一种快速均一化或等比例DNA样本的方法与流程

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种快速均一化或等比例DNA样本的方法，适用于PCR、荧光定量PCR、测序、高通量测序仪等核酸检测。

背景技术：

基于DNA的检测，广泛应用于临床、科研、进出口检疫、食品安全、疾病控制等领域。在多种应用场景中，需要控制不同检测样本的起始样本量，以使不同样本检测处于同一水平或产生同样的数据，比如高通量测序。常规的均一化方法，通过吸光度值高低计算含有DNA量的高低，从而来吸取等量或等比例的样本，实现均一化的目的；也可以通过荧光定量PCR结果计算样本含有的模板数，再通过吸取等量或等比例的样本达到均一化的目的。然而通过吸光值的方法，会受其他同样吸收特定光谱如蛋白、各种类型核酸或各种杂质的影响；荧光定量PCR方法可以精准定量分子模板，但是费力费时费钱，还需要购置昂贵的荧光定量PCR仪器。

现有的均一化过程可以定义成定量-计算-吸取三个步骤。定量96个样本的操作时间由于各种仪器平台的不同，由几分钟到3个小时不等；计算环节，需要找到最低浓度的样本，以该样本为基准线计算具体的吸取样本量，需要耗时约1个小时；调整移液器，从每个样本中独立吸取相应计算量的样本，实现样本之间均一化，随后可以混合多个样本，也可以按照实际设计需要操作，此过程需要1个小时。因此按照现有的技术流程，整个均一化的过程需要5个小时时间。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种快速均一化或等比例DNA样本的方法

一种快速均一化或等比例DNA样本的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)在不同的待检DNA样本中引入含有生物素标记的核苷酸；

2)将步骤1所得标记生物素的DNA样本与包被有等量或等比例量链霉亲和素的材料结合；

3)清洗去除未能和链霉亲和素材料结合的DNA样本；

4)把与链霉亲和素结合的DNA洗脱下来。

DNA样本引入生物素标记的脱氧核苷酸，通过和等量的链霉亲和素包被的材料结合，过量的DNA被清洗掉，等量的DNA被从链霉亲和素材料上最终洗脱下来，用于后续的检测。

进一步地，步骤1在DNA样本中引入含有生物素标记的核苷酸的方法为：在DNA样本处理过程中或在DNA样本PCR环节加入含有生物素标记的一种或多种核苷酸，或将DNA样本与标记有生物素的通用DNA接头连接。

步骤2包被有等量或等比例的链霉亲和素的材料磁性颗粒、玻璃界面、移液器吸头、二氧化硅材料、微流体芯片或封闭管道。

步骤3用PBS、dH₂O或70％乙醇清洗去除未能和链霉亲和素材料结合的DNA样本。

步骤4洗脱下来的DNA适用于后续的PCR、荧光定量PCR、一代测序或高通量测序。

本发明的另一个目的是提供快速均一化或等比例DNA样本的试剂盒，帮助DNA样本实现快速均一化、等比例DNA样本的目的。所述试剂盒包括：生物素标记的脱氧核苷酸或生物素标记的DNA接头、链霉亲和素材料、Tris结合液、Tris清洗液、碱性洗脱液和中和液。

本发明创新性地在DNA样本处理过程中引入生物素标记的脱氧核苷酸，比如高通量测序文库构建的过程。处理完成后，待检样本中已经带有生物素标记的核苷酸，随后可以使用等量或等比例链霉亲和素包被的材料进行结合。链霉亲和素结合生物素的能力有限，每个链霉亲和素分子可以结合4个分子的生物素，但结合力极强。这样等量或等比例的链霉亲和素包被的材料就能吸附等量或等比例的DNA样本，剩余的不能结合的DNA被洗脱掉，从而达到快速实现样本之间均一化的目的，整个方法只有结合、清洗、洗脱步骤，96个样本的均一化可以在30分钟内完成。

因此本发明，针对需要做均一化或等比例化的DNA样本检测，通过引入生物素标记的脱氧核苷酸，利用链霉亲和素和生物素的结合能力，迅速实现样本之间的均一化，大大加快了检测流程，特别适用于高通量测序、PCR、荧光定量PCR、一代测序。

本发明具有以下技术特点：

1)快速：本发明可以在30分钟内，完成96个样本的均一化、等比例，手工操作时间少于5分钟。而常规的均一化、等比例过程，需要定量、计算、混合三个步骤，每一步都有多步试验操作，处理96个样本总耗时约5个小时，同时耗费大量的人工。

2)廉价：本发明不需要昂贵的设备，只需要用于链霉亲和素材料分离的介质，如果采用链霉亲和素磁珠，只需要磁力架即可。用于实现本发明目的的试剂，相对于荧光定量PCR试剂，也具有极高的性价比。

附图说明

图1所示是在DNA样本PCR环节引入生物素标记的流程图。

图2所示是将DNA样本与标记有生物素的通用DNA接头连接而引入生物素标记的流程图。

图3是标记了生物素的DNA和链霉亲和素磁珠结合、清洗掉过量的DNA，从而实现均一化或等比例化的流程图。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。

实施例1

本实施例用于说明本方法能快速均一化高通量测序文库。

1. 1ml孕妇血浆，经由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血浆游离DNA

2.加入2单位/ul末端补平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟，然后无需纯化，直接升温75℃变性末端补平酶。

3.直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成，此接头含有生物素标记。反应条件是25℃20分钟，纯化DNA，完成文库构建。

4.每个文库20ul加入等量的、不足量的链霉亲和素磁珠5ul(ThermoFisher)，室温混合5分钟。

5.用磁力架分离磁珠，去除上清，用PBS冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。

6. 3N NaOH 40ul加入磁珠混匀5分钟，用磁力架分离，取上清。

7.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即为均一化的文库。

8.文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。

实施例2

本实施例用于说明本方法能快速等比例高通量测序文库。

1. 1ml孕妇血浆，经由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血浆游离DNA

2.加入2单位/ul末端补平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris缓冲液组成，反应条件是37℃20分钟，然后无需纯化，直接升温75℃变性末端补平酶。

3.直接在试管中加入DNA连接试剂：100单位/ul的DNA连接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris缓冲液，30mM的二硫苏糖醇及DNA接头组成，此接头含有生物素标记。反应条件是25℃20分钟，纯化DNA，完成文库构建。

4.每个文库20ul加入等比例的、不足量的链霉亲和素磁珠(ThermoFisher)，室温混合5分钟。比如样本A加入5ul，样本B加入10ul，最终样本浓度样本B就比A高一倍。

5.用磁力架分离磁珠，去除上清，用PBS冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。

6. 3N NaOH 40ul加入磁珠混匀5分钟，用磁力架分离，取上清

7.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即为等比例的文库。

8.文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。

实施例3

本实施例用于说明本方法实现PCR产物的快速均一化。

1.PCR过程中加入含有一种或多种生物素标记的dNTP。

2.每个PCR产物20ul加入等量的、不足量的链霉亲和素磁珠5ul(ThermoFisher)，室温混合5分钟。

3.用磁力架分离磁珠，去除上清，用PBS冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。

4. 3N NaOH 40ul加入磁珠混匀5分钟，用磁力架分离，取上清。

5.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即为均一化的文库。

6.文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。

实施例4

本实施例用于说明本方法实现PCR产物的快速等比例。

1.PCR过程中加入含有一种或多种生物素标记的dNTP。

2.每个文库20ul加入等比例的、不足量的链霉亲和素磁珠(ThermoFisher)，室温混合5分钟。比如样本A加入5ul，样本B加入10ul，最终样本浓度样本B就比A高一倍。

3.用磁力架分离磁珠，去除上清，用PBS冲洗磁珠两次，用磁力架分离，并弃上清。

4. 3N NaOH 40ul加入磁珠混匀5分钟，用磁力架分离，取上清。

5.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即为等比例的文库。

文库可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq测序仪检测。