dyy22c型)等。

2.检测主要试剂：

2×taqmanuniversalpcrmastermix(abi)，引物探针（thermofisher）等。

3.检测主要步骤：

实时荧光pcr反应体系：

2×mastermix12.5μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探针（10mm）0.5μl

模板dna50ng

加无菌双蒸水至总体积为25μl

注：每次pcr检测均设立相应的空白对照（用配制反应体系的超纯水代替dna模板，检测试剂是否受到污染）；

4实时荧光pcr反应参数：

95℃10min

95℃15s

60℃1min

注：不同仪器应将pcr各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，利用实时荧光pcr检测转基因大米内标基因sps时，非转基因大米“明恢63”、转基因大米tt51-1、克螟稻、科丰6号、m12、t1c-19、t2a-1、ll601、ll62、g6h1品系样品可出现扩增曲线，其他样品非转基因大豆、转基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、非转基因玉米、转基因玉米nk603、mon88017及空白对照（无菌双蒸水）均未出现荧光曲线，表明该引物探针对转基因大米sps品系具有特异性。

实施例2

本实施例为通过使用转基因大米sps品系特异性引物探针序列经数字pcr定量检测转基因大米基因的拷贝数。所使用的转基因大米sps品系特异性引物探针序列为上游引物sps-f1gagaacaagaagccccttctgtctcg（seqidno.1），所述下游引物为sps-r1aaggtactaaagcttgaaaatcctaaggc（seqidno.2）；所述探针为sps-p1cacattcggcagtgaaactcttgagcgcc（seqidno.3）。

1.所使用的检测主要仪器：

微量移液器（eppendorf）、微滴式数字pcr仪（bio-rad,qx200）、高速台式离心机(12000r/min)等。

2.检测主要试剂：

2×taqmanmastermix(bio-rad)，引物探针（thermofisher）等。

3.检测主要步骤：

数字pcr反应体系：

2×mastermix10μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探针（10mm）0.5μl

模板dna5.0μl

无菌双蒸水2.5μl

注：每次pcr检测均设立相应的空白对照（用配制反应体系的超纯水代替dna模板，检测试剂是否受到污染）；

4.数字pcr反应参数：

95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50个循环；98℃10min（1℃/s）

注：不同仪器应将pcr各试剂及反应参数做适当调整。

利用数字pcr精准定量检测同样dna浓度的转基因大米及其他样品时，成功检测出非转基因大米“明恢63”、转基因大米tt51-1、克螟稻、科丰6号、m12、t1c-19、t2a-1、ll601、ll62、g6h1这10中大米（图2中d01、e01、f01、h01、a02、b02、c02、d02、e02、f02），而其他样品非转基因大豆、转基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、非转基因玉米、转基因玉米nk603、mon88017及空白对照（a07-h07）均无阳性微滴出现，表明该方法可准确特异的检测出样品中的sps基因成分，即可检测出大米成分。

实施例3

与实施例2所述的方法相同，只是将转基因大米样品基因组dna先稀释5倍后再进行3个梯度的10倍稀释后作为模板，每个稀释梯度重复3次，采用转基因大米sps扩增引物探针序列与实施例2中的相同，进行数字pcr定量检测，以测定方法灵敏度。

当空白对照（无菌双蒸水）无扩增信号时，原液及其稀释2、4、8、16、32倍后的含量分别为1845.3、987.0、480.0、245.3、123.3、62.2copies/μl，偏差均远小于20%，分别为-0.53%、6.42%、3.5%、5.79%、6.35%、7.3%，定量实际值基本符合其理论拷贝数值，且各浓度梯度的微滴分布图中阴性点和阳性点能较好区分（图3），各稀释梯度的3次重复的rsd值在0.8%-3.4%之间（表1），表明该精准定量检测方法检测转基因大米内标基因sps成分时准确性和灵敏度较好，可对不同含量的内标基因sps成分进行精准定量。

实施例4

本实施例中提供精准定量检测转基因大米内标基因sps成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明的用于数字pcr方法鉴别转基因大米内标基因sps成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。所述试剂盒包括引物对seqidno.1、seqidno.2和转基因大米特异性探针seqidno.3，在转基因大米tt51-1品系特异性基因探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团bhq1，5’端连接有一个荧光报告基团fam，所述使用说明书中给出了pcr扩增条件，该条件为95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50个循环；98℃10min（1℃/s）。对于不同仪器，反应参数做适当调整。与实施例3所述的方法相同，对理论含量为1.00copies/μl的sps低含量模拟样品进行dpcr扩增，每个样品重复2次，共设置6平行。

如图4所示，sps理论浓度为单拷贝/μl时，6平行样品定量结果分别为0.94copies/μl、0.86copies/μl、1.37copies/μl、1.05copies/μl、1.2copies/μl、0.95ies/μl，与理论含量值的平均偏差为7.1%，6份样品的平均rsd为11.48%，结果显示，表明该方法对于精准定量检测低含量的转基因大米内标基因sps成分时方法精密度和重现性均较好。

由于目前的数字pcr平台分为微滴式和芯片式两种，本发明通过在不同平台进行实施例分析，验证了本发明所建立的方法对于这两个平台同时适用。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰，。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

表1