一种制备含有羟基的手性化合物的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备含有羟基的手性化合物的方法。

背景技术：

克唑替尼是辉瑞公司开发的用于治疗间变性淋巴瘤激酶(alk)阳性的局部晚期和转移的非小细胞肺癌(nsclc)，于2011年获得fda批准上市。克唑替尼的合成工艺中，合成前体为(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，该前体可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶(adh)手性催化还原制备。

由氧化还原酶催化的酮基的手性还原是获得含有羟基的手性化合物的重要方法。其中苯乙酮相关化合物的手性还原产物是多种药物的手性中间体。氧化还原酶广泛用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等，乙醇脱氢酶的催化反应需要还原型辅酶ⅱ的参与。一方面还原型辅酶的价格昂贵，且很不稳定，不可能作为大量制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的原料。另一方面，辅酶ⅱ的使用成本也大大高于辅酶ⅰ。

因此，本领域技术人员致力于开发催化效率高、生产成本低的含有羟基的手性化合物的制备方法，以便进行大规模生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备含有羟基的手性化合物的方法。

本发明的第一方面，提供了一种制备含有羟基的手性化合物的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供底物：

所述底物包括具有酮基的第一化合物，所述第一化合物的酮基经还原后形成所述含有羟基的手性化合物；

(2)提供催化体系：

所述催化体系包括乙醇脱氢酶(adh)、和葡萄糖脱氢酶(gdh)；和

(3)配制反应体系并进行催化反应：

所述反应体系包括步骤(1)中的底物和步骤(2)中的催化体系，使用步骤(2)的催化体系催化步骤(1)中的所述底物进行还原反应，从而制得所述含有羟基的手性化合物。

在另一优选例中，在适当条件下，所述第一化合物能够被乙醇脱氢酶催化生成相应的含有羟基的手性化合物。

在另一优选例中，所述含有羟基的手性化合物选自下组：(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇、叔丁基((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。

在另一优选例中，所述第一化合物选自下组：2,6-二氯-3-氟苯乙酮、(s)-叔 丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。

在另一优选例中，所述底物还包括葡萄糖。

在另一优选例中，所述底物中所述第一化合物和所述葡萄糖的质量比为1：1～1.4，优选为约1：1.2。

在另一优选例中，所述步骤(2)的所述催化体系的制备方法包括步骤：

在基因工程菌中共表达乙醇脱氢酶(adh)和葡萄糖脱氢酶(gdh)，从而制得所述催化体系。

在另一优选例中，所述基因工程菌为大肠杆菌。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述反应体系的制备方法包括步骤：

(2.1)构建基因工程菌株

所述基因工程菌株表达乙醇脱氢酶(adh)、和葡萄糖脱氢酶(gdh)；

(2.2)诱导表达

使用iptg诱导步骤(2.1)中的基因工程菌株表达乙醇脱氢酶(adh)、和葡萄糖脱氢酶(gdh)，iptg浓度为0.2mmol/l，诱导时间为添加iptg后12h，诱导温度为25℃。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，还包括步骤：

(2.3)收集步骤(2.2)中获得菌体，经细胞破碎后收集上清液从而制得得所述催化体系；或者直接使用所述菌体作为催化体系。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述反应体系中2,6-二氯-3-氟苯乙酮的重量含量为1％～10％，优选为5％～7％。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述反应体系的ph≤7.2，优选地ph为6.5～7.0，更优选地ph为7.0。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述催化反应的温度为25～35℃，优选为30℃。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述反应体系中还包括镁离子，优选地，镁离子浓度为1.5mm～2.5mm，更优选地镁离子浓度为2mm。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述催化反应的时间为16h～28h，优选地为24h。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的酶法合成。

图2显示了pet28a-gdh的酶切验证图，1：gdh的pcr扩增产物；2：dnamarker；3：pet28a-gdh的酶切条带；4：dnamarker。

图3显示了质粒pet28a-adh的酶切验证,1：pet28a-adh的酶切条带；2：dnamarker；

图4显示了质粒pet21a-adh的双酶切验证，1:dnamarker；2:ndei/xhoi双酶切验证质粒pet21a-adh。

图5显示了葡萄糖添加量对转化率的影响。

图6显示了mg²⁺对转化率的影响。

图7显示了转化产物的hplc检测，a：2,6-二氯-3-氟苯乙酮对照品；b：(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇对照品；c：初始转化反应液；d：转化24h反应液。

图8显示了洗脱液的tlc检测。

图9显示了两种表达方式转化的hplc图谱；1：两种酶分开表达后的转化液；2：共表达酶液的转化液

图10显示了((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的酶法合成；底物：(s)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯；产物：((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，实验结果表明，所述方法能够高效的对2,6-二氯-3-氟苯乙酮进行转化生成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是抗癌药物克唑替尼的手性合成前体，可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶催化还原制备，还原中所需的还原型辅酶ⅱ再生是该反应的技术瓶颈。本研究构建重组大肠杆菌e.colibl21-adh和e.colibl21-gdh，实现了葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的共表达，并进行偶联转化。结果表明，当在反应温度为30℃，ph值为7的条件下，(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产量达到最高，在投料量为7％时，该体系转化率为90.35％。

在本发明中，使用葡萄糖脱氢酶(gdh)催化还原型辅酶ii的再生，构建了双酶偶联体系，如图1所示，可以低成本的催化2,6-二氯-3-氟苯乙酮还原为(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。

乙醇脱氢酶(adh)

乙醇脱氢酶(adh))是一种含锌酶类，它能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。乙醇脱氢酶的分子由两个亚基组成，一个位于酶的活性中心，另一个起稳定四级结构的作用。

在本发明一个优选地实施方式中，所述乙醇脱氢酶为来源于高加索乳杆菌(lactobacilluskefir)的乙醇脱氢酶。

在本发明一个优选地实施方式中，所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如下：

adh(252aa)：(genbanknumber：ay267012)

mtdrlkgkvaivtggtlgiglaiadkfveegakvvitgrhadvgekaaksiggtdvirfvqhdasdeagwtklfdtteeafgpvttvvnnagiavsksvedttteewrkllsvnldgvffgtrlgiqrmknkglgasiinmssiegfvgdptlgaynaskgavrimsksaaldcalkdydvrvntvhpgyiktplvddlegaeemmsqrtktpmghigepndiawicvylasdeskfatgaefvvdggytaq(seqidno.2)

经优化的编码所述乙醇脱氢酶多核苷酸序列如下：

atgaccgaccgtctgaaaggtaaagttgctatcgttaccggtggtaccctgggtatcggtctggctatcgctgacaaattcgttgaagaaggtgctaaagttgttatcaccggtcgtcacgctgacgttggtgaaaaagctgctaaatctatcggtggtaccgacgttatccgtttcgttcagcacgacgcttctgacgaagctggttggaccaaactgttcgacaccaccgaagaagctttcggtccggttaccaccgttgttaacaacgctggtatcgctgtttctaaatctgttgaagacaccaccaccgaagaatggcgtaaactgctgtctgttaacctggacggtgttttcttcggtacccgtctgggtatccagcgtatgaaaaacaaaggtctgggtgcttctatcatcaacatgtcttctatcgaaggtttcgttggtgacccgaccctgggtgcttacaacgcttctaaaggtgctgttcgtatcatgtctaaatctgctgctctggactgcgctctgaaagactacgacgttcgtgttaacaccgttcacccgggttacatcaaaaccccgctggttgacgacctggaaggtgctgaagaaatgatgtctcagcgtaccaaaaccccgatgggtcacatcggtgaaccgaacgacatcgcttggatctgcgtttacctggcttctgacgaatctaaattcgctaccggtgctgaattcgttgttgacggtggttacaccgctcag(seqidno.1)

葡萄糖脱氢酶(gdh)

在本发明一个优选地实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶(gdh)为来源于芽孢杆菌(bacillus)的葡萄糖脱氢酶(gdh)。

在本发明一个优选地实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如下：

gdh(261aa)：(genbanknumber：j04805.1)

mykdlegkvvvitgsstglgksmairfatekakvvvnyrskedeansvleeikkvggeaiavkgdvtvesdvinlvqsaikefgkldvminnaglenpvsshemslsdwnkvidtnltgaflgsreaikyfvendikgtvinmssvhekipwplfvhyaaskggmklmtetlaleyapkgirvnnigpgaintpinaekfadpeqradvesmipmgyigepeeiaavaawlasseasyvtgitlfadggmtqypsfqagrg(seqidno.4)

经优化的编码所述葡萄糖脱氢酶多核苷酸序列如下：

atgtacaaagacctggaaggtaaagttgttgttatcaccggttcttctaccggtctgggtaaatctatggctatccgtttcgctaccgaaaaagctaaagttgttgttaactaccgttctaaagaagacgaagctaactctgttctggaagaaatcaaaaaagttggtggtgaagctatcgctgttaaaggtgacgttaccgttgaatctgacgttatcaacctggttcagtctgctatcaaagaattcggtaaactggacgttatgatcaacaacgctggtctggaaaacccggtttcttctcacgaaatgtctctgtctgactggaacaaagttatcgacaccaacctgaccggtgctttcctgggttctcgtgaagctatcaaatacttcgttgaaaacgacatcaaaggtaccgttatcaacatgtcttctgttcacgaaaaaatcccgtggccgctgttcgttcactacgctgcttctaaaggtggtatgaaactgatgaccgaaaccctggctctggaatacgctccgaaaggtatccgtgttaacaacatcggtccgggtgctatcaacaccccgatcaacgctgaaaaattcgctgacccggaacagcgtgctgacgttgaatctatgatcccgatgggttacatcggtgaaccggaagaaatcgctgctgttgctgcttggctggcttcttctgaagcttcttacgttaccggtatcaccctgt tcgctgacggtggtatgacccagtacccgtctttccaggctggtcgtggt(seqidno.1)

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的制备制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的方法，转化率高，且无需使用辅酶ⅱ，制备成本低；

(2)本发明采用生物催化的方法，环境友好，条件温和，工艺稳定；

(3)采用本发明的共表达菌株构建的反应体系，在优化的酶表达条件下和优化的反应条件下，转化率能够达到90％以上，且产物单一，非常易于纯化。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1葡萄糖脱氢酶与乙醇脱氢酶重组菌株的构建

将来源于高加索乳杆菌的乙醇脱氢酶基因adh进行密码子优化并人工合成基因。利用同样的方法将来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(gdh)基因进行密码子优化并人工合成基因。将基因adh和gdh分别与pet-28a连接，并各导入e.colibl21(de3)中，获得重组菌e.colibl21-adh和e.colibl21-gdh。将重组菌进行试表达，对产物adh和gdh进行sds-page验证。最后对其表达条件进行一系列优化。

实验材料

1实验仪器

表1-1实验仪器

2实验试剂

表1-2实验试剂

3菌株、质粒与培养基

e.colidh5、e.colibl21(de3)购自cicc23796，pet28a、pet21a购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

lb培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％氯化钠。在液体培养基的基础上添加1.5％琼脂粉即为固体培养基。

4主要溶液和缓冲液

(1)质粒抽提相关溶液：

solutionⅰ：0.2973g葡萄糖，0.091gtris，0.112gedta定容至30ml。

solutionⅱ(新鲜配置)：0.2mol/lnaoh，1％sds。

solutionⅲ：44.163g乙酸钾，17.25ml冰醋酸定容至150ml。

(2)50×tae(电泳缓冲液)(/l)：242gtris,57.1ml醋酸，100mledta(0.05mol/l)。

(3)蛋白质电泳相关溶液：

5×loadingbuffer：溴酚蓝50mg,1mtris-hcl(ph6.8),sds1.0g,5％(v/v)2-me，甘油5ml定容到10ml。

5×电泳缓冲液：0.125mtris，1.25mglycine，0.5％(w/v)sds,定容到1l。

染色液：125ml无水乙醇，80ml冰醋酸，g2500.625g加纯水定容至1l。

洗脱液：500ml无水酒精、160ml冰醋酸，加去离子水到2l。

实验方法

1大肠杆菌的培养与保藏

(1)菌种的培养

将大肠杆菌的甘油保存管从-20℃冰箱中的取出，接种于新鲜lb液体培养基，置于37℃，230r/min摇床中震荡培养(14-16h)，依据菌株的不同抗性，在培养基中添加相应的抗生素。

(2)菌种的保藏

配置50％的甘油溶液，在121℃条件下湿热灭菌20分钟。无菌超净工作台中，移液枪吸取大肠杆菌培养液与等体积的60％的甘油混匀，甘油终浓度为25％，放-20℃保藏。如需长期保存可制作冻干管。

2cacl2法制备大肠杆菌e.colidh5α和e.colibl21(de3)感受态细胞

(1)保存在-20℃的甘油管取出解冻，接种环蘸取少量菌液在固体lb培养基平板上划线，37℃恒温培养箱中倒置培养。

(2)无菌小枪头挑取单菌落放入5mllb液体培养基中，放入摇床震荡培养12-16个小时(37℃，230rpm/min)。

(3)按照1％的接种量吸取菌液接种到装有50mllb培养基的摇瓶中，200rpm/min，37℃条件下，培养至od600达到0.6左右。

(4)菌液转入50ml离心管中，放入冰水浴中冰浴半小时。

(5)离心管放入冷冻离心机，4000rpm/min，4℃离心5min，收集菌体。

(6)倾去上清，加入20ml预冷的0.1mol/lcacl2溶液，轻轻吹打使菌体重悬，冰水浴中放置半小时，4℃下4000rpm/min离心5min。

(7)倾去上清液，加入10ml预冷的0.1mol/lcacl2溶液，重悬菌体，即得感受态细胞悬液。

(8)悬液分装到1.5ml小离心管中，每管100μl，贮存在-70℃冰箱。

3转化大肠杆菌质粒

(1)新鲜制备的或从-70℃冰箱中取出的感受态细胞(100μl)，在室温下解冻，然后迅速放入冰水浴中。

(2)吸取1～2μl质粒加入到感受态细胞中，用移液枪轻柔吹打混匀，冰水浴中静置30min。

(3)将离心管放入42℃热水浴中热激整整90s，迅速转移到冰水浴中，放置2～5min。

(4)往转化后的离心管中加入300～500μl的lb液体培养基，吹打混匀后在37℃水浴中放置1h。

(5)将培养好的菌液均匀涂布于添加了相应抗生素的lb固体培养基平板上，倒置于37℃恒温培养箱中培养。

4碱裂解法抽提大肠杆菌质粒

(1)在超净台上，用灭菌的小枪头挑取单菌落放入5mllb液体培养基中(含50～100μg/ml的相应抗生素)，于37℃摇床中，220rpm/min的条件下培养过夜。

(2)1.5ml离心管中倒入约1.5ml菌液，用12000rpm/min的转速离心2min，弃去上清，离心管倒置于吸水纸上，使液体流尽。重复此操作一次。将菌体反复离心于同一ep管中。

(3)在菌体中加入100μl裂解液ⅰ，涡旋振荡使菌体彻底悬浮。

(4)加入200μl新鲜配置的裂解液ⅱ，轻轻颠倒离心管数次(勿涡旋振荡)，使其充分混匀，便于细胞裂解。

(5)迅速加入150μl预冷的裂解液ⅲ，温和反复颠倒离心管数次，室温下静置3-5min。在12000r/min转速下离心10min，将上清液移到另一新的离心管中。

(6)加入两倍体积的无水乙醇约合900μl，反复颠倒数次，室温放置10min。

(7)以12000r/min的转速离心5min，上清液去掉，再用70％的乙醇溶液洗涤一次。离心管敞口在空气中干燥，使乙醇完全挥发。

(8)每管加入30～40μl的无菌去离子水，溶解沉淀，保存于-20℃。

5pcr方法

由葡萄糖脱氢酶(gdh)基因序列及其前后序列设计引物。葡萄糖脱氢酶(gdh)上游引物为5’-aaacatatggttaccagccggatctcagt-3’；下游引物为5’-aaactcgaggaatagagaatcctttctct-3’。在上下游引物的5'端分别设计加入了ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点。以英潍捷基生物公司合成基因序列片段为dna模板，分别以上下游引物扩增得到gdh基因片段。pcr反应：见表1-3。

表1-3pcr程序

6目的dna片段的胶回收

(1)上样电泳后，从琼脂糖凝胶中切下含目标片段的胶块(胶块切得越小越好)，称重。

(2)按胶块重量加入3-6倍的溶胶液(bufferb2)，50℃水浴中保温5-10min，使胶充分溶解在溶胶液中。

(3)将溶胶液转移到吸附柱之中，9000rpm/min转速下离心30s。倒掉收集管中液体。

(4)加入500μl的洗脱液(washsolution)，10000rpm/min转速下离心30s，倒掉收集管中液体。重复洗脱一次。

(5)12000rpm/min转速下空柱离心1min。

(6)将吸附柱安置于一个干净的1.5ml的离心管中，待乙醇挥发后，于吸附膜中央加入30～50μl的双蒸水，室温静置1min，12000rpm/min转速下离心离心1min。(7)dna溶液可直接连接或保存于-20℃备用。

7核酸琼脂糖凝胶电泳

用稀释的电泳缓冲液(1×tea)为溶剂，加入琼脂糖，配制浓度为0.7％～0.8％琼脂糖凝胶。电泳电压设为120v，电泳时长一般为30min左右。电泳结束后，胶块从电泳槽中取出，放入溴化乙锭中浸泡10～15min，用生物电泳图像分析系 统进行拍照和照片保存。

8dna的酶切

按照dna特异性内切酶的使用说明进行操作。

表1-4双酶切体系

9dna片段的连接

(1)取已灭菌的1.5ml离心管，做好标记，按照下表配制连接体系。

(2)轻轻吹打混匀，用离心机瞬时离心，将管壁的液体全部甩到离心管底部。

(3)16℃过夜连接。

(4)连接产物用于感受态细胞转化。

表1-5连接体系

10葡萄糖脱氢酶重组质粒的构建

(1)用特异性内切酶ndeⅰ和xhoⅰ对pcr扩增得到的gdh基因片段进行双酶切，电泳跑胶，对目的片段切胶回收。

(2)选取pet28a作为载体，含有质粒pet28a的菌液经培养后对质粒进行抽提，并且用ndeⅰ和xhoⅰ进行双酶切，电泳验证，对大条带进行切胶回收，-20℃保存备用。

(3)葡萄糖脱氢酶基因片段与载体进行连接反应，连接体系参照表1-5，得到的质粒命名为pet28a-gdh。

(4)pet28a-gdh转化入e.colidh5α感受态细胞中，涂布卡纳抗性平板进行筛选，挑取单菌落提取质粒双酶切验证。

11乙醇脱氢酶重组质粒的构建

(1)从genbank上获取乙醇脱氢酶基因序列，委托英潍捷基生物公司合成基因序列片段(目的基因片段上含有ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点)。将公司提供的甘油菌活化培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，根据其多克隆位点，使用特异性内切酶ndeⅰ和xhoⅰ进行双酶切，电泳跑胶，对目的片段切胶回收。

(2)选取pet28a作为载体，含有质粒pet28a的菌液经培养后对质粒进行抽提，并且用ndeⅰ和xhoⅰ进行双酶切，电泳验证，对目的条带进行切胶回收。

(3)乙醇脱氢酶基因片段与载体进行连接反应，连接体系参考表1-5，得到的质粒命名为pet28a-adh。

(4)pet28a-adh转化入e.colidh5α感受态细胞中，涂布卡纳抗性平板进行筛选，挑取单菌落提取质粒双酶切验证。

12重组酶蛋白的试表达

(1)将pet28a-gdh和pet28a-adh分别导入e.colibl21(de3)，卡那抗性平板筛选得到gdh表达菌株e.colibl21-gdh和e.colibl21-adh。挑取单菌落接种到4ml新鲜lb培养基(含卡那霉素100μg/ml)，37℃摇床中过夜培养，转速220r/min。

(2)过夜培养的菌液以1％的接种量分别接种到2支3mllb培养基试管中(含卡那霉素100μg/ml)，37℃培养至对数生长期，od600在0.8左右，其中一支试管加入诱导剂iptg，其终浓度为1mmol/l，37℃，240r/min转速下培养3小时。离心收集菌体，sds-page对蛋白表达进行检测。

13蛋白表达条件的优化

外源基因的表达主要以两种形式存在，要么是包涵体的形式，要么是可溶性蛋白。选择pet作为表达载体是因为具有其表达水平高、低成本、简单的培养条件等优点，但其也容易形成包涵体，依据本实验要求，为简化后续实验操作，要求表达大量可溶性蛋白。在已经有表达的情况下，需对诱导温度、时间、iptg浓度等方面进行摸索和优化。

(1)诱导表达时长

虽然添加诱导剂之后，诱导时间越长，所表达的蛋白会越多，但过快过多的表达容易使蛋白形成包涵体，时间过长，细胞可能会自溶，产生蛋白酶，从而降解一部分目的蛋白。为确定表达时长，在加入诱导剂后，每隔两个小时取样，考察2-12h蛋白的可溶性表达。

(2)诱导温度的选择

大肠杆菌的最适生长温度为37℃左右，在较高的温度下，细菌的生长繁殖加快，蛋白表达量也会增加，表达过越容易形成包涵体，同时代谢副产物的积累会反过来又抑制菌体的生长和目的蛋白的表达。降低温度，蛋白的合成速率减缓。当细胞的生长速率低的时候，有利于蛋白质充分折叠；而更低的蛋白量也保证该蛋白在细胞内的折叠或减低对宿主的毒性。

本研究主要利用可溶性蛋白进行转化反应，为达到实验目的，分别在16℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下对蛋白的可溶性进行考察。

(3)iptg终浓度

bl21(de3)是一个lac表达系统，外源蛋白的高表达需要通过iptg进行诱导，但是iptg对大肠杆菌具有一定的毒性，浓度过高会杀死细胞，另外会增加外源蛋白表达速度，容易造成包涵体的形成，浓度太低，蛋白的表达量太少，本研究考察了iptg的终浓度在0.1-1.0mm之间时，目的蛋白可溶性表达的情况。

14葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶酶活的测定

辅酶nadph在340nm处有最大吸光值，还原型nadph被氧化成nadp⁺时，吸光值下降；同理，当氧化型nadp⁺被还原成nadph时，吸光值变大；因而可以通过辅酶的变化值计算出adh和gdh的酶活。

葡萄糖脱氢酶表达菌株加入iptg诱导之后，在4℃、4000r/min转速条件下离心15min，倾去上清液，收集菌体，菌体用0.1mol/l的三乙醇胺缓冲液(ph7.0)重悬，离心洗涤一次后，再用三乙醇胺缓冲液重悬细胞。在冰浴中对细胞进行超声破碎，超声条件为：超声2s，间隙3s，超声功率400w，超声时长10min，细胞超声后在4℃、4000r/min转速条件下离心15min，上清液即为葡萄糖脱氢酶粗酶液，测定粗酶液中葡萄糖脱氢酶的酶活。

酶反应体系包括0.1mol/l的三乙醇胺缓冲液(ph7.0)，2.0mmol/lnadp⁺，0.1mol/lc6h12o6，混合均匀后放30℃保温，加入一定量的gdh酶液后开始计时，在340nm处测定吸光值的上升。依据标准曲线计算反应生成nadph的量。一个酶活单位u定义为每分钟内产生1μmolnadph所需要的酶量。

乙醇脱氢酶的酶活：酶反应体系包括0.1mol/l的三乙醇胺缓冲液(ph7.0)，0.25mmol/lnadph，0.1mol/l2,6-二氯-3-氟苯乙酮，混合均匀后放30℃保温，加入一定量的adh酶液后开始计时，检测在340nm处测定吸光值的降低。依据标准曲线计算反应消耗nadph的量。酶活定义为每分钟内消耗1μmolnadph所需要的酶量为一个酶活单位u。

nadph标准曲线的测定：配制0.2至1.0mm浓度的nadph标准溶液，在340nm波长测吸光度，绘制标准曲线。

15蛋白质浓度的测定

蛋白质的浓度的测定采用bradford法，将待测样品与bradford溶液混合后放置5min。测定595nm波长下溶液的吸光度，每组样品测3个平行，取平均值作为样品的吸光度。根据标准曲线和样品的稀释倍数计算粗酶液中蛋白质的浓度。

16sds-page蛋白质电泳的检测

依照蛋白质大小配制不同浓度的sds-page

(1)样品制备

表达菌液经破碎后制备好粗酶液，沉淀用8mol/l的尿素处理。在粗酶液和沉淀中按比例加入5×loadingbuffer混匀，本实验制备样品100μl(20μl5×loadingbuffer，80μl样品)，在沸水中放置5～10min，取出冷却至室温。

(2)上样

上样前先将样品12000r/min转速下离心5min，取上清加样。用微量加样器吸取10μl样品，按照次序依次缓缓加入样品槽，最后加入蛋白质marker。

(3)电泳

加样完毕，先把电压调至90v，待样品进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到150v，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时停止电泳。

(4)染色

从电泳槽上卸下凝胶板，轻柔取出胶块，放入染色液中染色1h左右。

(5)脱色

倒掉染色液，加入脱色液，洗脱至蛋白条带清晰即可。脱色后拍照保存。

结果与讨论

1葡萄糖脱氢酶表达质粒的构建

以合成的基因序列片段为dna模板，分别以上下游引物扩增目的片段，图 2-3所示，获得一条dna条带，相对分子大小约为0.9kb，与预期大小相一致。

将构建好的质粒pet28a-gdh使用ndeⅰ/xhoⅰ双酶切验证，电泳酶切产物，图2所示，分别在5.3kb和0.8kb处出现条带，所有条带大小符合预期，表达质粒构建正确。将构建好的质粒pet28a-gdh进行dna序列比对，经测序后比对无突变。转化入e.colibl21(de3)，得到葡萄糖脱氢酶表达菌株e.colibl21-gdh，进行后续的蛋白表达。

2乙醇脱氢酶表达质粒的构建

将adh基因用核酸内切酶ndeⅰ和xhoⅰ从t载体上酶切回收，相对分子大小约为0.8kb，与理论值相符。将构建好的质粒pet28a-adh使用ndeⅰ/xhoⅰ双酶切验证，电泳酶切产物，图3所示，分别在5.3kb和0.8kb处出现条带，所有条带大小符合预期，表达质粒构建正确。将构建好的质粒pet28a-adh进行dna序列测序，测序后比对无误。

3重组酶蛋白e.colibl21-gdh表达条件的优化

(1)诱导时长的确定

对e.colibl21-gdh的培养温度进行了研究，培养条件为：在温度为20℃的条件下，培养至od600达到0.6后，加入诱导剂后，分别在2、4、6、8、10、12h取样，sds-page检测蛋白的可溶性表达。结果发现，加入诱导剂之后，随时间的增加，葡萄糖脱氢酶的表达量与时间增加成正比，到8h后，从条带上看，目的蛋白的表达量没有明显增加。选定8h作为最适的诱导时长。

(2)iptg诱导浓度的确定

培养至od600达到0.6后，设立6个iptg的诱导终浓度(0.1﹑0.2﹑0.4﹑0.6﹑0.8mmol/l和1.0mmol/l)。诱导表达8h后，取样进行sds-page电泳检测目的蛋白的可溶性表达。结果表明，iptg的终浓度在设定范围内的表达都保持很高，选择较低浓度的iptg进行诱导更有利于节约成本，选用终浓度0.1mm为最适的诱导剂量。

(3)诱导温度的确定

加入iptg后分别在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃下诱导8h。取样对gdh的上清和沉淀进行蛋白电泳，结果表明在20℃时可溶性表达最好，包涵体最少，因此20℃为适宜诱导温度。

4重组酶蛋白e.colibl21-adh表达条件的优化

(1)诱导时长的确定

加入诱导剂后，分别在2、4、6、8、10、12h取样，sds-page检测蛋白的可溶性表达。结果表明，加入诱导剂2h，目的蛋白有少量表达，2-10h之间乙醇脱氢酶的表达量随时间在增加，到10h后，依据条带判断表达量最多。选定10h作为最适的诱导时长。

(2)iptg诱导浓度的确定

结果表明，iptg的终浓度在0.1至1.0mm之间时，乙醇脱氢酶的表达都保持很高，选择较低浓度的iptg进行诱导更有利于节约成本，选用终浓度0.1mm为最适的诱导终浓度。

(3)诱导温度的确定

实验结果表明，加入iptg后分别在16℃，20℃，25℃，30℃，35℃下诱导，温度越高，可溶性表达越少，包涵体越多，说明adh适合在16℃进行可溶 性表达。

5e.colibl21-gdh与e.colibl21-adh蛋白质含量的测定

gdh粗酶液稀释10倍后进行蛋白浓度的测定，粗酶液与溶液混合在595nm波长下测得的平均吸光度为0.768，由标准曲线y＝4.2386x+0.3359和稀释倍数算得葡萄糖脱氢酶粗酶液的蛋白浓度为1.02mg/ml。

adh粗酶液稀释10倍后进行蛋白浓度的测定，粗酶液与溶液混合在595nm波长下测得的平均吸光度为0.878，由标准曲线y＝4.2386x+0.3359和稀释倍数算得葡萄糖脱氢酶粗酶液的蛋白浓度为1.28mg/ml。

6gdh和adh酶活的测定

依据方法13，根据反应液在340nm吸光值增量，并由标准曲线计算出nadph的浓度，最后算得gdh粗酶液的酶活为9.8u/ml，同时由蛋白浓度算得比活力为9.61u/mg。

依据方法13，根据反应液在340nm吸光值的下降，并由标准曲线计算出nadph的浓度，最后算得adh粗酶液的酶活为2.8u/ml，同时由蛋白浓度算得比活力为2.19u/mg。

小结

(1)用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切空质粒pet28a和gdh基因片段，分别回收5.3kb和0.8kb条带，载体连接目的片段构建重组质粒pet28a-gdh。在e.colidh5α中扩增重组质粒，试剂盒提取质粒并将其导入e.colibl21(de3)中，卡那抗性平板筛选最终得到gdh表达菌株e.colibl21-gdh。从genbank筛选到一段乙醇脱氢酶基因序列，交由生物公司合成基因序列。将乙醇脱氢酶基因序列连入pet28a，构建了乙醇脱氢酶表达质粒pet28a-adh。将pet28a-adh导入e.colibl21(de3)，卡那抗性平板筛选得到adh表达菌株e.colibl21-adh。

(2)经sds-page检测，在iptg诱导后，e.colibl21-gdh在约30kd处有明显的目的蛋白表达，e.colibl21-adh可以表达出分子量大约在29kd大小的重组目的蛋白。

(3)确定e.colibl21-gdh能够以可溶性的形式表达葡萄糖脱氢酶。从诱导温度、时间、iptg浓度对目的蛋白的表达条件进行了优化。在20℃，0.1mmol/l的iptg终浓度下表达8h，可实现gdh的最大可溶性表达。确定在16℃，0.1mmol/l的iptg终浓度下表达10h，e.colibl21-adh能够实现gdh的最大可溶性表达。

(4)通过对酶活的测定，测得乙醇脱氢酶的酶活为2.8u/ml，比活力为2.19u/mg，说明已经成功构建了乙醇脱氢酶工程菌。gdh粗酶液的酶活为9.8u/ml，比活力为9.61u/mg。

实施例2葡萄糖脱氢酶与乙醇脱氢酶共表达

高加索乳杆菌中含有乙醇脱氢酶，乙醇脱氢酶可以催化2,6-二氯-3-氟苯乙酮还原为(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，但是此不对称还原反应的过程需要还原型辅酶nadph提供还原氢。因此在利用克隆有乙醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌进行2,6-二氯-3-氟苯乙酮还原反应时，需要加入价格高昂的nadph或是提供高效表达的辅酶再生系统。葡萄糖脱氢酶能够催化葡萄糖生成葡萄糖 酸，同时将nad(p)⁺还原为nad(p)h。采用基因工程手段，将辅酶再生中关键酶gdh与乙醇脱氢酶adh进行偶联表达，在单细胞体系中进行催化的同时也提供内源性辅酶再生，这样就显著提高其催化效率与实际应用潜力。

本实施例将pet28a-gdh和pet21a-adh同时导入大肠杆菌bl21(de3)，获得重组菌e.colibl21-adh/gdh。对诱导时间、诱导温度等参数进行了研究及优化，实现了乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶比较高效的表达，为乙醇脱氢酶催化的还原体系提供了较好的nadph再生体系。

实验材料

1实验仪器

同实施例1

2实验试剂

同实施例1

3菌株、质粒与培养基

同实施例1

实验方法

1共表达重组菌株的构建

从genbank中查找得到乙醇脱氢酶(adh)的基因序列，基因序列片段由英潍捷基生物公司合成。使用ndei和xhoi对连接有adh基因片段的t载体进行特异性酶切并纯化回收，选择pet21a为载体质粒，在与目的片段相同的酶切位点进行双酶切和回收(体系如表2-1)。两者在16℃条件下连接过夜(体系如表2-2)，转入e.colidh5α。涂抗性平板(含amp100μg/ml)，从抗性平板上挑取单克隆接种4mllb液体培养基中(含amp100μg/ml)。采用试剂盒抽提质粒，挑取阳性质粒进行ndei和xhoi双酶切验证，验证得到质粒pet21a-adh。

将pet21a-adh和pet28a-gdh同时转到e.colibl21(de3)中，得到乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的共表达菌株e.colibl21-adh/gdh。

表2-1双酶切体系

表2-2连接体系

构建好的质粒pet21a-adh用ndeⅰ/xhoⅰ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为5.3kb和0.8kb的两个片段，与预期结果相符，如图4所示。

酶切得到乙醇脱氢酶基因片段，回收后将其与同样酶切回收后的pet21a相连，构建得到重组质粒pet21a-adh。将pet21a-adh和pet28a-gdh共同转入大肠杆菌bl21(de3)，得到乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶共表达菌e.colibl21-adh/gdh。

实施例3乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

在生物催化的体系中，酶需要在特定的条件才能发挥一定的活性。不同的菌体和底物浓度会影响酶催化的反应速率；反应体系中不同ph值不仅会影响酶蛋白分子的稳定性和构型，而且还会影响酶催化活性中心中的必需基团以及底物的相应的解离状态，从而影响酶的催化活性和立体选择性；反应过程中温度的高低也会直接影响酶蛋白的活性。因此，生物催化反应体系中的各个反应的条件会对酶的催化活性、反应速率，以及最终的产物得率和纯度产生显著的影响。

本实施例以双质粒共表达adh和gdh的重组菌e.colibl21-adh/gdh的粗酶液作为生物催化剂，催化底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮还原制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，并对催化反应中底物浓度、温度、ph值这几个反应条件进行优化和考察，从而进一步提高产物(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产率，并通过重组菌株的高密度发酵对反应体系进行了放大实验，能够为选择合适的生产工艺、反应过程的调控奠定基础。

实验材料

1实验仪器

表3-1实验仪器

2实验试剂

质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；dnamarker、蛋白质marker、氨苄霉素(amp)、卡那霉素(kan)和nadph均购自北京鼎国生物技术有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英国oxoid公司)；2,6-二氯-3-氟苯乙酮购自上海邦成化工有限公司；(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇购自韶远科技(上海)有限公司；其他试剂均购自国药试剂有限公司。

3实验方法

3.1双菌双酶催化制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

在最适条件下对gdh和adh进行大量的可溶性表达，收集菌体，用缓冲液重悬洗涤后离心，去掉上清，再用缓冲液重悬，在冰水浴中超声破菌，低温离心后的上清作为粗酶液用作转化反应

反应体系为40ml，包含葡萄糖，2,6-二氯-3-氟苯乙酮，硫酸镁，gdh和adh的粗酶液，由于gdh利用葡萄糖作为底物，它会将其氧化为葡萄糖酸，使得反应液的ph较低，所以本研究采用0.5mol/l的naoh和自动ph电位滴定仪来调节溶液的酸碱度。转化反应维持在恒定的温度中。

3.2共表达体系催化制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

培养上述制备的共表达菌株，经过大量的实验发现，iptg终浓度0.2mmol/l条件下，25℃诱导12h，酶活较高，经检测，adh酶活可达2.79u/ml，gdh酶活可达10.77u/ml。sds-page电泳分析表明重组蛋白乙醇脱氢酶表达量约占全菌胞内可溶性蛋白的40％，而葡萄糖脱氢酶表达量约占全细胞内可溶性蛋白的42％，实现了乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因的共表达。

将诱导表达的共表达菌液100ml在4℃，转速为3800r/min条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体，用适量的0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(ph＝7.0)洗涤。最后用0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(ph＝7.0)40ml重悬后超声破碎。细胞破碎液在4℃，转速为3700r/min条件下离心15min，收集上清液即为粗酶液。

在40ml重组菌e.colibl21-adh/gdh粗酶液中，加入2.8g葡萄糖，2.4g2,6-二氯-3-氟苯乙酮，置磁力搅拌器上，自动电位滴定仪调节ph稳定为7.0，30℃条件下反应一定时间，反应液加等体积乙酸乙酯萃取，离心取上清，分析底物及产物含量。

3.3反应条件对制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的影响

(1)反应温度对转化反应的影响

配制40ml的酶催化体系(ph7.0)，含葡萄糖3.3g，底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮2.8g，硫酸镁终浓度2mm。尝试将反应在不同温度下进行。反应温度分别设为20℃﹑25℃﹑30℃﹑35℃﹑40℃，转化时间24h，反应液用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择当产物的转化率最大值为指标，来确定最佳温度。

(2)ph对转化反应的影响

ph可以影响酶蛋白的结构、酶的活性部位的解离状态、辅酶的解离以及底物分子的解离，从而影响酶与底物的结合以及对底物的催化效力。

配制40ml的酶催化体系，含葡萄糖3.3g，底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮2.8g，硫酸镁终浓度2mm，调节反应液的ph分别为5.0﹑6.0﹑7.0﹑8.0﹑9.0。30℃转化反应持续24h，反应液用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择当产物的转化率最大值为指标，来确定最佳ph。

(3)底物投料量对转化反应的影响

底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮是一种有机试剂，投料量太少，达不到量的需求，投料量过多，则会限抑制酶的活性，也会对酶产生毒害作用，从而使转化率降低。

配制40ml的酶催化体系(ph7.0)，含葡萄糖为1.2倍的底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮，硫酸镁终浓度2mm，2,6-二氯-3-氟苯乙酮(0.4g，1.2g，2.0g，2.8g)。30℃转化反应持续24h，反应液用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择当产物的转化率最大值为指标，来确定最佳底物投料量。

(4)葡萄糖对转化反应的影响

配制40ml的酶催化体系(ph7.0)，葡萄糖的量为0.8，1.0，1.2，1.5倍的底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮，硫酸镁终浓度2mm，2,6-二氯-3-氟苯乙酮2.8g。30℃转化反应持续24h，反应液用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择当产物的转化率最大值为指标，来确定最佳葡萄糖投料量。

(5)镁离子对转化反应的影响

配制40ml的酶催化体系(ph7.0)，含葡萄糖3.3g，硫酸镁终浓度(1mm，1.5mm，2mm，2.5mm)，2,6-二氯-3-氟苯乙酮2.8g。30℃转化反应持续24h，反应液用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择当产物的转化率最大值为指标，来确定最佳镁离子浓度。

(6)反应时间对转化反应的影响

配制40ml的酶催化体系(ph7.0)，含葡萄糖3.3g，硫酸镁终浓度2mm，2,6-二氯-3-氟苯乙酮2.8g。30℃转化反应每隔4h取样，样品用乙酸乙酯萃取后，取有机相用hplc检测产物的含量。选择产物的转化率和反应时间比为指标，来确定最佳反应时间。

3.4转化产物的分离纯化

tlc展开系统：把石油醚、乙酸乙酯按9:1(体积比)的比例混合摇匀。取2μl2,6-二氯-3-氟苯乙酮溶于1ml乙酸乙酯作为对照，转化液用乙酸乙酯萃取，12000rpm/min离心5min，取上层有机相作为样品。用毛细管蘸取对照与样品分别点样在薄层板上。点样量约10μl，分次滴加，使点样扩散后其直径 不超过2mm。点样过程中用吹风机使样品干燥。将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中，用配置的展开剂，采用倾斜上行法，将薄层板的下端浸在展开剂中0.3～0.5cm，至展开剂距离薄层板的上端约1cm左右时取出，画出展开剂的前沿线，挥发干展开剂后在紫外下显色。

将转化液装入分液漏斗，加入等体积的乙酸乙酯振荡，将分液漏斗静置，使其分层。取上层有机相，3700r/min转速下离心10min，使有机相与水相充分分离，收集有机相。对萃余液进行反复萃取和离心。将所有获得有机相用减压旋转蒸发仪把液体旋干。产物以油状出现在旋转瓶底部，收集产物，采用硅胶柱层析来分离2,6-二氯-3-氟苯乙醇。

用硅胶为固定相，用不同比例的乙酸乙酯和石油醚梯度洗。称取200～300目硅胶，加入石油醚并充分搅拌。往洗脱柱加入约三分之一体积的石油醚，将匀浆缓缓倒入柱内，打开活塞，让硅胶自然沉降压实，再用石油醚冲洗几个柱体积后开始上样。先用石油醚冲洗2个柱体积，接着用石油醚：乙酸乙酯(95:5)洗脱，最后用石油醚：乙酸乙酯(90:10)冲洗。低速洗脱，洗脱液用小瓶收集，用tlc初步检测。

3.5转化产物的分析

转化液加乙酸乙酯萃取，12000r/min离心5min，收集上层有机相，减压浓缩后，上硅胶层析柱，用不同比例乙酸乙酯石油醚梯度洗脱，获得少许纯样品。样品用质谱和hplc分析。hplc检测条件：色谱柱：agilentc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，检测波长254nm，流动相为甲醇：水(75:25)流速：1ml/min，柱温：30℃。产物对映体过量值(ee)的测定使用手性色谱柱，分析条件为：welchamy-drcolumn(4.6×150mm，5μm)，流动相为乙腈：水(50:50)，流速0.8ml/min，柱温25℃，检测波长254nm。e.e值＝[a(s)-产物-(r)-产物]/[a(s)-产物+(r)-产物]×100％。a(s)-产物和a(r)-产物分别代表反应后(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(r)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的峰面积。

3.6转化产物含量的测定

称取(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇10mg，加1ml甲醇充分溶解。梯度稀释，最后配制0.625、1.25、2.5、5和10mg/ml的标准溶液。在方法3.5色谱条件下对上述已配制好的标准溶液进行测定。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得线性回归方程y＝457.56x+71.542(r²＝0.9999)

由标准曲线可算得转化液中，产物的含量。摩尔产率＝m产/m底×100％；其中m产和m底分别代表底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮的初始浓度和反应后(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的浓度(mol)。

3.7重组菌在发酵罐中的扩大培养

(1)菌株保存

菌株采用甘油冷冻法保存，条件为零下20℃，可保存半年，甘油浓度为20％，甘油管中培养基为lb。

(2)种子活化

平板划线法：蘸取甘油管菌液1～2环涂于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨苄青霉素的lb平板培养基中，37℃培养11-14h。平板活化后可在4℃冰箱存放一星期。

(3)一级种子

用接种环取平板上1环菌落接种于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨苄青霉素的lb培养基摇瓶中，培养条件为：转速180-220r/min，温度35℃，时间为13-16h。

(4)二级种子

将达到要求的一级种子按1％的接种量接种到含新鲜lb的摇瓶中(200ml/750ml)，培养条件为转速240rpm/min，温度37℃，培养至od600达到3-5，(培养时间约为3h)，取样革兰氏染色后油镜检测未染菌，肉眼观察无明显细胞碎片和无明显起泡现象，准备转移发酵。

(5)培养基配制

发酵培养基配制：按表3-1发酵配方称量培养基物料，自来水充分溶解，转移至发酵罐中，加自来水定容，氢氧化钠调节ph至7.2，121℃实罐灭菌30min。

补料培养基配制：按表3-1补料培养基配方称量物料于补料瓶中，物料称料后用自来水补足体积，溶解并混合均匀，121℃条件下湿热灭菌30min。

表3-1培养基配方

(6)ph电极及溶氧(do)电极的校准

灭菌前用饱和亚硫酸钠溶液对溶氧电极进行零点校正，ph电极用电极标准液校正。培养基灭菌后调整温度为37℃，通气与搅拌调整适宜，待溶氧稳定后校正为100％。

(7)接种

发酵罐调整至条件为温度37℃，通气，转速100r/min，将达到要求的二级种子接种于发酵罐中。接种体积约200ml，接种量约7％。二级种子制备与发酵罐准备工作同步进行。

(8)发酵控制

初始培养温度37℃，转速100r/min，适当调整通气，初始阶段菌体生长较为缓慢，随着发酵的进行，菌体密度不断增加，耗氧量增加，使得发酵罐中 的do值下降，需不断挺高通气量。菌体密度的增加，单单调节通气量已近不能满足细胞对氧气的需求，不断提高转速，以维持do在20％～30％。当细菌生长到对数生长期时，od600达到30左右时，加入iptg至终浓度0.2mm，开始诱导培养，诱导培养的温度稳定在25℃。发酵一段时间后，培养基中碳源消耗完毕，溶氧突然猛升，开始流加补料培养基，以溶氧来决定流加速度。菌体生长过程中ph会下降，用氨水调节ph恒定在7。每隔2h取样测菌体浓度。当od600达到80时即可终止发酵。4℃离心收集菌体(9000rpm，5min)，用tea缓冲液洗涤一次，备用。

3.8共表达转化体系的放大

为了进一步验证乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的可行性，尝试将反应体系放大到2l，反应直接在7l发酵罐中进行。取1l发酵液在4℃、9900r/min转速下离心5min，用tea缓冲液洗涤一次，再次用缓冲液使菌体重悬，重悬后的体积为2l。往菌液里加入160g2，6-二氯-3-氟苯乙酮，192g葡萄糖，硫酸镁终浓度2mm。反应温度30℃，转速330r/min，ph7。

结果与讨论

1底物投料量对转化率的影响

实验结果表明，随着底物投料量的增加，转换率呈现一个下降的趋势。当只添加0.4g底物时，经过24h的反应，摩尔转化率达到99.7％，而当底物增加到2.8g是，转化率在约90％。这可能是由于酶的活性中心被过高的底物浓度饱和，从而造成催化效率下降，所以确立以2.8g作为本体系的最大投料量。

2ph对转化率的影响

底物分子中某些基团只在特定的ph条件下才解离出与酶结合发生反应的适合状态。实验结果表明，当反应体系的ph值为7.0时，摩尔转化率达到最大(90.35％)；而当ph值小于或者大于7.0，产物的产率迅速下降，说明此时酶已有失活现象产生，没有足够的能力完成转化反应，因此确立反应的最适ph值为6.5～7.0。

3温度对转化率的影响

实验结果表明，30℃时，摩尔转化率达到最大。但是温度在20-40℃的范围内，转化率没有很大的差异，说明酶催化体系在这个温度范围内比较稳定，最后还是选择转化率最高的30℃为最佳的反应温度。

4葡萄糖添加量对转化率的影响

在整个转化反应过程中，葡萄糖作为辅助底物参与反应，添加适量的葡萄糖就能使辅酶进行循环再生，添加不同葡萄糖的量对转化反应的影响如图5所示，葡萄糖的量为1.2倍(质量比)的底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮时转化率最高，转化率随着添加量的增加而增加。当葡萄糖的量超过1.2倍底物量后转化率基本不变，因此葡萄糖添加量为底物添加量的1.2倍。

5硫酸镁添加量对转化率的影响

镁离子对酶活有促进作用，不同镁离子浓度对转化反应的影响如图6所示，从图中结果可以看出，不加镁离子时，转化率只有80％，随着镁离子浓度的不断提高，转化率也在不断增加。镁离子浓度达到2mm之后，转化率没什么变化， 最后选择2mm这个浓度为最适镁离子浓度。

6反应时间对转化率的影响

通过考察不同反应时间断转化率的变化值，有利于掌握反应过程中转化的变化和反应的停止。实验结果表明，转化率在4-16h这个时间段增长较快，16h后趋于平缓，24h后增长及其小。最后确立24h终止反应。

7转化产物的检测

最佳转化条件下的反应体系经过24h的反应，转化液(反应前后)取样经过乙酸乙酯萃取后进行hplc检测，并与对照品比较(图7)。结果表明，24h反应终止时，投料量2.8g，底物转化较为彻底，摩尔转化率为90.35％。

样品经过硅胶柱层析，对收集的洗脱液进行tlc检测，收集浓度最高的洗脱液(如图8红色圈内部分)进行减压浓缩，送质谱检测中心检测。产物的质谱数据，esi-ms(m/z)：210[m+h]⁺与(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的分子量一致。手性色谱柱分析表明产物的(s)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的ee值达到99％，催化酶对底物特异性较好，所转化出的产物具有比较高的光学纯度。

8两种转化方式的比较

本研究采用了不同表达方法产生的酶对底物进行转换，第一种是分别表达乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，然后将两种酶混合进行反应；另一种就是采用两种酶共表达的方式进行酶催化。结果表明(图9)，在相同的转化条件下，共表达的酶对底物的转化较为彻底，转化率为96.7％，而分开表达的酶的转化率为88.6％。

结论

(1)分别利用分开表达和共表达两种方式对底物进行转化，结果分开表达的酶的转化率显著低于共表达酶的转化率，最终选择共表达重组菌进行转化反应。

(2)综合考虑了温度，底物投料量，ph，葡萄糖添加量，镁离子浓度，反应时间对转化率的影响，最终确立了反应的最适温度为30℃，反应ph为7，葡萄糖添加量为底物的1.2倍，镁离子终浓度2mm，底物最大投料量在2.8时，能使转换反应产生最大效益。

(3)采用硅胶柱柱层的方法，能够将底物，产物和杂质进行有效分离，对分离后的产物进行质谱和核磁鉴定都与对照品相符合。

(4)通过对共表达菌种的高密度发酵，获得了大量菌体，为转化体系的放大提供了条件。反应体系完成了从40ml到2l的放大实验，投料160g的转化率达到95％，这一结果具有较高价值，同时也体现了较好的应用前景。

实施例4乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备叔丁基((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯

叔丁基((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯是合成阿扎那韦的重要手性中间体。阿扎那韦是一个开链的氮杂拟肽化合物，是一种新型hiv-1蛋白酶抑制剂。相对于其它蛋白酶抑制剂，阿扎那韦具有两个显著优点：首先它是唯一准许一天服用一次的蛋白酶抑制剂，这将大大简化剂量疗程；其次，阿扎那韦还没有显示会增加病人的胆固醇和甘油三脂含量，而这是其他所有蛋 白酶抑制剂不同程度都会遇到的难题。

本实施例利用葡萄糖脱氢酶与乙醇脱氢酶偶联辅酶再生系统对阿扎那韦中间体进行制备。图10.显示了(2r,3s)-3-(叔丁氧羰基氨基)-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的酶法合成；底物：(s)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯；产物：叔丁基((2s,3r)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。

试验方法

培养上述制备的共表达菌株，将诱导表达的菌液在4℃，转速为3800r/min离心15min，弃去上清液，收集菌体，用适量的0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(ph＝7.0)洗涤。最后用0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(ph＝7.0)40ml重悬后超声破碎。细胞破碎液在4℃，转速为3700r/min条件下离心15min，收集上清液即为粗酶液。

在重组菌e.colibl21-adh/gdh粗酶液中，加入0.24g葡萄糖，0.2g(s)-4-氯-3-羰基-1-苯基丁烷-2-氨基甲酸，5％助溶剂(dmso，甲醇，甲苯)置磁力搅拌器上，自动电位滴定仪调节ph稳定为7.0，30℃条件下反应一定时间，反应液加等体积乙酸乙酯萃取，离心取上清，分析底物及产物含量。以产物的转化率为指标，选择其最大值时的助溶剂。

实验结果

由于底物不溶于水的特性，因而需要利用助溶剂的增溶作用来增加反应的产率。本研究考察的助溶剂分别为dmso、甲醇、甲苯，浓度同为5％(v/v)。不同的助溶剂对产物影响较大。在没有添加助溶剂的情况下几乎检测不到产物，添加助溶剂后产物的产率有了很明显的提高，其中甲苯的促进作用最大(61.2％)，甲醇的促进作用最小(23.5％)，因此，选择甲苯适宜作为助溶剂进行反应。转化产物的ee值达到99％。

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