本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到产朊假丝酵母生物催化制备医药中间体 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 的技术。
背景技术：
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的应用领域之一,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。
芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与CO2反应，反应压力高达10MPa，温度高达140-380℃，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应少，产率高。
本发明将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸： 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 。
技术实现要素：
本发明采用产朊假丝酵母催化制备 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应式如下：
底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 （1）经产朊假丝酵母催化反应，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 （2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用产朊假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，副产物极少，反应收率高。
许多假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用产朊假丝酵母菌株为DSM-70163，其催化反应效果最佳。
由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。大量实验表明，对于本反应，加入直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L是最佳的。
反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法：加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁；凝聚法：加入聚合氯化铝、明矾等；或者将上述2类混合加入；加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入2.5%D1氯化钙是最佳的。
羧化反应中，采用NaHCO3提供CO2,实际上，有多种物质可以提供CO2,但是，通过大量实验，结果表明，对于本发明，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3会使反应液的pH升高，而适宜的pH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处于适宜的pH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是适宜的方法，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物催化反应正常进行。
可以明显看出，本发明所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、CO2供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。
培养介质：
1、种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
2、培养液成份：葡萄糖20-22 g/L，麦芽浸膏23-25 g/L， (NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO4 9-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
微生物发酵液制备。产朊假丝酵母DSM-70163经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-30℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.8-1V/V•分钟，28-30℃培养49-53小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为80-90g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓冲液：甲醇=90:10。
生物催化反应：发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 ，使浓度为85-95 g/L，补加以下成份，使浓度为：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L；调节pH为5.5-5.8，搅拌使反应液乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应温度 32℃，反应时间为32-36小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH5.5-5.8，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应转化率97.5-99％，产品收率95.5-97％。
实施例1
培养液成份：葡萄糖20-22 g/L，麦芽浸膏23-25 g/L， (NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO49-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
微生物发酵液制备。产朊假丝酵母DSM-70163经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-30℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.8-1V/V•分钟，28-30℃培养49-53小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为80-90g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
生物催化反应：15L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 ，使浓度为85-95 g/L，补加以下成份，使浓度为：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L；调节pH为5.5-5.8，搅拌使反应液乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应温度 32℃，反应时间为32-36小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH5.5-5.8，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应转化率97.5-99％，产品收率95.5-97％。
实施例2
培养液成份：葡萄糖20-22 g/L，麦芽浸膏23-25 g/L， (NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO49-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
微生物发酵液制备。产朊假丝酵母DSM-70163经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-30℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.8-1V/V•分钟，28-30℃培养49-53小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为80-90g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
生物催化反应：150L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 ，使浓度为85-95 g/L，补加以下成份，使浓度为：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L；调节pH为5.5-5.8，搅拌使反应液乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应温度 32℃，反应时间为32-36小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH5.5-5.8，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应转化率97.5％，产品收率95.5％。
实施例 3
培养液成份：葡萄糖20-22 g/L，麦芽浸膏23-25 g/L， (NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO49-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
微生物发酵液制备。产朊假丝酵母DSM-70163经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-30℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.8-1V/V•分钟，28-30℃培养49-53小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为80-90g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
生物催化反应：1000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 ，使浓度为85-95 g/L，补加以下成份，使浓度为：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L；调节pH为5.5-5.8，搅拌使反应液乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应温度 32℃，反应时间为32-36小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH5.5-5.8，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应转化率98％，产品收率96.5％。
实施例 4
培养液成份：葡萄糖20-22 g/L，麦芽浸膏23-25 g/L， (NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO49-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
微生物发酵液制备。产朊假丝酵母DSM-70163经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-30℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.8-1V/V•分钟，28-30℃培养49-53小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为80-90g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
生物催化反应：15000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物2-（3，4-2羟基-苯）-色烯-3，5，7-3醇 ，使浓度为85-95 g/L，补加以下成份，使浓度为：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为10-12g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L；调节pH为5.5-5.8，搅拌使反应液乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应温度 32℃，反应时间为32-36小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH5.5-5.8，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.6-0.7V/V•分钟,即每分钟通气量为0.6-0.7倍反应液体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃取液为乙酸乙酯，蒸出有机相的乙酸乙酯，得到产物 2，3-2羟基-5-（3，5，7-3羟基-色烯-2-基）-苯甲酸 ，反应转化率99％，产品收率97％。