本发明涉及一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，属于植物蛋白加工技术领域。
背景技术：
大豆分离蛋白含有丰富的碳源和氮源，且含有人体八种必须氨基酸，生物价值高，易于消化吸收。大豆分离蛋白制品营养丰富、合理，结构较佳，对平衡膳食起着重要作用，在食品工业中具有广阔的应用前景。大豆分离蛋白不仅在食品工业大放异彩，在微生物发酵工业也具有广泛的应用。
目前，由于大豆分离蛋白具有良好的溶解性、乳化性及凝胶性而广泛应用于食品的多个领域，实用性较强，但对微生物培养方面研究的很少，无培养微生物专用的大豆分离蛋白。现有技术制备的大豆分离蛋白，尽管满足微生物生长的需求，但分子量高，不适宜微生物的消化吸收、生长利用；普通型大豆分离蛋白溶于水后，粘度过高，不利于培养微生物的规模化、连续化及产业化；普通型大豆分离蛋白在搅拌过程形成的疙瘩较多，操作困难，对设备的要求苛刻；而且氨基酸态氮不适宜，碳源过高，微生物发酵液偏黄，菌丝易衰老，孢子较多；当氮源过高时，菌丝细长，代谢产物较难提取，以上缺陷影响了微生物的生长态势，影响产品的质量。以上缺陷限制了大豆分离蛋白在微生物发酵方面的应用。
中国专利文献cn101642184a公开了一种注射型大豆分离蛋白及其制备方法，采用低温豆粕为原料，经过碱提、脱气、酸沉制备分离蛋白凝乳，然后使用中性蛋白酶对分离蛋白凝乳进行酶解，酶解后在酶解产物中加入混拌用大豆磷脂，后经过加热灭酶、灭菌、闪蒸、均质、喷雾干燥处理得到分散性、吸水性、保水性、吸油性和凝胶性都较好的大豆蛋白。但该发明只采用了中性蛋白酶处理中和料液，且使用量较少，对蛋白酶解程度有限，氨基酸态氮不适宜，不利于微生物代谢产物的提取。
中国专利文献cn101372501a公开了一种大豆分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)真空干燥醇法大豆浓缩蛋白粉的制备；(2)溶液配制及热处理；(3)酸沉调中性；(4)瞬时加热灭菌及喷雾干燥。所制备的大豆分离蛋白既具有普通分离蛋白的高溶解性、高蛋白含量的优点，又具有豆腥味低，色泽浅，抗营养物质活性低，排放污水易于处理等普通大豆分离蛋白不具备的优点。但该制备方法杀菌温度较低，可能会导致产品的粘度过高，溶解过程形成的疙瘩较多，不适宜用作微生物的培养。
为解决上述问题提出本发明。
技术实现要素：
本发明提供一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，操作程序上简单、易行，所制备的大豆分离蛋白能够满足微生物生长的需求，分子量适宜，碳源和氮源适宜，溶于水后具有较低的粘度，疙瘩较少，利于微生物的规模化、连续化及产业化培养。
本发明的技术方案如下：
术语说明：
凝乳脱水：指蛋白粗提液经过酸沉后，进行离心分离脱水,得到的沉淀即酸沉蛋白的含水量。
喷涂比例：指喷涂物的质量与被喷涂物的质量的比值。
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃温度下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.5～10.0的碱溶液中，调节ph值为6.8～7.4，糖度为8.0～9.0，搅拌40-60min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入酸溶液，搅拌10-50min，经离心得到酸沉蛋白；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，调ph至6.00～6.30，糖度为18.0～19.5，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于50-60℃下，反应0.5-3h，得酶解液；
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液经杀菌、闪蒸处理，喷雾干燥，即得微生物专用型大豆分离蛋白。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述低温脱脂豆粕与碱溶液的质量比为1:7-11。
优选的，步骤(1)中所述低温脱脂豆粕与碱溶液的质量比为1:9.5。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述碱溶液为naoh或koh的水溶液。
根据本发明优选的，步骤(1)中采用酸溶液调节ph，所述酸溶液的质量浓度为30-35％。
根据本发明，采用经反渗透处理的工艺水或者低温脱脂豆粕来调节糖度。
优选的，所述酸溶液为盐酸、硫酸、磷酸或冰乙酸的水溶液。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的酸溶液为质量浓度为20-40％的盐酸水溶液，调节蛋白粗提液的ph为4.50～4.6；步骤(2)中所述酸沉蛋白凝乳脱水50～56％。
根据本发明优选的，步骤(3)中用质量浓度为20-40％的naoh或koh的水溶液调ph。
根据本发明优选的，步骤(3)酸沉蛋白液中所述酸沉蛋白的质量浓度为40-50％。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100：0.8～1.2：1.4～1.8。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述杀菌方法为：在杀菌温度为145～165℃，真空度为-0.005～0.03mpa条件下进行两次杀菌，杀菌时间分别为10-30s和40-90s，所述两次杀菌温度和真空度均相同。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述闪蒸条件为：闪蒸液位为45-55％，闪蒸真空度为-0.005～-0.015mpa。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述喷雾干燥条件为：送风温度为190～220℃，引风温度为80～90℃，采用液体磷脂进行喷涂，液体磷脂的喷涂比例为4‰。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶联合酶解作用，对蛋白酶解程度适宜，得到的大豆分离蛋白的分子量适宜，利于微生物的消化吸收、生长利用；溶于水后，粘度适宜，利于微生物的规模化、连续化及产业化培养；具有适宜的氨基酸态氮和碳源，利于微生物代谢产物的提取。中性蛋白酶和碱性蛋白酶混合联用效率高，能够控制蛋白水解的程度，同时无需要如同蛋白胨的加工一样，把蛋白水解程度控制到极高，减少了加工成本。
(2)本发明采用两次高温杀菌技术，有效的进行灭菌，进一步降低了大豆分离蛋白的分子量，降低了大豆分离蛋白溶于水后的粘度，同时也降低了溶解过程中形成的疙瘩数量，且进一步减小了氨基酸态氮的含量，使具有更适宜的氨基酸态氮含量，并有效增加了大豆分离蛋白的分散性；同时采用液体磷脂进行喷涂改善产品的亲水性。
(3)本发明制备方法简单，易于操作，所制备的微生物专用型大豆分离蛋白分散性好、分子量适宜、粘度低、氨基酸态氮和碳源适宜，而且培养的微生物生长态势良好，微生物产物收率高；所制备的微生物专用型大豆分离蛋白的蛋白质含量达90％以上，粘度60～150cp·s，氨基酸态氮0.32～0.45％，满足了微生物生长的成分，并且适合连续加工等优点，可广泛应用于食品发酵工业中。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中，低温脱脂豆粕，山东禹王生态实业有限公司有售；中性蛋白酶为丹尼斯克中性蛋白酶；碱性蛋白酶为丹尼斯克食品级碱性蛋白酶。
实施例1
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃温度下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.6的naoh水溶液中，所述低温脱脂豆粕与naoh水溶液的质量比为1:9.5，用质量浓度为30-35％的盐酸调节ph值为6.8，用经反渗透处理的工艺水调节糖度为8.2，搅拌50min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入30％的盐酸调节溶液的ph为4.54，搅拌20min，经离心得到酸沉蛋白，其中酸沉蛋白凝乳脱水52％；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，用质量浓度为30％的naoh水溶液调ph至6.18，用经反渗透处理的工艺水调糖度为18.6，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于55℃下，反应1h，得酶解液；所述酸沉蛋白液中酸沉蛋白的质量浓度为48％，所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100:1:1.5。
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液在温度为158℃，真空度为-0.005mpa条件下，分别杀菌15s和60s；经闪蒸处理，喷雾干燥制备得到微生物专用型大豆分离蛋白。所述闪蒸处理条件为；真空度为-0.005mpa，闪蒸液位为45-55％；所述喷雾条件为：送风温度：198℃，引风温度为84℃，采用液体磷脂进行喷涂，喷涂比例为4‰。
实施例2
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃温度下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.8的koh水溶液中，所述低温脱脂豆粕与koh水溶液的质量比为1:9.5，用质量浓度为30-35％的盐酸调节ph值为6.8，用经反渗透处理的工艺水调节糖度为8.6，搅拌50min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入30％的盐酸调节溶液的ph为4.52，搅拌20min，经离心得到酸沉蛋白，其中酸沉蛋白凝乳脱水51.6％；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，用质量浓度为30％的naoh水溶液调ph至6.21，用经反渗透处理的工艺水调糖度为19.1，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于50℃下，反应1h，得酶解液；所述酸沉蛋白液中酸沉蛋白的质量浓度为48％，所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100:0.8:1.7。
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液在温度为156℃，真空度为0.03mpa条件下，分别杀菌15s和60s；经闪蒸处理，喷雾干燥制备得到微生物专用型大豆分离蛋白。所述闪蒸处理条件为；真空度为-0.006mpa，闪蒸液位为45-55％；所述喷雾条件为：送风温度：196℃，引风温度为85℃，采用液体磷脂进行喷涂，喷涂比例为4‰。
实施例3
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.6的koh水溶液中，所述低温脱脂豆粕与koh水溶液的质量比为1:9.5，用质量浓度为30-35％的盐酸调节ph值为7，用经反渗透处理的工艺水调节糖度为8.2，搅拌50min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入30％的盐酸调节溶液的ph为4.55，搅拌20min，经离心得到酸沉蛋白，其中酸沉蛋白凝乳脱水51.7％；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，用质量浓度为30％的naoh水溶液调ph至6.28，用经反渗透处理的工艺水调糖度为19.5，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于53℃下，反应1h，得酶解液；所述酸沉蛋白液中酸沉蛋白的质量浓度为48％，所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100:0.9:1.6。
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液在温度为160℃，真空度为0.01mpa条件下，分别杀菌15s和60s；经闪蒸处理，喷雾干燥制备得到微生物专用型大豆分离蛋白。所述闪蒸处理条件为；真空度为-0.005mpa下，闪蒸液位为45-55％；所述喷雾条件为：送风温度：199℃，引风温度为86℃，采用液体磷脂进行喷涂，喷涂比例为4‰。
实施例4
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.6的naoh水溶液中，所述低温脱脂豆粕与naoh水溶液的质量比为1:7，用质量浓度为30-35％的硫酸调节ph值为7.4，用经反渗透处理的工艺水调节糖度为8.0，搅拌50min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入30％的盐酸调节溶液的ph为4.54，搅拌20min，经离心得到酸沉蛋白，其中酸沉蛋白凝乳脱水52％；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，用质量浓度为30％的naoh水溶液调ph至6.18，用经反渗透处理的工艺水和酸沉蛋白混合调糖度为18.6，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于50℃温度下，反应0.5h，得酶解液；所述酸沉蛋白液中酸沉蛋白的质量浓度为48％，所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100:1.2:1.4。
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液在温度为155℃，真空度为0.01mpa条件下，分别杀菌10s和50s；经闪蒸处理，喷雾干燥制备得到微生物专用型大豆分离蛋白。所述闪蒸处理条件为；真空度为-0.01mpa下，闪蒸液位45-55％；所述喷雾条件为：送风温度：190℃，引风温度为80℃，采用液体磷脂进行喷涂，喷涂比例为4‰。
实施例5
一种微生物专用型大豆分离蛋白的制备方法，包括步骤如下：
(1)碱溶：50-55℃下，将低温脱脂豆粕浸于ph值为9.6的naoh水溶液中，所述低温脱脂豆粕与naoh水溶液的质量比为1:11，用质量浓度为30-35％的磷酸调节ph值为6.8，用经反渗透处理的工艺水和低温脱脂豆粕混合液调节糖度为9.0，搅拌50min；经固液分离，得到蛋白粗提液；
(2)酸沉：室温下，向步骤(1)得到的蛋白粗提液中加入30％的盐酸调节溶液的ph为4.6，搅拌20min，经离心得到酸沉蛋白，其中酸沉蛋白凝乳脱水52％；
(3)中和酶解：室温下，将步骤(2)得到的酸沉蛋白溶于水中，用质量浓度为30％的naoh水溶液调ph至6.3，用经反渗透处理的工艺水和酸沉蛋白混合调节糖度为18.0，得酸沉蛋白液；加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶，于60℃温度下，反应3h，得酶解液；所述酸沉蛋白液中酸沉蛋白的质量浓度为48％，所述酸沉蛋白、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的质量比为100:1.2:1.8。
(4)精制：步骤(3)得到的酶解液在温度为160℃，真空度为0.01mpa条件下，分别杀菌20s和80s；经闪蒸处理，喷雾干燥制备得到微生物专用型大豆分离蛋白。所述闪蒸处理条件为；真空度为-0.01mpa下，闪蒸液位为45-55％；所述喷雾条件为：送风温度：200℃，引风温度为90℃，采用液体磷脂进行喷涂，喷涂比例为4‰。
对比例1
一种大豆分离蛋白的制备方法，制备步骤与实施例1不同的是，步骤(3)中只添加碱性蛋白酶，所述酸沉蛋白和碱性蛋白酶的质量比为100:2.5，其它步骤一致。
对比例2
一种大豆分离蛋白的制备方法，制备步骤与实施例1不同的是，步骤(4)中杀菌方法为：在温度为158℃，真空度为-0.005mpa下，进行一次杀菌，杀菌时间为60s，其它步骤一致。
对比例3
一种大豆分离蛋白的制备方法，制备步骤与实施例1不同的是，步骤(3)中只添加中性蛋白酶，所述酸沉蛋白和中性蛋白酶的质量比为100:2.5，其它步骤一致。
试验例1
对实施例1-5以及对比例1-3制备的大豆分离蛋白进行感官、理化和微生物测试，测试方法如下：
1、氨基酸态氮含量的测定：利用甲醛值法进行测定氨基酸态氮。称取5.0g试样置于100ml的容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀后吸取20ml，置于200ml的烧杯中，加60ml的水，开启搅拌器，用氢氧化钠标准溶液〔c(naoh)＝0.05mol/l〕滴定至酸度计指示ph为8.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总酸含量。加入10ml的甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准溶液滴定ph至9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时取80ml的水，先用氢氧化钠调节至ph为8.2，再加入10ml的甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定ph至9.2，同时做试剂空白试验。
x＝{(v1-v2)×c×0.014/5×(v3/100)}×100
x：试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百克；
v1：测定用样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积；
v2：试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积；
v3：试样稀释液取用量。
2、粘度的测定：量取240ml的0～5℃蒸馏水倒入搅拌器中，用精密天平准确称取60.0g大豆分离蛋白，倒入搅拌器中，将搅拌器调至1档，搅拌10s，清壁，搅拌30s，清壁，继续搅拌30s后倒入250ml高型烧杯中，静置1h后，加2滴消泡剂后进行测定，测定参数为：3号转子，40转速，结束条件10s。
3、疙瘩重的测定：称取10.0g的大豆分离蛋白，溶于40.0g的工艺水中，搅拌1min，以每秒钟2圈的速度进行搅拌，过40目的筛子，称取筛上物的重量。
4、蛋白含量的测定：准确称取样品5.0g置于250ml烧杯中，向250ml烧杯中加入100ml的蒸馏水于磁力搅拌器上低速搅拌1小时，再加入100ml蒸馏水，保持温度40℃，继续搅拌1小时，将搅拌完毕的萃取液转移至250ml的容量瓶中，冷却后定容，将定容液充分摇匀倒入离心管中，在转速4000转/分的离心机中离心10分钟，离心完毕，将离心液用快速滤纸过滤，收集滤液于锥形瓶中。吸取50ml滤液置于250ml烧杯中，静置30分钟，再置于离心管中在转速4000转/分的离心机中离心10分钟，将上清液过滤，用50ml移液管取50ml过滤液进行蛋白含量测定，蛋白含量采用凯式定氮的方法进行测定，并把它乘以系数6.25转换为粗蛋白质的含量。水解程度＝{(v1-v2)×c×0.014×6.25×10×100×100/m×(100-w)}×100
式中：v2：滴定吸收液时消耗标准hcl溶液的体积(ml)；
v1：滴定空白时消耗标准hcl溶液的体积(ml)；
c：标准hcl溶液摩尔浓度；
k：蛋白质系数6.25；
w：蛋白粉的含水量；
m：蛋白粉质量(g)。
5、分散性测试：量取190ml室温水放入500ml烧杯中，再称取10g样品放于烧杯中，用玻璃棒充分搅拌，观察完全分散的时间。
测试结果如表1所示：
表1
综合分析，由表1可知，本发明制备的微生物专用型大豆分离蛋白具有高的蛋白含量，溶于水后粘度较小，分散性较好，氨基酸态氮含量适宜，疙瘩数量少，灭菌后微生物含量低。本发明采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶联合酶解作用，有效的降低了大豆分离蛋白溶于水后的粘度，使氨基酸态氮含量适宜；采用两次高温杀菌技术，有效的进行了灭菌，进一步降低大豆分离蛋白溶于水后的粘度，并且有效的降低了溶解过程中形成的疙瘩数量，并进一步减小氨基酸态氮的含量，使具有更适宜的氨基酸态氮含量，并有效增加了大豆分离蛋白的分散性。
试验例2
对实施例1-5以及对比例1-3制备的大豆分离蛋白进行微生物培养试验，试验方法如下：
将5g实施例1-5以及对比例1-3制备的大豆分离蛋白溶于100ml基础培养基ypd培养基中，同时设置一空白培养基即100ml基础培养基ypd培养基，将酿酒酵母菌(cicc1921)以1％的接种量分别接种到上述培养基中，30℃摇床150转/分钟振荡培养30h，测试菌落数。
上述基础培养基ypd培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，其余为水，调ph为6.0,121℃高压蒸汽灭菌20min。
测试结果如下：
综合分析，本发明制备的大豆分离蛋白加入培养基后，微生物生长态势良好，微生物产物收率高，说明本发明制备的大豆分离蛋白利于微生物的消化吸收和生长利用。