本发明属于生物防治领域，涉及一种白僵菌菌株及其应用，具体地说涉及一株对榛椿象具有强致病力的白僵菌菌株及其应用。
背景技术：
榛椿象在榛园中的发生相当普遍，若虫和成虫吸食榛子的嫩芽、嫩梢，花穗和幼果汁液，引起榛子褐色顶端坏死病等病害的流行，可导致榛子落花落果，造成产量损失；另一方面，榛椿象可对榛子果仁质量造成伤害。据报道，榛椿象可致多达22%的榛子果仁受害，平均约为5%左右。部分受害果实外观异常，但也有部分受害果外观表现正常。因此，受榛椿象危害的虫果在采收后部分可通过手工进行筛除，而部分虫果需去壳后进一步通过激光或手工进行分选。目前，在全世界的榛园中共计发现12种榛椿象，危害比较严重的主要是绿盾榛椿象(palomenaprasinal.(het.:pentatomidae))。
榛椿象是杂食性昆虫。刚越冬的成虫色泽较暗，有时呈褐色，在吉林省4月末至5月初时开始活动。经取食与交配后，产卵于榛子展开的叶片上。榛椿象若虫共有5个龄期，其发育持续5～6周。榛椿象1年仅繁殖1代。受榛椿象危害的榛子果实变小，果壳色呈褐色，果仁皱缩，味苦。在早春，成虫在果簇的取食活动也可导致果实的早期脱落。目前，该虫在东北榛子产区已经造成严重危害，生产中主要采取化学防治措施。多年施用化学农药易致使榛椿象产生抗药性，而化学防治导致的农药残留问题不能满足榛子绿色果品生产的需要。因此，探寻适宜的榛椿象无公害防治手段显得十分必要与迫切。
白僵菌是目前应用最为广泛的杀虫真菌之一，具有寄主范围广、致病力强，杀虫效果明显，环保无污染、不易产生抗药性等特点，在农林害虫的防治上应用十分广泛。然而，白僵菌寄主范围虽广，但其靶向性较强，对不同害虫的致病力差异十分显著。目前，国内外均缺乏榛椿象的强致病力菌株。可见，筛选获得榛椿象的强致病力菌株是对其进行有效生物防治的关键。本发明提供了一株对榛椿象具有强致病力的白僵菌菌株，并进行了田间应用。
技术实现要素：
本发明的目的是要提供一株对榛椿象(palomenaprasinal.(het.:pentatomidae))具有强致病力的白僵菌菌株（beauveriabassianacobb01）及其应用，并在榛园中进行了应用，旨在为榛椿象的生物防治提供关键菌株，避免多年化学防治带来的食品和环境安全问题。
本发明目的是这样实现的，一株对榛椿象(palomenaprasinal.(het.:pentatomidae))具有强致病力的白僵菌菌株（beauveriabassianacobb01），已于2016年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏编号为cgmccno.12108，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的主要目的是要提供上述球孢白僵菌菌株cobb01在防治榛椿象上的应用。本发明于2015年7月，在吉林省伊通满族自治县进行榛园虫情调查时发现球孢白僵菌在榛椿象中流行，导致大量榛椿象若虫、成虫死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的可寄生榛椿象且流行性很强的虫生真菌，在防治榛椿象方面具有很大的开发应用前景。
本发明从感病的榛椿象成虫尸体上分离获得球孢白僵菌菌株，将野生菌株回接于健康的榛椿象若虫和成虫虫体表面，致榛椿象感病死亡后，从榛椿象中再次分离、纯化球孢白僵菌。球孢白僵菌经复壮后，筛选获得具有强致病力的菌株cobb01。在pda培养基上，其培养初期菌落呈白色长绒状，背面无色，在光学显微镜下观察，菌丝具分隔、分枝且透明，且能观察到白僵菌属典型的特征；但至培养的后期，菌落呈淡黄色粉末状，菌落背面呈淡黄色，而且菌丝和产孢细胞明显减少，仅见膨大的不规则的泡囊增生，显微镜下大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状。分生孢子单孢，透明，多呈卵圆形，较大，直径2.4-3.2μm，在pda培养基培养后期，可见由菌丝细胞壁加厚而形成的卵圆形厚垣孢子。
相对于现有的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从感病的榛椿象成虫尸体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高；其分生孢子粉对榛椿象不同发育阶段的若虫和成虫的致病力均较强，环境友好、不易产生抗药性，可以广泛地应用于榛椿象的生物防治。
附图说明
图1为菌株cobb01处理后榛椿象的累积死亡率变化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。通过从虫生真菌侵染后致死的榛椿象体内分离纯化致病菌，并对其进行形态观察，结合分子鉴定，确定致病菌的种类，并测定了菌株对榛椿象的毒杀效果。
实施例1：病原菌的分离、鉴定
1.1材料
在四平市伊通满族自治县，收集被虫生真菌侵染后致死的榛椿象尸体用于致病菌的初期分离与纯化。
1.2榛椿象致病微生物的分离与纯化
选取色白、死亡时间短的榛椿象僵虫，在无菌超净工作台上用无菌水冲洗两次，然后用无菌吸水纸吸干表面水份。75％体积浓度的乙醇浸泡榛椿象尸体30s，无菌水冲洗3遍，切取虫体腹部中间部位的组织块接种于pda培养基中，组织块直径约2mm。pda培养基配方如下：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，自然ph。
每个含有pda培养基的培养皿中接种1个榛椿象组织块，接种的培养皿放置于恒温箱中黑暗静置培养，培养温度28℃，定期观察菌落生长情况。
1.3菌株的纯化与保存
观察比较培养皿中菌落的生长情况及菌落外观形态特征，将形态特征明显不同或者颜色有差异的菌落挑选分离出来，将其接入新的pda培养基中，进行重新培养，并初步以阿拉伯数字进行简单编号以作区别，重复以上步骤3～4次，直到同一个培养皿中不再重复出现2种不同的菌株，2个培养皿不再出现相同菌株为止。将所获得的所有菌株回接到健康的榛椿象成虫上，结果发现有1个菌株可以引起健康榛椿象成虫快速死亡，且虫体体表在5～7天内长满棉絮状的菌丝。从感染该菌株的榛椿象尸体中重新分离纯化致病菌，所获得的纯培养菌株培养5～7天后，产生大量分生孢子，收集分生孢子，用无菌水稀释至终浓度108孢子/ml，用小型喷雾器均匀喷洒榛椿象成虫体表（以虫体表面湿润为度），培养于相对湿度80%的培养箱中。重复以上分离纯化、侵染过程2～3次，得到复壮的、致病力强的菌株cobb01。所获得的高毒力菌株转接到新鲜pda斜面培养基上，然后在4℃条件下进行保存。
1.4菌株的鉴定
根据所分离菌株纯培养的菌落特征、菌丝和分生孢子的形态特征进行鉴定。实验结果表明：从被虫生真菌自然侵染的榛椿象成虫虫体上分离所获得的菌株，在pda培养基上获得纯培养，按照科赫法则，对该菌种进行复壮和分离纯化，分离纯得菌株的纯培养，即球孢白僵菌(beauveriabassianacobb01)。其菌落特征为：在pda培养基上，其培养初期菌落呈白色长绒状，背面无色，在光学显微镜下观察，菌丝具分隔、分枝且透明，且能观察到白僵菌属典型的特征；但至培养的后期，菌落呈淡黄色粉末状，菌落背面呈淡黄色，而且菌丝和产孢细胞明显减少，仅见膨大的不规则的泡囊增生，显微镜下大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状。分生孢子单孢，透明，多呈卵圆形，较大，直径2.4-3.2μm，在pda培养基培养后期，可见由菌丝细胞壁加厚而形成的卵圆形厚垣孢子。根据榛椿象的感染症状，菌落和菌体特征，分析该菌株为球孢白僵菌的变种。
实施例2：菌株的分子鉴定
2.1真菌基因组dna提取
用北京艾德莱生物科技有限公司生产的基因组dna快速提取试剂盒提取球孢白僵菌（beauveriabassianacobb01）基因组dna，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测dna的浓度、纯度与完整性。
2.2pcr反应体系
核糖体dna的its区域通用引物由大连宝生物生物技术有限公司合成，引物系列为：its15′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′，its45′-tcctccgcttattgatatgc-3′。20µlpcr反应体系：10μm的引物its11.0µl，10μm的引物its41.0µl，10×pcrbuffer2.0µl、mg2+（2.5mmol/l）1.0µl，dntp（10mmol/l）1.0µl，5uμl-1的taqdna聚合酶0.25µl，ddh2o补齐到20µl。pcr扩增条件为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃降温10min，1个循环。pcr反应完成后，将反应产物放置于4℃条件下保存。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物浓度及pcr扩增片段大小。用大连宝生物的dna产物回收试剂盒进行pcr产物的回收。
2.3分子测序与菌种鉴定
回收后的pcr产物送上海生工生物技术有限公司进行测序。所得的核苷酸序列与genbank已注册的基因序列进行同源性比较，以相似性99%及以上为标准，进行菌种的分子鉴定。
2.4研究结果
以菌株cobb01基因组dna为模板，用特异性引物its1和its4进行pcr扩增，获得了片段长度为569bp的扩增产物。对该pcr扩增产物进行了回收与测序，结果表明其与genbank中的球孢白僵菌菌株beauveriabassiana菌株（gu565572.1和jf429894.1）的同源性为99%，推断该菌株为球孢白僵菌。
实施例3:菌株的毒力测试
3.1真菌孢子悬浮液制备
将保存的菌株cobb01接种于pda培养基中，28℃恒温培养10天，刮取其分生孢子，无菌水稀释成1.0×108孢子/ml的孢子悬液。
3.2室内毒力测定
采用喷雾法进行毒力测定试验。挑取榛椿象3龄健壮若虫约150头（每次重复约50头，共3次重复），采用上述孢子悬液，用小型喷雾器均匀喷洒榛椿象虫体表面，置于剪取的新鲜榛树枝条叶片上培养，枝条插于盛清水的大烧杯中。培养温度为25℃，相对湿度60%，光照周期为12小时黑暗，12小时照光。并以蒸馏水喷雾处理的榛椿象3龄健壮若虫作对照（每次重复约50头，共3次重复），每天观察并记录死亡情况。
3.3结果
菌株cobb01处理后榛椿象的累积死亡率变化如图1所示。菌株cobb01喷雾处理后，榛椿象若虫于处理后3天开始出现死亡，处理后的第7天死亡率约为50%（lt50=6.32），第12天达到90%（lt90=10.92），同时大量菌丝和分生孢子从虫体关节部位长出，第13天全部死亡。对照处理的榛椿象若虫在处理后的第13天死亡率仅为4.54%。可见，球孢白僵菌（beauveriabassianacobb01）对榛椿象有良好的杀灭效果，在榛椿象的生物防治中可能起到重要的作用。目前还末见其它beauveriabassiana菌株在榛椿象(palomenaprasinal.(het.:pentatomidae))上相关的报道。