一株小球藻及其在降解污水中的应用的制作方法

本发明涉及一株小球藻及其在降解污水中的应用，属于环境工程技术领域。

背景技术：

近几十年来人们逐渐重视环境保护，国家加大力度对污染水体进行防治，但多年来河流、湖泊等污染未能得到有效地遏制，水体污染负荷不断增加，富营养化问题仍然严重，饮用水安全依然受到威胁。

从以下两方面来分析：

第一，工业企业和污水处理厂仍然存在尾水或中水氮排放不达标、排放标准不完善和监管力度不足等问题，亟待解决开发除氮技术体系、完善排放标准和加大监管力度。

随着污水处理厂纳污范围扩大，一些工业污水也被纳入污水处理厂，污染物成分复杂多样，氮、磷等营养盐浓度过高等问题频频出现，现有的工艺基本未设置脱氮除磷的深度处理。此外，随着污水量的增加，污水处理厂已超出自己的原定处理能力，影响了污水处理设施的正常运行，导致出水中的氮、磷等超标排放。

第二，造成水资源受到严重污染的根本原因是大量生产、生活废水未经处理，或虽处理但未达标，这些未得到充分利用的废水既污染环境，又浪费资源，迫切需要进行资源化利用及对水资源的防治。

水中的污染物除氮、磷外，还有其他有机物，而有机污染物不仅在水中存在时间长，范围广，而且危害大，有一些很难降解。因此，有机污染物特别是有机难降解污染物的处理，一直是环保领域的一个重要研究课题。化学需氧量cod(chemicaloxygendemand)是以化学方法测量水样中需要被氧化的还原性物质的量。废水、废水处理厂出水和受污染的水中，能被强氧化剂氧化的物质(一般为有机物)的氧当量。在河流污染和工业废水性质的研究以及废水处理厂的运行管理中，它是一个重要的而且能较快测定的有机物污染参数。

综上，由于氮、磷污染物以及有机物污染物来源广泛、污染途径及过程复杂、传统的技术处理效果不高、新技术难以实现规模化应用等原因，而且氮、磷和cod都能导致水体的严重污染，可引起水体的富营养化等众多环境污染问题。

技术实现要素：

为了解决污水中总氮、总磷以及cod难以处理的问题，本发明筛选得到了一株能降解污水中总氮、总磷和cod的藻类并将其用于污水处理，为污水中处理提供了一种新的方法。本发明从河道的水中经过多次反复筛选，最终分离出一株能够降解同时降解总氮、总磷和cod的藻类，选取这株藻，对其进行形态观察、生物学特性研究并确定其分类地位，并优化其生长培养基，经18srrna鉴定确定这株藻类为小球藻(chlorellasp.)dyz-1。

目前关于藻类净化水体的报道较少，而且由于水中营养盐组成的变化，会导致水体藻相的变化，常常爆发蓝藻，导致灾难性的后果。因此，需要大量有益的单细胞藻类能够快速高效降解污水中的无机物，抑制蓝藻的爆发。由此可以避免投洒农药，不会对水体造成二次污染。目前市面上有大量的有益单胞藻类产品，但是这些产品存在几个主要问题：第一，藻类退化严重，产品质量参差不齐，使用效果不稳定；第二，商品化产品价格较高，使用成本较高；第三，大多数藻类净化水体周期漫长。因此，提供一种稳定高效的藻类修复水体是十分有必要的。

本发明提供的小球藻(chlorellasp.)dyz-1，是绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，具有繁殖迅速、生物量大、易于培养的特点，细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可广泛应用于饲料和食品添加剂，并且不会对水体造成任何污染，是一种极具经济效益的微藻。

本发明利用小球藻(chlorellasp.)dyz-1去除废水中总氮、总磷和cod，以实现环境友好、生态、高效、廉价的去除废水中的总氮、总磷以及cod，适合处理水量大、总氮(120mg/l左右)、总磷(18mg/l左右)以及cod浓度低(4200mg/l左右)的污水。达到将废水中蕴藏的碳源加以利用，在废水资源化的同时对其它行业产生一定的经济效益的目的。本发明提供的利用小球藻(chlorellasp.)dyz-1去除废水中总氮、总磷和cod的方法，周期缩，解决了其净化水体周期漫长的问题。

生物材料保藏

小球藻(chlorellasp.)dyz-1，已于2017年5月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017231，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1小球藻降解总氮曲线；

图2不同接种量的小球藻的生长曲线；

图3-a接种量为1％时小球藻的降解曲线；

图3-b接种量为3％时小球藻的降解曲线；

图3-c接种量为5％时小球藻的降解曲线；

图4小球藻降解总氮曲线效应图；

图5小球藻降解总磷曲线；

图6小球藻降解cod曲线；

图7-a接种量为1％时小球藻的降解曲线；

图7-b接种量为3％时小球藻的降解曲线；

图7-c接种量为5％时小球藻的降解曲线；

图8小球藻降解cod效应曲线图；

图9显微镜下的小球藻的照片。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1：小球藻降解总氮效果的测定

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)。

模拟污水培养基：kh2po41g，nacl3g，k2hpo41g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)。

取20μl种子液，接种于50mlbg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，本实施例接种量为3％，则取3ml富集后的培养基，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体，用1ml模拟污水培养基将收集到的藻体悬浮接入含有100ml模拟污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养6天，采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定其降解总氮的效果，绘制其降解总氮曲线如图1所示。

结果表明：小球藻对模拟污水中的总氮降解效果比较明显，对总氮的降解率在80％以上，显示出小球藻具有降解污染物的潜力。

实施例2：不同接种量的小球藻降解总氮效果的测定

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)

模拟污水培养基：kh2po41g，nacl3g，k2hpo41g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)

取20μl种子液，接种于50mlbg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。分别按照不同的接种量(v/v)用模拟污水培养基将藻体悬浮接入含有100ml模拟污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养8天，测定其od540nm并采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定其降解总氮的效果，绘制其生长曲线如图2所示，降解总氮曲线如图3所示，可以看出小球藻的降解率并不与接种量成正相关的关系。

本实施例及其他实施例中，接种量(v/v)指的是：将20μl种子液接种于50mlbg-11培养基，30℃、90rpm振荡培养4天后，从中取的培养液的体积与用于继续培养小球藻的模拟污水培养基的体积。例如，接种量为2％时，用于继续培养小球藻的模拟污水培养基的体积为100ml，则需要从bg-11培养液中取2ml，然后离心，倒掉上清液，剩下藻体，用1ml(这个无所谓，也可以用0.5ml)模拟污水培养基将藻体悬浮起来，最后接入到模拟污水培养基中。

实施例3：不同温度、接种量、碳氮比、微量元素量对小球藻降解总氮的影响

取20μl种子液，接种于bg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。分别按照表1所示，配制相应的模拟污水培养基，250ml三角瓶含有100ml模拟污水培养基，在相应条件下，90rpm振荡培养6天，采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定其降解总氮的效果，其降解总氮结果如表2所示，绘制其效应曲线图如图4所示。

表1实验设计

表2直观分析表

结果表明：由直观分析表可知，降解总氮的影响因素关系为：碳氮比>温度>接种量>微量元素。由效应曲线图4可知，温度在30～37℃，接种量在3％～5％的范围内，小球藻具有良好的降解总氮的效果，降解总氮效果最好的条件为：温度为30℃，接种量为3％，碳氮质量比为20，微量元素为1.5ml/l。

实施例4：小球藻降解磷效果的测定

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)。

模拟污水培养基：kh2po40.05g，nacl3g，k2hpo40.05g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)。

取20μl种子液，接种于bg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，本实施例接种量为3％，则取3ml富集后的培养基，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。用1ml模拟的污水培养基将藻体悬浮接入含有100ml模拟污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养6天，采用钼酸铵分光光度法测定其降解总磷的效果，绘制其降解总磷曲线如图5所示。

结果表明：小球藻对污水中的总磷降解率在95％以上，对磷具有较好地降解效果，可以简单地应用于水产养殖的水体中，对水体起到一定净化作用。

实施例5：小球藻降解cod效果的测定

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)

模拟污水培养基：kh2po41g，nacl3g，k2hpo41g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)

取20μl种子液，接种于bg-11培养基，37℃，90rpm振荡培养4天，取2ml富集后的培养基，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。用1ml模拟的污水培养基将藻体悬浮接入含有100ml污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养6天，采用重铬酸盐法测定其降解cod的效果，绘制其降解cod曲线如图6所示。

结果表明：小球藻对模拟污水中的cod降解率达90％左右，具有显著的降解效果，可以对水体中的有机物起到一定的降解作用，净化水体。

实施例6：不同接种量的小球藻降解cod效果的测定

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)。

模拟污水培养基：kh2po41g，nacl3g，k2hpo41g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)。

取20μl种子液，接种于bg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。分别按照不同的接种量(v/v)用模拟的污水培养基将藻体悬浮接入含有100ml污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养9天，采用重铬酸盐法测定其降解cod的效果，绘制其降解cod曲线如图7所示。

结果表明：虽然小球藻的接种量不同，但是其对于cod的降解并没有太大的变化，说明小球藻的接种量对cod的降解效果无显著正相关关系。

实施例7：不同温度、接种量、碳氮比、微量元素对小球藻降解cod的影响

取20μl种子液，接种于bg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。分别按照表3所示，配制相应的模拟污水培养基，250ml三角瓶含有100ml模拟污水培养基，在相应条件下，90rpm振荡培养6天，采用重铬酸盐法测定其降解cod的效果，其降解cod结果如表2所示，绘制其效应曲线图如图8所示。

表3实验设计

表4直观分析表

结果表明：由直观分析表可知，影响因素关系为：温度>碳氮比>微量元素>接种量。由效应曲线图8可知，温度在30～37℃，接种量在2％～3％的范围内，小球藻具有良好的降解cod的效果，降解cod的最佳条件为：温度为37℃，接种量为2％，碳氮质量比为15，微量元素为2ml/l。

实施例8：本实验室所筛选出的小球藻与其它相关报道的比较

总氮、总磷和cod的测定均采用国标测定方法，即采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法测定总氮，采用钼酸铵分光光度法测定总磷，采用重铬酸盐法测定cod。

小球藻富集培养基(bg-11培养基)：nano3225mg，k2hpo4·3h2o45.6mg，mgso4·7h2o125.7mg，cacl226.64mg，柠檬酸铁75.95mg，edta·2na10mg，h2o1l，微量元素1ml/l(h3bo428.6g/l，mncl2·4h2o18.1g/l，znso4·7h2o2.22g/l，na2moo4·2h2o3.9g/l，cuso4·5h2o0.79g/l，co(no3)2·6h2o0.494g/l)。

模拟污水培养基：kh2po40.05g，nacl3g，k2hpo40.05g，kno30.72g，c6h12o63.75g，h2o1l，微量元素1ml/l(mncl2·4h2o2.5g/l，znso4·7h2o2.2g/l，cuso4·5h2o0.2g/l，mgso4·7h2o10g/l，cacl2·2h2o7.3g/l，cocl2·6h2o0.5g/l，feso4·7h2o5g/l)。

分别取20μlcn105219648a中小球藻的种子液、cn105753245a中小球藻的种子液、cn102746991a中小球藻的种子液、cn104556406a中小球藻的种子液，以及本发明小球藻的种子液，分别接种于bg-11培养基，30℃，90rpm振荡培养4天，本实施例接种量为3％，则取3ml富集后的培养基，5000rpm离心10min弃上清液，收集藻体。用1ml模拟的污水培养基将藻体悬浮接入含有100ml模拟污水培养基的250ml三角瓶中，30℃，90rpm振荡培养6天。降解污水的效果如下表所示。

―—代表发明人未对其测定

通过比较，可以看出本发明所提供的小球藻，在降解总氮、总磷和cod方面，比其它报道的有关小球藻降解污水中污染物的效果显著，因此可以确定这是一株高效的小球藻，可快速有效地净化水体。

实施例9

小球藻(chlorellasp.)dyz-1的18srrna序列如seqisno.1所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

<120>一株小球藻及其在降解污水中的应用

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<213>小球藻（chlorellasp.）dyz-1

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