本发明涉及利用发酵调控手段以提高琥珀酸生产效率的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
丁二酸(succinicacid，butanedioicacid)，又称琥珀酸，被美国fda认定为“一般认为安全”(gras)，因此可以用于多种用途。2004年美国能源部的一份报告指出，丁二酸是合成大宗日用品和重要化学品的平台化学物质，有着巨大的经济价值。随着能源紧缺，利用生物发酵法生产丁二酸的前景非常广阔。
目前已开发出多项技术将丁二酸转化为重要的工业化学品，包括n-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、己二酸、pbt树脂、pbs可降解材料等。其中许多化工产品目前都是以石油或煤化工产品(如苯、丁烷等)为原料合成的，受原料价格波动较大，且资料紧缺，不可再生。现报道大约有250种以苯或丁烷为原料的化工产品可以通过丁二酸为原料来生产。因此，全球对丁二酸的需求将不断加大。
目前文献报道的发酵法生产丁二酸主要生产菌株有牛瘤胃中分离的产琥珀酸放线杆菌(actinobacillussuccinogenes)、产琥珀酸曼式杆菌(mannheimiasucciniciproducens)、产琥珀酸厌氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniproducens)，基因工程构建的大肠杆菌(escherichiacoli)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)、酵母菌(yeast)等。产琥珀酸放线杆菌(actinobacillussuccinogenes)能够利用的糖质原料包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖 等糖类，能利用多种农副产品如乳糖、木薯、玉米、甜菜、甘蔗糖蜜(中国专利申请200610038113.6、200710019686.9)和菊芋(中国专利申请200810007470.5)，也适于发酵秸秆、木材工业下脚料，制糖造纸业下脚料和城市纤维垃圾等木质纤维物的水解糖浆原料生产丁二酸(中国专利申请20071092025.6)。因此产琥珀酸放线杆菌是目前研究的最多的产丁二酸的菌株之一。
产琥珀酸放线杆菌为野生菌，具有稳定的遗传特性，能够耐受较高的产物与底物浓度，对各种廉价的废弃生物质的利用情况良好。且由于野生菌在发酵过程中生长和产酸是相偶联的，因此发酵方式采用的是一步厌氧发酵，反应条件温和，对设备的要求较低，因此在能耗和生产效率方面占有一定优势。
与工程菌相比，野生菌发酵过程中产生的副产物较多，丁二酸对碳源的质量收率相对较低，普遍在70％左右。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明需要解决的技术问题是公开一种产琥珀酸放线杆菌生产丁二酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，从而达到琥珀酸收率提高、副产物减少的目的。
本发明的主要内容是：将丁二酸发酵过程所需的氮源以一定的方式(发酵过程中分批次或者连续)加入到发酵罐中，分批加入的方式为在发酵进行至0h～30h时加入氮源，连续加入的方式为在发酵开始时以0.4～0.6g/l/h的速度将氮源补入发酵罐内。从而提高丁二酸的得率、减少副产物的产生。
所述的分批加入的方式为在发酵进行至0h～30h时加入氮源为在0h、10h、15h、20h、30h分别加入2g/l的氮源或是在0h、8h、14h、18h、30h分别加入 2g/l的氮源或是在0h、12h、16h、22h、30h分别加入2g/l的氮源。
所述的氮源为酵母粉、安琪酵母粉、豆饼粉、玉米浆干粉、花生饼粉、棉籽粉。
发酵采用的菌株为产琥珀酸放线杆菌(actinobacillussuccinogenes)nj113，该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为cn100537744c。
所述的丁二酸发酵过程如下：
发酵罐培养：将产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，将活化好的种子培养基和灭好的葡萄糖接入发酵培养基中，接种量为2～10％，(v/v)，搅拌转速为100～300rpm，35℃～39℃发酵培养，通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph为6.2～7.0，所述的ph调节剂是碳酸盐、氨水、naoh，所述的碳酸盐为碳酸钠，所述发酵的厌氧条件为通入n2或co2。
种子培养基(g/l)：葡萄糖8～12，酵母粉3～6，nahco38～11，nah2po4·2h2o1～3，k2hpo4·3h2o2～4蛋白胨1～3。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60～80，酵母粉8～12，玉米浆干粉3～6，乙酸钠0.5～1.5，kh2po2～4，mgcl2·6h2o0.2～0.4，无水cacl20.2～0.4。
有益效果：
本发明的突出特点是在现有条件的基础上，只需稍作改变即能实现丁二酸的高效制备，减少了发酵过程中的副产物，降低丁二酸的生产成本。
通常情况下氮源是与碳源一同加入发酵罐进行灭菌后进行发酵，氮源是一次性的添加到发酵罐中去的，这种操作是普遍的做法，而本发明在于改变了氮源的添加方式即在发酵过程中分批或者连续加入，而氮源添加方式改变之后带来的有益效果便是丁二酸的收率得到了提高，同时副产物产量又得到了减少，这效果是意想不到的，目前在产丁二酸的微生物发酵中也未出现这种操作方式。 另外本发明只针对产琥珀酸放线杆菌(actinobacillussuccinogenes)有有益效果，不适用于其他微生物发酵。通常的在微生物发酵过程中分批的或者连续加入碳源的方式比较多见，而这样的方式来添加氮源并不多见，并不是所有微生物发酵改变下氮源的添加方式就能使得主产物的收率提高同时副产物浓度又得到降低。
具体实施方式
用以下的实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的进一步说明，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖8，酵母粉3，nahco38，nah2po4·2h2o1，k2hpo4·3h2o2蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖70，酵母粉8，玉米浆干粉3，乙酸钠0.5，kh2po2，mgcl2·6h2o0.2，无水cacl20.2。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为2％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，39℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.2。
发酵培养基中的氮源以不同方式加入，所述的氮源为酵母粉与玉米浆干粉。在初糖为70g/l时，将氮源在发酵过程中以一定的流速加入到发酵罐中，选用碳酸钠作为ph调节剂，实验结果如下表所示：
表1氮源不同添加方式对发酵结果的影响
一次性加入即是在发酵开始前即将全部氮源加入发酵罐中。分批加入为在发酵进行至0h、10h、15h、20h、30h分别加入2g/l的氮源。
实施例2
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖12，酵母粉6，nahco311，nah2po4·2h2o3，k2hpo4·3h2o4蛋白胨3。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖80，酵母粉12，玉米浆6，乙酸钠1.5，kh2po4，mgcl2·6h2o0.4，无水cacl20.4。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为10％，(v/v)，搅拌转速为100rpm，35℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在7.0。
发酵培养基中的氮源以不同方式加入。在初糖为80g/l时，选用碳酸钠作为ph调节剂，实验结果如下表所示：
表2氮源不同添加方式对发酵结果的影响
一次性加入即是在发酵开始前即将全部氮源加入发酵罐中。分批加入为在发酵进行至0h、8h、14h、18h、30h分别加入2g/l的氮源。
实施例3
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖80，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为300rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
发酵培养基中的氮源以不同方式加入。在初糖为80g/l时，选用碳酸钠作为ph调节剂，实验结果如下表所示：
表3氮源不同添加方式对发酵结果的影响
一次性加入即是在发酵开始前即将全部氮源加入发酵罐中。分批加入为在发酵进行至0h、12h、16h、22h、30h分别加入2g/l的氮源。
实施例4
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖70，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
将发酵培养基中的10g/l的氮源酵母粉替换为10g/l安琪酵母粉，其余的按照实施例1的方法实施，实验结果如下表：
表4安琪酵母粉不同添加方式对发酵结果的影响
实施例5
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
将发酵培养基中的10g/l的氮源酵母粉替换为10g/l豆饼粉，另外加入5g/l的玉米浆干粉，将这两种氮源混合后，按照实施例1的方法实施，实验结果如下表
表5豆饼粉与玉米浆干粉的不同添加方式对发酵结果的影响
实施例6
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖70，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
将发酵培养基中的10g/l的氮源酵母粉替换为10g/l花生饼粉，另外加入5g/l的玉米浆干粉，将这两种氮源混合后，实验结果如下表
表6花生饼粉与玉米浆干粉的不同添加方式对发酵结果的影响
实施例7
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖70，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为200rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
将发酵培养基中的10g/l的氮源酵母粉替换为10g/l棉籽粉，另外加入5g/l的玉米浆干粉，将这两种氮源混合后，实验结果如下表
表7棉籽粉与玉米浆干粉的不同添加方式对发酵结果的影响
实施例8
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为 7％，(v/v)，搅拌转速为300rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
发酵培养基中的氮源以不同方式加入。在初糖为60g/l时，选用氨水作为ph调节剂，实验结果如下表所示：
表8氮源不同添加方式对发酵结果的影响
实施例9
发酵采用的菌种：产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenesnj113。
种子培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉5，nahco310，nah2po4·2h2o2，k2hpo4·3h2o3蛋白胨2。
发酵培养基(g/l)：葡萄糖60，酵母粉10，玉米浆5，乙酸钠1，kh2po3，mgcl2·6h2o0.3，无水cacl20.3。
发酵罐培养：将活化好的种子液和灭好的葡萄糖接入发酵罐中，接种量为7％，(v/v)，搅拌转速为300rpm，37℃发酵培养，co2通气量为0.1vvm，整个发酵过程中ph控制在6.8。
发酵培养基中的氮源以不同方式加入。在初糖为60g/l时，选用naoh作为ph调节剂，实验结果如下表所示：
表9氮源不同添加方式对发酵结果的影响