立达霉在草鱼体内的代谢物的制作方法

本发明涉及水产养殖技术领域，具体地说，是立达霉在草鱼体内的代谢物。

背景技术：

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。性活泼，游泳迅速，常成群觅食，为典型的草食性鱼类。草鱼幼鱼期则食幼虫，藻类等，草鱼也吃一些荤食，如蚯蚓，蜻蜓等，在干流或湖泊的深水处越冬。生殖季节亲鱼有溯游习性。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，为中国主要淡水鱼类养殖对象。

水霉菌(Saprolegnia)是淡水养殖水体中常见的真菌种类，几乎感染所有的淡水鱼类。孔雀石绿是防治鱼类寄生虫、真菌或细菌感染的特效药，但具有高毒性、高残留、致癌、致畸、致突变等毒副作用，已被列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。立达霉(也称作甲霜灵)是一种酰胺类杀菌剂，其性能较稳定，对pH范围(1.0-9.0)、高温度和强光具有耐受性，在防治水霉病方面具有良好的效果。

科技文献中有不少关于立达霉使用后再环境及动植物中残留消除规律的报道，例如，王锋等通过¹⁴C-甲霜灵研究了甲霜灵在黄瓜体内的传导规律；王化国等在田间生态箱中研究了¹⁴C-甲霜灵在土壤-烟草系统的迁移与归宿；Buser等研究表明立达霉在土壤中比较稳定；曹爱华等研究了精甲霜灵在鲜烟叶、土壤中的消除规律；任阿芳研究了甲霜灵在水稻上的残留动态及其光降解情况；胡娟研究了甲霜灵在水中的光化学降解规律。

专利文献中有不少关于立达霉残留的报道，例如，中国专利文献CN104535671A公开了一种茄子中甲霜灵残留的检测方法，中国专利文献CN105259351A公开了一种检测甲霜灵试纸，中国专利文献CN104391068A公开了一种测定烟草中常用杀菌剂(如甲霜灵等)残留量的方法，中国专利文献CN1959406A公开了一种甲霜灵等在蔬菜中残留的检测方法，但是关于本发明的立达霉在草鱼体内的代谢物目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供立达霉在草鱼体内的代谢物。

本发明的再一的目的是，提供立达霉的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：立达霉在草鱼体内的代谢物，所述的代谢物为N-(2-羧基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸、N-(2-羟甲基)-6-甲苯基-N-(羟乙酰基)丙氨酸、N-(2,6-二甲苯基)-N-(羟乙酰基)丙氨酸或N-(2-羟甲基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸甲酯。

所述的立达霉在草鱼体内的代谢物作为草鱼组织中立达霉残留检测标识物的用途。

所述的草鱼组织为草鱼肝脏组织。

所述的立达霉在草鱼体内的代谢物的HPLC分析方法，其特征在于，柱温30℃，流动相A为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为10％的甲醇甲醛溶液，洗脱梯度：0～0.5min，5％B；0.5～2min，5％～25％B；2～3min，25％～80％B；3～4min，80％～95％B；流速0.3mL/min^-1，进样量5μL。

所述的制备方法包括以下步骤：1)对草鱼进行立达霉给药；2)用甲醇提取草鱼肝脏组织，再用正己烷萃取甲醇提取液，然后浓缩甲醇提取液。

立达霉给药方式为口灌，口灌的给药量为200mg/kg。

立达霉给药方式为浸泡，立达霉浸泡浓度为9mg/L。

步骤2)为：称取5g草鱼肝脏组织于离心管中，加入20mL甲醇，漩涡振荡5min，8000r/min离心10min，取上清；用20mL甲醇溶解沉淀，漩涡振荡5min，8000r/min离心10min，合并上清；合并的上清液加入40mL正己烷，漩涡振荡后，静置10min，取下层清液，30℃于旋转蒸发仪上蒸发至近干。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：立达霉作为草鱼组织中立达霉残留检测标识物的用途。

所述的草鱼组织为草鱼肝脏组织。

本发明优点在于：

1、本发明对草鱼口灌或浸泡立达霉，首次发现在口灌组和浸泡组中，肝脏组织中的立达霉以原型药为主，并发现了4种立达霉在草鱼体内的代谢物：N-(2-羧基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸、N-(2-羟甲基)-6-甲苯基-N-(羟乙酰基)丙氨酸、N-(2,6-二甲苯基)-N-(羟乙酰基)丙氨酸、N-(2-羟甲基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸甲酯。

2、本发明的实验方法为：将实验用健康草鱼随机分组，且每组各120尾，鱼体规格为250±10g，在给药前采集空白肝脏组织，口灌组以200mg/kg的剂量进行口灌，口灌后在不同时间点取草鱼肝脏组织；浸泡组以9mg/L的浓度进行浸泡，浸泡后在不同时间点取草鱼肝脏组织。所取组织放入-20℃冷冻保藏至样品处理；采用甲醇作为提取剂，正己烷去脂，30℃旋转浓缩蒸发的前处理方法，采用髙效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法，采用反相C18色谱柱，柱温30℃，0.1％(V/V)甲酸溶液-10％(V/V)甲醇甲醛溶液为流动相二元梯度洗脱，流速为0.3mL/min，进样体积5μL，280nm波长下紫外检测，可实现立达霉鱼体内主要代谢产物的有效分离；串联质谱联用(MS/MS)技术进行检测，对产物进行准确定性分析。检测肝脏组织中原型药含量及代谢产物的种类，检测立达霉在草鱼肝脏组织中的代谢机制。

附图说明

附图1：立达霉及其代谢产物的色谱图。

附图2：立达霉及其代谢产物的选择离子流色谱图。

附图3：立达霉及其代谢产物的质谱图。

附图4：立达霉及其代谢产物的同位素丰度匹配。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1材料与方法

1.1试验时间和地点

2010年3月至2010年8月，上海市浦东新区临港新城沪城环路999号上海海洋大学。

1.2试验药品、试验鱼和养殖条件

试验用立达霉原料药，由长沙拜特生物科技研究所有限公司提供。

立达霉对照品：购自北京世纪奥科生物技术有限公司，德国Dr.Ehrenstorfer，CAS编号57837-19-1(Water Content0.1％,Det.Purity99.0％,Tolerance/Uncertainty+/-0.5％,Determined by Karl-Fischer Titration)。

健康草鱼均来购自上海浦东孙农水产养殖场，各1000尾，草鱼体重为(250±10)g，放置于高锰酸钾消毒后的水族箱(100cm×80cm×50cm)中饲养5天，实验用水为充分曝气后的自来水，充气泵持续进行充氧，剔除掉死亡和不健康的鱼。试验期间，使用加热棒进行控温，水温为25℃。

1.3实验方法

1.3.1给药方式

口灌，立达霉浓度为200mg/kg。

浸泡，立达霉浸泡浓度9mg/L。

1.3.2HPLC参数

柱温30℃，流动相为0.1％的甲酸水溶液(A)和10％(V/V)甲醇甲醛溶液(B)，洗脱梯度如下，0～0.5min，5％B；0.5～2min，5％～25％B；2～3min，25％～80％B；3～4min，80％～95％B。流速0.3mL/min^-1，进样量5μL。

1.3.3质谱参数

离子源为电喷雾电离源，采用正离子检测模式，干燥气体：N₂，温度为350℃，流速为10L/min；雾化气体：N₂，雾化器压力为2.8×10⁵Pa；鞘气气体：N₂，温度为360℃，流速为12L/min；毛细管电压为4000V，喷嘴电压为0V。

1.3.4样品前处理

准确称取5g肝脏组织于离心管中，加入20mL甲醇，漩涡振荡5min，8000r/min离心10min，取上清。用20mL甲醇溶解沉淀，漩涡振荡5min，8000r/min离心10min，合并上清。合并的上清液加入40mL正己烷，漩涡振荡后，静置10min，取下层清液，30℃于旋转蒸发仪上蒸发至近干，加1mL流动相充分溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，上机测定。

1.3.5代谢产物分析

称取5g肝脏组织，分别按样品处理方法处理后进样分析。给药组及空白组样品均分别在正、负离子下采用一级扫描(m/z100～1000)获得总离子流图。比较给药组及空白组总离子流图，鉴别出代谢产物色谱峰及其准分子离子。分别对其准分子离子进行二级质谱碎裂，获得二级质谱图。结合其准分子离子信息、二级离子碎片信息以及原形化合物结构，对代谢产物结构进行分析。

2结果

2.1草鱼体内立达霉代谢产物的HPLC-MS/MS定性分析

在给药后的草鱼血浆中共发现了7个具有给药依赖性的色谱峰，其中选择测定的标记为(M0～M4)。血样样品中立达霉及其代谢产物的色谱图见图1。从色谱图上可以看出，原药M0在鱼体内被分解代谢所占比例较低，产生的6种主要代谢产物中M3的响应相对较高，提示生成M3的通路可能是立达霉代谢的重要途径。

实施例2

2.1.1原形M0的HPLC-MS/MS分析

M0的色谱保留时间为9.6min，其色谱行为、准分子离子质荷比以及碎片离子均与立达霉对照品一致，据此确定M0为立达霉原形。

2.1.2代谢物M3的HPLC-MS/MS分析

M3的色谱保留时间为8.4min，在血样一级正离子全扫描质谱中观察到其准分子离子m/z252.1230。进一步的二级质谱碎裂模式中，观察到碎片离子m/z252.1220较立达霉准分子离子少28，推测其为立达霉的双脱甲基产物。因此推测M3为立达霉经过双脱甲基代谢产物，为N-(2-carboxy-6-methylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alanine，中文名为N-(2-羧基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸。

2.1.3代谢物M4的HPLC-MS/MS分析

M4的色谱保留时间为9.0min，在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z266.1389。在准分子离子的二级全扫描质谱中准分子量为m/z266.13404。由于M2较立达霉准分子量质量少14，推测其为立达霉的单脱甲基产物，应为N-(2-hydroxymethyl)-6-methylphenyl-N-(hydroxyacetyl)alanine，中文名为N-(2-羟甲基)-6-甲苯基-N-(羟乙酰基)丙氨酸。

2.1.4代谢物M1的HPLC-MS/MS分析

M1的色谱保留时间为7.1min，在一级负离子全扫描质谱中观察到其准分子离子为m/z472.1806。二级全扫描质谱中观察到m/z472.1802的碎片离子，经分析为准分子离子通过质量数为176u的中性丢失生成，故推测其为一葡糖醛酸苷。由于M1较立达霉(m/z401.3)质量数多192，推测其为立达霉氧化后又发生葡萄糖苷醛酸化的产物，为N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(hydroxyacetyl)alanine，中文名为N-(2,6-二甲苯基)-N-(羟乙酰基)丙氨酸。

2.1.5代谢物M2的HPLC-MS/MS分析

M2的色谱保留时间为7.9～8.2min，在血样中M2是所有代谢产物中质谱响应较高的产物(图2)。在一级正离子全扫描中观察到其准分子离子为m/z296.1499。二级全扫描质谱中观察到m/z296.1450的碎片离子，由于m/z296.1450较立达霉准分子量多16，推测M2为立达霉的氧化产物。M2为N-(2-hydroxymethyl-6-methylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alanine methyl ester，N-(2-羟甲基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸甲酯。

2.2鱼体内立达霉代谢产物的定量分析

2.2.8样品分析

在给药立达霉后3h，取肝脏样品，分析各种产物的峰面积比例，如表1所示。

表1各代谢产物组分峰面积样品测定结果

3结论

本试验中采用的HPLC-MS/MS同时测定立达霉在草鱼体内四种主要代谢产物定性鉴定及其含量的分析方法。

在口灌组及浸泡组中，肝脏组织中的立达霉主要以原型药(M0)为主，高于75％；立达霉在草鱼体内代谢产物主要有4种，分别为代谢物N-(2-羧基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸、N-(2-羟甲基)-6-甲苯基-N-(羟乙酰基)丙氨酸、N-(2,6-二甲苯基)-N-(羟乙酰基)丙氨酸和N-(2-羟甲基-6-苯甲基)-N-(甲氧乙酰基)丙氨酸甲酯，各代谢产物所占的比例均小于10％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。