一种高纯度尿促卵泡素的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种尿促卵泡素的提取制备方法。

背景技术：

尿促卵泡素（urine Follicle Stimulating Hormone，u-FSH）是主要成分为卵泡刺激素 （Follicle Stimulating Hormone，FSH）的组合物，高纯度尿促卵泡素中FSH含量可以达到95%以上，几乎不含黄体生成素（Luteotropic Hormone，LH）。FSH是一种糖蛋白激素，分子量约为30KD。FSH能促进颗粒细胞增生，刺激类固醇生成，调节配子细胞的发育和成熟，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。FSH对人类具有调控月经周期、排卵和调节雄性睾丸功能的作用，临床上常用它治疗女性不孕症和男性促性腺激素分泌不足、精小管缺陷等。

在人的脑垂体和绝经期与绝经后的妇女尿中两者的含量较高，因此也是提取FSH 的主要来源。用于生产u-FSH的原料人绝经期促性腺激素（Human Menopausal Gonadotropin，HMG）主要包含卵泡刺激素与黄体生成素（Luteotropic Hormone，LH）。FSH与LH效价的比值约为1:1。制备高纯度尿促卵泡素需要除去HMG 中的LH 和其他尿蛋白质，保留高纯度单一活性组分的FSH。

目前，国外高纯度的u-FSH 生产技术主要由Serono 公司掌握， 其工艺流程为先用乙醇抽提HMG 粗品，再经硅酸铝吸附，然后经阴离子交换层析，再使用抗FSH 单克隆抗体层析柱捕获FSH，最后通过反相层析获得高纯度u-FSH。国内高纯度的u-FSH主要由丽珠和天伟两家公司生产，其生产工艺中均使用了抗LH抗体吸附除去LH的工艺步骤。利用抗原抗体特异性反应来除去LH，具有纯化效率高等优点。但目前大多数抗体为鼠源或兔源，本身属于蛋白质，在层析过程中，偶联于基质上的抗体脱落会造成异源蛋白的污染，影响产品品质。同时，抗体免疫亲和层析柱价格昂贵，使用寿命短，维护及工业放大生产困难，这些不足都严重阻碍了其应用推广。因此，本领域迫切需要开发出一种能够制备出低含量LH及高纯度FSH产品的操作简便、生产成本低的生产工艺。发明人发现LH的疏水性强于FSH，可通过疏水层析技术将其分离，因此可以采用疏水层析代替抗体免疫亲和层析，以解决上述问题。

技术实现要素：

针对以上工艺的不足，本发明的目的是提供一种尿促卵泡素的制备方法，与已有工艺相比，该制备方法操作简便、生产成本低，获得的尿促卵泡素纯度更高，无外源蛋白的污染。 FSH比活性大于10000IU/mg 蛋白质，LH:FSH效价低于1:100。

本发明提供的尿促卵泡素的制备方法包括以下步骤：

(1) 人绝经期促性腺激素粗制品经阴离子交换层析纯化，得到尿促卵泡素中间体I；

(2) 尿促卵泡素中间体I经阳离子交换层析纯化，得到尿促卵泡素中间体II；

(3) 尿促卵泡素中间体II经染料亲和层析纯化，得到尿促卵泡素中间体III；

(4) 尿促卵泡素中间体Ⅲ经疏水层析纯化，得到高纯度尿促卵泡素的溶液；

根据以上所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤（4）所得尿促卵泡素进行超滤换盐，换盐所用溶液为0.01M PB缓冲溶液，优选地，其pH为5.5-7.0。

优选地，上述制备方法还包括将步骤（4）所得尿促卵泡素溶液与冻干保护剂混合后冻干，冻干保护剂为乳糖，优选地，其添加量为3%-6%（g/ml）。

优选地，上述制备方法所述阴离子交换层析填料配基为三乙基氨基乙基、二乙基氨基乙基、氨基乙基或三乙醇基氨基，基质为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、苯乙烯；所述阳离子交换层析填料配基为羧甲基、磺酸基、磷酸基、亚磷酸基、酚基，基质为纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯；所述染料亲和层析填料配基为Cibacron Blue、Red、Green、Orange，基质为琼脂糖、葡聚糖或壳聚糖；所述疏水层析填料为以丁基、辛基、苯基或新戊基为配基的乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚物、琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯或壳聚糖。

具体来说，所述步骤（1）包括以下步骤：

用水溶解HMG粗制品，调节溶液的pH值至5.5-8.0；将HMG粗制品溶液上样至已平衡好的阴离子交换层析柱；以pH 值为5.5-8.0 的0.02M PB溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；以pH 值为5.5-8.0 的含0.05-0.2M NaCl的0.02M PB溶液洗脱，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为尿促卵泡素中间体I；

具体来说，所述步骤（2）包括以下步骤：

将卵泡刺激素中间体I的溶液上样至已平衡好的阳离子交换层析柱；以pH 值为4.0-5.5 的0.1M HAc-NaAc溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用pH 值为4.0-5.5的含0.1-0. 5M NaCl的0.1M HAc-NaAc溶液洗脱，并检测洗脱液在280nm 处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为尿促卵泡素中间体II；

具体来说，所述步骤（3）包括以下步骤：

将卵泡刺激素中间体II的溶液上样至已平衡好的Cibacron Blue染料亲和层析柱；以pH 值为6.0-9.0 的0.1M NaAc溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH 值为8.0-10.0 的含0.8-2.5M KCl 的0.02M PB溶液洗脱，并检测洗脱液在280nm 处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为尿促卵泡素中间体III；

具体来说，所述步骤（4）包括以下步骤：

将卵泡刺激素中间体III的溶液上样至已平衡好的疏水层析柱；用pH值为7.0-9.0 的含有1.0-1.5M 硫酸铵的0.02M PB溶液洗涤，并检测洗涤液在280nm 处的吸光值，直至吸光值不再下降；再以pH 值为7.0-9.0 的含有0.2-0.4M 硫酸铵的0.02M PB溶液洗脱，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，所得洗脱液即为高纯度尿促卵泡素的溶液；

本发明以HMG为起始原料，依次采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、染料亲和层析以及疏水层析工艺，提取纯化制得高纯度FSH。其中，利用蛋白质两性电离的性质，通过改变溶液pH，使蛋白质带上不同电荷，经过阴离子交换层析与阳离子交换层析，FSH纯化倍数可达50倍以上。利用FSH能与染料亲和吸附的性质，进一步去除杂质蛋白，使FSH纯化倍数达到150倍以上。最后利用LH与FSH疏水性差异，去除LH，获得高纯的几乎不含LH的尿促卵泡素。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为实施例1制备的高纯度尿促卵泡素成品的HPLC图谱。

图3为实施列1和实施例2制备的FSH的电泳图谱。其中，1：实施例1制备成品；2：实施例1制备成品5%自身对照；3：实施例2制备成品5%自身对照；4：实施例2制备成品；

图4为实施例2制备的高纯度尿促卵泡素成品的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明涉及的生物效价、比活性及纯度的测定及计算方法。

生物效价测定：

FSH、LH生物效价测定按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1216及1217检测。

比活性测定：

精密称取本品约10mg，精密加入水1ml使溶解；另精密称取牛血清白蛋白对照品，加水溶解制成每1ml中分别含1.0mg、0.8mg、0.6mg、0.4mg、0.2mg、0mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0401），分别在280nm的波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白溶液的浓度为横坐标，在280nm的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，吸光度和浓度关系应呈线性。从标准曲线上求得供试品溶液的蛋白浓度，按下式计算比活：

HPLC纯度测定：

取本品适量，加水制成每1ml中约含500IU FSH的溶液作为供试品溶液。照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法试验。采用凝胶色谱柱 Superdex 75；以磷酸盐缓冲液（取85%H3PO46.74ml，加水800ml，再加Na2SO4 14.2g，用50%NaOH调pH 至6.7，用水定容为1000ml）；柱温30℃；流速0.5ml/min；检测波长214nm；进样量100μl。

电泳有关物质测定：

照（《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0541第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）检查。供试品溶液浓度为30000IU FSH/ml，将其稀释20倍作为对照溶液，上样量为10μl。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

如图１所示，将HMG粗制品（本公司生产，批号Z0203150901）作为起始原料，其FSH生物效价为30IU/mg，LH生物效价为28IU/mg，FSH比活性为43IU/mg蛋白质。

1. Capto DEAE 阴离子交换层析

用200ml水溶解8.0g HMG粗制品，调节溶液的pH值至7.5，将此溶液上样至柱体积为250ml的Capto DEAE层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液（0.02M PB，pH7.5）平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+0.15MNaCl）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液1.0L，用截留分子量为6KD的超滤膜浓缩至约100ml，加入预冷至-20℃的95%乙醇至乙醇浓度为85%，搅拌均匀后静置过夜沉淀蛋白，次日离心收集沉淀，加入无水乙醇脱水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中间体I 0.73g。

2. CM-Sepharose 阳离子交换层析

尿促卵泡素中间体I 0.7g 用30ml平衡液（0.1M HAc-NaAc，pH4.5）溶解后上样至柱体积为20ml的 CM-Sepharose 层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH4.5）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液100ml，即为尿促卵泡素中间体II。

3. Capto Blue (high sub)染料亲和层析

将尿促卵泡素中间体II 98ml调节pH及电导率与平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）一致，上样至已平衡好的柱体积为15ml的Capto Blue (high sub) 层析柱（购自GE公司）；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+2.0M KCl，pH 9.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液70ml，即为尿促卵泡素中间体III。

4. Phenyl-650M疏水层析

往尿促卵泡素中间体III 68ml中添加固体硫酸铵，搅拌溶解，调节pH及电导率与平衡液（0.02M PB+1.4M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）一致，上样至已平衡好的柱体积为10ml的Phenyl Phenyl-650M层析柱（购自TOSOH公司）；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+0.3M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液40ml，即为高纯度尿促卵泡素溶液。

将高纯度尿促卵泡素溶液用截留分子量为6KD的超滤膜超滤浓缩后，用0.01M PB缓冲溶液(pH 6.0)换盐3次，按照4%（w/v）的比例添加乳糖配制成冻干原液，冷冻干燥后得到0.91g高纯度尿促卵泡素成品，成品相关参数见表1，FSH的HPLC及电泳纯度图谱分别如图2及图3所示。

表1 实施例1制备的高纯度尿促卵泡素成品参数

实施例2

将低纯度HMG（本公司生产，批号Z0203150901）作为起始原料，其FSH生物效价为30IU/mg，LH生物效价为28IU/mg，FSH比活性为43IU/mg蛋白质。

1. Capto DEAE 阴离子交换层析

用500ml水溶解20g HMG，调节溶液1的pH值至7.5，将此溶液上样至柱体积为630ml的Capto DEAE层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液（0.02M PB，pH7.5）平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+0.15M NaCl）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液2.5L，用截留分子量为6KD的超滤膜浓缩至约100ml，加入预冷至-20℃的95%乙醇至乙醇浓度为85%，搅拌均匀后静置过夜沉淀蛋白，次日离心收集沉淀，加入无水乙醇脱水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中间体I 1.85g。

2. CM-Sepharose 阳离子交换层析

尿促卵泡素中间体I 1.8g 用80ml平衡液（0.1M HAc-NaAc，pH4.5）溶解后上样至柱体积为50ml的 CM-Sepharose 层析柱（购自GE公司），层析柱预先用平衡液平衡好；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH4.5）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液250ml，即为尿促卵泡素中间体II；用截留分子量为6KD的超滤膜浓缩至约100ml，加入预冷至-20℃的95%乙醇至乙醇浓度为85%，搅拌均匀后静置过夜沉淀蛋白，次日离心收集沉淀，加入无水乙醇脱水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中间体II干燥品 0.24g。

3. Capto Blue (high sub) 染料亲和层析

尿促卵泡素中间体II干燥品 0.21g用平衡液（0.1M NaAc，pH7.0）溶解，上样至已平衡好的柱体积为40ml的Capto Blue (high sub) 层析柱（购自GE公司）；上样结束后用平衡液洗涤未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+2.0M KCl，pH 9.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液174ml，即为尿促卵泡素中间体III；加入预冷至-20℃的95%乙醇至乙醇浓度为85%，搅拌均匀后静置过夜沉淀蛋白，次日离心收集沉淀，加入无水乙醇脱水3次后真空干燥，得到尿促卵泡素中间体II干燥品 0.13g。

4. Phenyl-650M疏水层析

尿促卵泡素中间体II干燥品 0.11g用平衡液（0.02M PB+1.4M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）溶解，上样至已平衡好的柱体积为25ml的Phenyl-650M层析柱（购自TOSOH公司）；上样结束后用平衡液洗未吸附的蛋白，并检测洗涤液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降；再用洗脱液（0.02M PB+0.3M (NH₄)₂SO₄，pH7.0）洗脱FSH，并检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值不再下降，共收集洗脱流出液94ml，即为高纯度尿促卵泡素。

将高纯度尿促卵泡素用截留分子量为6KD的超滤膜超滤浓缩后，用0.01M PB缓冲溶液(pH 6.0)置换原缓冲溶液3次，按照4%（w/v）的比例添加乳糖配制成冻干原液，冷冻干燥后得到2.31g 高纯度尿促卵泡素成品，成品相关参数见表2，FSH的电泳及HPLC纯度图谱分别如图3及图4所示。

表2 实施例2制备的高纯度尿促卵泡素成品参数

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