一种发酵法制备神经酰胺的工艺的制作方法

本发明涉及一种神经酰胺的制备工艺，更具体地涉及一种发酵法制备神经酰胺的工艺。

背景技术：

随着科学技术的进步和生活水平的提高，人们期望获得具有广泛实际应用和产生巨大经济价值生物制剂产品。神经酰胺无疑满足了人们多种需求。

神经酰胺（ceramide）是由神经鞘氨醇（sphingosine）和长链脂肪酸缩合而成的酰胺，主要存在于角质层的细胞膜和细胞间基质中。神经酰胺最早是从动物的神经鞘中分离得到，由此而得名。在日化美容行业，神经酰胺能加强抗衰老功能，令肌肤保持弹性，光滑细致，减少面部皱纹形成。在医学方面，神经酰胺在多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中起重要信使作用，其介导细胞凋亡作用El日益受到关注；同时神经酰胺也参与细胞分化等多种生理及病理过程。

而现有的神经酰胺均是通过动植物分离得到的，且产量较低、经济成本高。随着疯牛病等动物性疾病的发生，动物源性神经酰胺的安全性受到了人们的质疑，同时工业上化学合成的神经酰胺的安全性也对人体有较大的危害。所以如果能找到一个高产神经酰胺且无毒的物种，将在工业化生产中带来巨大的经济效应。

技术实现要素：

我们在培养产紫青霉菌EFOZ-02时，研究发现在用发酵培养基培养得到的发酵液中检测出大量神经酰胺的存在，粗提纯后对其进行了定性分析和初步鉴定。经过高压液相和质谱检测，我们主要得到了神经酰胺Cer(d18:0/16:0)及其三种异构体：Cer(d18:0/18:0)、Cer (d18:1/20:0)、Cer(d18:0/20:0)，4-羟双氢（神经）鞘氨醇、二氢（神经）鞘氨醇和各类氨基酸。根据这一创造性的研究成果，我们开发出了本发明工艺。

本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种产量高、工艺简单、经济成本低、安全性高的发酵法制备神经酰胺的工艺。

为达到上述技术目的，本发明提供的一种发酵法制备神经酰胺的工艺，其特征在于包括如下步骤：

1）、将产紫青霉菌EFOZ-02的孢子用种子培养基培养，得到培养液；

2）、取步骤1）得到的所述培养液用发酵培养基培养，得到发酵液；

3）、过滤步骤2）得到的所述发酵液，进行固液分离，液体成分为液体Ⅰ；

4)、对步骤3）得到的所述液体I进行干燥，得干燥样；

5）、用甲醇溶解步骤4）得到的所述干燥样，得到液体Ⅱ；

6）、离心步骤5）得到的所述液体Ⅱ，去除沉淀糖和杂蛋白，得到液体Ⅲ；

7）、将步骤6）得到的所述液体Ⅲ进行过滤，滤液为液体Ⅳ；

8）、将步骤7）得到的液体Ⅳ通过高效液相色谱法分离收集得到神经酰胺样品；

9）、将步骤8）收集得到的神经酰胺样品干燥，得到神经酰胺；

其中，步骤1）中所述的种子培养基为察氏培养基，步骤2）中所述的发酵培养基为PDA培养基。

优选地，步骤1）的培养条件为28℃，160 r/min，培养3～4d。

优选地，步骤2）的培养条件为28℃，160 r/min，培养5～6d。

优选地，步骤3）的过滤方式为真空抽滤。

优选地，步骤4）的干燥方式为60℃真空干燥5小时。

优选地，步骤5）中所述甲醇的体积用量为步骤4）所述液体I体积的0.2倍。

优选地，步骤6）中所述的离心条件为12000 r/min，10 min。

优选地，步骤7）中所述的过滤方式为使用0.45微米的滤膜、针头式过滤器过滤。

优选地，步骤8）中所述的高效液相色谱法分离条件是：高压液相色谱，使用250 mm * 4.6mm，5 um C18反相柱，温度30℃；选择甲醇水系统，流速0.8 mL min⁻¹ ，进样量20uL，紫外检测器的检测波长为254nm；流动相用A相甲醇和B相超纯水进行梯度洗脱，设定程序为时间分别为0分钟、30分钟、35分钟，A相和B相的体积比相应地分别为60:40、100:0、100:0，收集保留时间为22.447min的样品。

优选地，步骤9）中的干燥为60℃、真空干燥。

本发明工艺的有益效果是：由于产紫青霉EFOZ-02能分泌大量神经酰胺类物质到发酵液中，故不需要任何衍生化过程，操作简单，提取方便；而微生物发酵周期短、见效快且不受地区气候限制；最重要的是在目前所报道的关于产紫青霉的研究里其代谢产物中并没有发现已知毒素的存在，保证了一定的安全性；并且利用本发明工艺生产神经酰胺，将大大降低经济成本，推动神经酰胺大规模工业化生产。

附图说明

图1为产紫青霉菌EFOZ-02在种子培养基培养菌落形态图；

图2为产紫青霉菌EFOZ-02在种子培养基培养菌落形态反向图；

图3 为产紫青霉菌EFOZ-02在发酵培养基培养菌落形态图；

图4为产紫青霉菌EFOZ-02在发酵培养基培养菌落形态反向图；

图5为产紫青霉菌EFOZ-02菌丝形态图（10x40）；

图6为产紫青霉菌EFOZ-02菌丝形态图（10x10）；

图7为产紫青霉菌EFOZ-02菌丝形态图（10x100）；

图8为产紫青霉菌EFOZ-02孢子形态图；

图9为基因组DNA序列分析图；

图10为硫酸铜与本发明工艺所制备产品显色反应结果图；

图11为本发明工艺所制备产品质谱分析图。

具体实施方式

现结合附图和实施例详细说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一 菌种分析、神经酰胺的制备及鉴定

1、产紫青霉菌EFOZ-02的形态观察和基因组DNA序列分析

（1）、产紫青霉菌EFOZ-02菌株的形态观察

菌株的形态观察如图1～8所示。

（2）、基因组DNA序列分析

基因组DNA序列分析如图9所示，由图9可知95区的产紫青霉ITS基因区域跟我们的菌株EFOZ-02相似程度最大，95是最接近我们的菌株。

2、神经酰胺的制备

（1）、培养基的制备

A、种子培养基（察氏培养基）

成分：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

配制方法：

①称量及溶化：量取所需水量约2/3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解，按每100 ml培养基加入1mL 0.1%的硫酸亚铁溶液；

②将剩余的水全部加入；

③分装、加塞、包扎；

④高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min。

B、发酵培养基（PDA培养基）

成分：土豆200g，蔗糖20g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾 3g，硫酸镁1g，水1000mL。

配制方法：

①称量及溶化：量取水100mL加入到烧杯中，分别称取蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钾 、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解。

②熬煮：称取去皮土豆，切成小块放入锅中，加水500ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃去，将（1）中溶液加入滤液中；

③将剩余的水全部加入；

④分装、加塞、包扎；

⑤高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min；

（2）、培养流程

①从试管斜面培养基用接种环蘸取少量产紫青霉菌EFOZ-02的孢子接种到100mL种子培养基中，28℃，160 r/min，培养3d，得到培养液；

②由种子培养基取900µL培养液接种到100mL发酵培养基中，28℃，160 r/min，培养5d，得到发酵液；

（3）、样品制备

①用真空抽滤装置和普通滤纸进行发酵液抽滤，进行固液分离，液体成分为液体Ⅰ；

②液体I在60℃真空干燥5小时，得干燥样；

③用20mL甲醇溶解干燥样，得到液体Ⅱ；

④12000 r/min离心液体Ⅱ10分钟，去除沉淀糖和杂蛋白，得到液体Ⅲ；

⑤使用0.45微米的滤膜、针头式过滤器过滤液体Ⅲ，滤液为液体Ⅳ；

（4）、HPLC分离

将液体Ⅳ通过高效液相色谱法分离收集得到神经酰胺样品，HPLC分离条件：高压液相色谱，使用C18反相柱(250 mm * 4.6mm，5 um)，温度30℃。我们选择最常见的甲醇水系统，流速0.8 mL min−1 ，进样量20uL，紫外检测器的检测波长为254nm。流动相用甲醇（A相）和超纯水（B相）进行梯度洗脱，设定程序为时间分别为0分钟、30分钟、35分钟，A相和B相的体积比相应地分别为60:40、100:0、100:0，收集保留时间为22.447min的样品。收集得到的样品在60℃下真空干燥，即得到产品神经酰胺，称重为85.099mg，纯度为96.3%。

3、神经酰胺的鉴定

（1）、显色反应的分析

硫酸铜与神经酰胺反应后，生成的大分子活性物质在高酸性和高温下的碳化反应，在薄层板上形成黑色物质。

硫酸-硫酸铜的显色剂的配置：取10g无水硫酸铜，用10%的磷酸溶液溶解后定容至100mL后备用。

本发明工艺所制备产品于硫酸铜-磷酸在薄板上形成黑色物质，显色情况如图10所示。

（2）、质谱分析

我们对得到的神经酰胺Cer(d18:0/16:0)进行质谱分析，结果如图11所示。由图11可知，神经酰胺Cer(d18:0/16:0)分子量为539.5365；并且，我们得到的神经酰胺Cer(d18:0/16:0)分子式为 C₃₄H₆₉NO₃。

实施例二 神经酰胺的制备

（1）、培养基的制备

A、种子培养基（察氏培养基）

成分：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

配制方法：

①称量及溶化：量取所需水量约2/3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解，按每100 ml培养基加入1mL 0.1%的硫酸亚铁溶液；

②将剩余的水全部加入；

③分装、加塞、包扎；

④高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min。

B、发酵培养基（PDA培养基）

成分：土豆200g，蔗糖20g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾 3g，硫酸镁1g，水1000mL。

配制方法：

①称量及溶化：量取水100mL加入到烧杯中，分别称取蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钾 、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解。

②熬煮：称取去皮土豆，切成小块放入锅中，加水500ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃去，将（1）中溶液加入滤液中；

③将剩余的水全部加入；

④分装、加塞、包扎；

⑤高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min；

（2）、培养流程

①从试管斜面培养基用接种环蘸取少量产紫青霉菌EFOZ-02的孢子接种到100mL种子培养基中，28℃，160 r/min，培养4d，得到培养液；

②由种子培养基取900µL培养液接种到100mL发酵培养基中，28℃，160 r/min，培养6d，得到发酵液；

（3）、样品制备

①用真空抽滤装置和普通滤纸进行发酵液抽滤，进行固液分离，液体成分为液体Ⅰ；

②液体I在60℃真空干燥5小时，得干燥样；

③用20mL甲醇溶解干燥样，得到液体Ⅱ；

④12000 r/min离心液体Ⅱ10分钟，去除沉淀糖和杂蛋白，得到液体Ⅲ；

⑤使用0.45微米的滤膜、针头式过滤器过滤液体Ⅲ，滤液为液体Ⅳ；

（4）、HPLC分离

将液体Ⅳ通过高效液相色谱法分离收集得到神经酰胺样品，HPLC分离条件：高压液相色谱，使用C18反相柱(250 mm * 4.6mm，5 um)，温度30℃。我们选择最常见的甲醇水系统，流速0.8 mL min−1 ，进样量20uL，紫外检测器的检测波长为254nm。流动相用甲醇（A相）和超纯水（B相）进行梯度洗脱，设定程序为时间分别为0分钟、30分钟、35分钟，A相和B相的体积比相应地分别为60:40、100:0、100:0，收集保留时间为22.447min的样品。收集得到的样品在60℃下真空干燥，即得到产品神经酰胺，称重为84.73mg，纯度为96.7%。

实施例三 神经酰胺的制备

（1）、培养基的制备

A、种子培养基（察氏培养基）

成分：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL。

 配制方法：

①称量及溶化：量取所需水量约2/3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解，按每100 ml培养基加入1mL 0.1%的硫酸亚铁溶液；

②将剩余的水全部加入；

③分装、加塞、包扎；

④高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min。

B、发酵培养基（PDA培养基）

成分：土豆200g，蔗糖20g，蛋白胨2g，磷酸氢二钾 3g，硫酸镁1g，水1000mL。

配制方法：

①称量及溶化：量取水100mL加入到烧杯中，分别称取蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钾 、硫酸镁，依次逐一加入水中溶解。

②熬煮：称取去皮土豆，切成小块放入锅中，加水500ml，在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃去，将（1）中溶液加入滤液中；

③将剩余的水全部加入；

④分装、加塞、包扎；

⑤高压蒸汽灭菌：100 Pa灭菌20 min；

（2）、培养流程

①从试管斜面培养基用接种环蘸取少量产紫青霉菌EFOZ-02的孢子接种到100mL种子培养基中，28℃，160 r/min，培养3.5d，得到培养液；

②由种子培养基取900µL培养液接种到100mL发酵培养基中，28℃，160 r/min，培养5d，得到发酵液；

（3）、样品制备

①用真空抽滤装置和普通滤纸进行发酵液抽滤，进行固液分离，液体成分为液体Ⅰ；

②液体I在60℃真空干燥5小时，得干燥样；

③用20mL甲醇溶解干燥样，得到液体Ⅱ；

④12000 r/min离心液体Ⅱ10分钟，去除沉淀糖和杂蛋白，得到液体Ⅲ；

⑤使用0.45微米的滤膜、针头式过滤器过滤液体Ⅲ，滤液为液体Ⅳ；

（4）、HPLC分离

将液体Ⅳ通过高效液相色谱法分离收集得到神经酰胺样品，HPLC分离条件：高压液相色谱，使用C18反相柱(250 mm * 4.6mm，5 um)，温度30℃。我们选择最常见的甲醇水系统，流速0.8 mL min−1 ，进样量20uL，紫外检测器的检测波长为254nm。流动相用甲醇（A相）和超纯水（B相）进行梯度洗脱，设定程序为时间分别为0分钟、30分钟、35分钟，A相和B相的体积比相应地分别为60:40、100:0、100:0，收集保留时间为22.447min的样品。收集得到的样品在60℃下真空干燥，即得到产品神经酰胺，称重为85.11mg，纯度为96.49%。