专利名称：高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单体生物碱的制备方法，尤其涉及一种高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法。
背景技术：
浙贝母为百合科贝母属的一种多年生草本植物，其鳞茎具有清热化痰，止咳，开郁，散结之功效，用于热痰咳嗽，肺痈，乳痈，痰核等多种疫病，为中药临床方剂常用饮片。其饮片品种有大贝，珠贝，浙贝片三种。浙贝母中的有效成分为甾体类生物碱类及其苷。主要有浙贝碱(贝母素甲，verticine，peimine)、去氢浙贝碱(贝母素乙，verticinone，peiminine)以及微量的贝母新碱(peimisine)、贝母芬碱(peimiphine)、贝母定碱(peimidine)、贝母替定碱(peimitidine)。此外，尚含有甾苷类生物碱贝母碱苷(peimirnoside)，一种甾醇类中性物质原贝母素(propeimin)。浙贝母中的生物碱为止咳，化痰和平喘等作用的有效成分，而贝母素甲的盐酸盐在一定浓度下，对耐药金黄色葡萄球菌具有较强的逆转作用，主要通过抑制细菌细胞膜上的主动外排泵来发挥作用。且近年来研究表明，贝母素乙具有逆转肿瘤细胞多药耐药活性。
结构式如下
R＝α-OH，β-H R’＝H浙贝碱(贝母素甲，verticine，peimine)R＝O R’＝H去氢浙贝碱(贝母素乙，verticinone，peiminine)R＝α-OH，β-H R’＝-D-葡萄糖 贝母碱苷(peiminoside)从贝母素甲和贝母素乙的结构式可以看出两者均属于甾体生物碱，具有异胆甾烷(C27)的骨架，含有六个环，其中A，B，D，E，F为六元环，C为五元环。氮原子位于E、F环连接处，两者均为季胺碱。
贝母素甲的分子式C27H45NO3，物化特性熔点222-224℃，溶于氯仿，甲醇，乙醇，乙酸乙酯。
贝母素乙的分子式C27H43NO3，物化特性熔点212-214℃，溶于氯仿，甲醇，乙醇，乙酸乙酯。
由于浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的结构十分相似，加上二者在浙贝母中的含量很低(＜0.08％)，给分离带来了较大的困难。传统的单体生物碱的分离多是采用如下方法先用有机溶剂，如乙醇提取获得粗提物，此粗提物中含有大量其他杂质，贝母素甲和贝母素乙含量均较低，粗提物还需用酸水溶解、过滤，后用有机溶剂，如石油醚，乙酸乙酯萃取，经过硅胶柱层析得到单体的生物碱。这种方法操作复杂，步骤冗长，样品吸附损耗大。张建兴等通过柱层析的方法分离制备得到贝母素甲和贝母素乙，回收率低于1％。
高速逆流色谱技术(High Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)是20世纪90年代发展起来的一种新型液-液色谱分离方法。其原理是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相(固体相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固体相中分配比例大的后被洗脱。不同于传统液相色谱法，HSCCC分析方法不使用固相载体，因而避免了有效成分被固相载体的不可逆吸附和峰形拖尾等缺点；样品粗提物可直接进样分离，可以高效、快速和大制备量分离，分离纯化与制备可同步完成，有机溶剂消耗少，无损失、无污染。基于以上优点，HSCCC色谱仪无论是作为分析型仪器还是制备型仪器，在天然产物上具有广阔的开发前景和实际的应用意义，它可以从复杂的天然粗制品中提取不同特性的有效成分，为天然药物的发展提供了有利条件。目前，国内外学者利用HSCCC已经成功地分离提取天然药物中黄酮、生物碱、蒽醌类衍生物、皂甙等有效成分。
目前，还没有利用HSCCC分离浙贝母饮片中的有效成分-贝母素甲和贝母素乙。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使分离回收率提高，且节约溶剂、操作简便。
为解决上述技术问题，本发明一种高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括以下步骤制备浙贝母粗提物作为进样物；配置构成固定相和流动相的溶剂系统；固定相和流动相同时泵入柱内；主机转动，由进样阀进样，检测洗脱溶剂，接收目标组分，收集得到产品。所述的溶剂系统为三组分溶剂系统，A组分可选氯仿、四氯甲烷等氯代烷烃；B组分可选甲醇、乙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮；C组分为稀盐酸、稀磷酸等稀酸性溶液。优选氯仿-乙醇-稀盐酸溶剂体系。
所述的溶剂系统各组分氯代烷烃，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的体积比为(2-6)∶(1-4)∶2，例如3∶2∶2，4∶3∶2，4∶1.5∶2等，优选3∶2∶2。
所述稀酸性溶液的浓度在0.05-0.5mol/l之间，例如0.1mol/l，0.2mol/l等。优选0.2mol/l。
所述固定相和流动相同时泵入柱内时，控制固定相保留值为0.4-0.8。
主机转速和流动相流速需要控制在一定的范围内，按体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开，采用TBE-300A高速逆流色谱仪，该机型柱体积为119ml，进样圈为10ml，配有AKTA purifier P-900泵，ELSD(蒸发光散射检测仪)。采用AKTA purifier P-900双泵同时泵入固定相和流动相，使其充满整个柱子，然后转动主机，控制主机转速在500-999r/min，单独泵入流动相，控制流动相流速在0.5-3mL/min。优选主机转速为800r/min，流动相流速为1.2mL/min。
本发明适合温度15-30℃，在上述温度范围内，温度较低时，ELSD(蒸发光散射检测仪)检测的出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对峰形无多大影响。
本发明制备步骤包括有一个体系。经过体系的一次分离后收集到的贝母素甲和贝母素乙的馏分蒸干、氯仿溶解后，经水洗三次，可得到贝母素甲和贝母素乙的白色固体。经高效液相色谱(HPLC)检测，纯度均在95％以上。
本发明具有以下有益效果本发明采用的高速逆流色谱分离技术，是一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技术，它克服了固态支持物或载体不可逆吸附、损耗和变性，使被分离物回收率高，理论达100％，本发明实际达到99％以上。又因为采用优选的溶剂体系，控制温度、调整主机转速和流动相流速等工艺条件，可以高效率的分离，获得高纯度的单体生物碱(贝母素甲、贝母素乙分别达到98％，95％)。并且适合从各种工艺途径制备的浙贝母粗提物。保证较高峰形分辨度，分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂、操作简便。
图1是本发明实施例1的HSCCC-ELSD检测图谱；图2是本发明实施例2的HSCCC-ELSD检测图谱；图3是本发明实施例3的HSCCC-ELSD检测图谱；图4是本发明实施例4的HSCCC-ELSD检测图谱；图5是本发明实施例5的HSCCC-ELSD检测图谱。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例1取浙贝母粉(过60目筛)20g，加入20ml氨水浸润1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加热2h，过滤，将滤液蒸干，残渣备用。
从体系中选取氯仿-乙醇-0.2M盐酸溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备贝母素甲和贝母素乙。按4∶3∶2的体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。设定实验温度为25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD检测器，HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流动相充满整个柱子，调整主机转速800r/min，转动主机，流动相以1.2mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。HSCCC-ELSD图谱如图1所示，其中，peak3为贝母素乙，peak5为贝母素甲。目标成分收集后经蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得贝母素甲和贝母素乙的白色固体，两者经HPLC-ELSD检测纯度分别为98％和95％。并经过核磁共振氢谱(1HNRM)、质谱(MS)测试鉴定了结构。
实施例2取浙贝母粉(过60目筛)20g，加入20ml氨水浸润1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加热2h，过滤，将滤液蒸干，残渣备用。
从体系中选取氯仿-乙醇-0.1mol/l盐酸溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备贝母素甲和贝母素乙。按2∶1∶2的体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。设定实验温度为25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD检测器，HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流动相充满整个柱子，调整主机转速800r/min，转动主机，流动相以1.2mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。HSCCC-ELSD图谱如图2所示，其中，peak3为贝母素乙，peak4为贝母素甲。目标成分收集后经蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得贝母素甲和贝母素乙的白色固体，两者经HPLC-ELSD检测纯度均高于95％。并经过核磁共振氢谱(1HNRM)、质谱(MS)测试鉴定了结构。
实施例3取浙贝母粉(过60目筛)20g，加入20ml氨水浸润1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加热2h，过滤，将滤液蒸干，残渣备用。
从体系中选取氯仿-乙醇-0.2mol/l磷酸溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备贝母素甲和贝母素乙。按6∶4∶2的体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。设定实验温度为25℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD检测器，HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流动相充满整个柱子，调整主机转速700r/min，转动主机，流动相以2mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。HSCCC-ELSD图谱如图3所示，其中，peak3为贝母素乙，peak4为贝母素甲。目标成分收集后经蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得贝母素甲和贝母素乙的白色固体，两者经HPLC-ELSD检测纯度均高于95％。并经过核磁共振氢谱(1HNRM)、质谱(MS)测试鉴定了结构。
实施例4取浙贝母粉(过60目筛)20g，加入20ml氨水浸润1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加热2h，过滤，将滤液蒸干，残渣备用。
从体系中选取四氯甲烷-甲醇-0.05mol/l磷酸溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备贝母素甲和贝母素乙。按4∶3∶2的体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。设定实验温度为15℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD检测器，HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流动相充满整个柱子，调整主机转速500r/min，转动主机，流动相以3mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。HSCCC-ELSD图谱如图4所示，其中，peak2为贝母素乙，peak3为贝母素甲。目标成分收集后经蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得贝母素甲和贝母素乙的白色固体，两者经HPLC-ELSD检测纯度均高于95％。并经过核磁共振氢谱(1HNRM)、质谱(MS)测试鉴定了结构。
实施例5取浙贝母粉(过60目筛)20g，加入20ml氨水浸润1h后，加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液100ml，置于80℃水浴加热2h，过滤，将滤液蒸干，残渣备用。
从体系中选取氯仿-丙酮-0.5mol/l盐酸溶液在半制备型高速逆流色谱仪上来分离制备贝母素甲和贝母素乙。按4∶1.5∶2的体积比将溶剂体系置于分液漏斗中，摇匀静置分层。待平衡一定时间后，将上相(固定相)和下相(流动相)分开。设定实验温度为30℃。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪，柱容积119ml，进样圈为10ml，AKTA purifier P-900泵，ELSD检测器，HX-1050恒温循环器。
称取50mg粗提物溶解于20mL下相混合溶液中待用。进样前，先用AKTA purifier P-900泵把固定相和流动相充满整个柱子，调整主机转速999r/min，转动主机，流动相以3mL/min的流速泵入柱内，待系统稳定后，由进样阀进样。然后根据ELSD(蒸发光散射检测仪)检测图谱，接收目标成分。HSCCC-ELSD图谱如图5所示，其中，peak2为贝母素乙，peak4为贝母素甲。目标成分收集后经蒸干、氯仿溶解后，水洗三次，可得贝母素甲和贝母素乙的白色固体，两者经HPLC-ELSD检测纯度均高于95％。并经过核磁共振氢谱(1HNRM)、质谱(MS)测试鉴定了结构。
权利要求
1.一种高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤制备浙贝母粗提物作为进样物；配置构成固定相和流动相的溶剂系统；固定相和流动相同时泵入柱内；主机转动，由进样阀进样，检测洗脱溶剂，接收目标组分，收集得到产品；其特征在于所采用的溶剂系统由氯代烷烃，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液组成。
2.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于，所述固定相和流动相同时泵入柱内时，控制固定相保留值为0.4-0.8。
3.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的氯代烷烃为氯仿，所述的脂肪醇或脂肪酮为乙醇，所述的稀酸性溶液为稀盐酸溶液。
4.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的溶剂系统各组分氯代烷烃，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的体积比为(2-6)∶(1-4)∶2。
5.如权利要求4所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的溶剂系统各组分氯代烷烃，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液的体积比为4∶3∶2。
6.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的稀酸性溶液的浓度在0.05-0.5mol/l之间。
7.如权利要求6所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的稀酸性溶液的浓度为0.2mol/l。
8.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述收集得到的产品经过蒸干、氯仿溶解后，采用水洗三次，可得到贝母素甲和贝母素乙的白色固体。
9.如权利要求1所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述制备步骤中，温度为15-30℃，主机转速为500-999r/min，流动相泵入柱内的流速为0.5-3mL/min。
10.如权利要求9所述的高纯度贝母素甲、贝母素乙的制备方法，其特征在于所述的主机转速为800r/min，所述的流动相流速为1.2mL/min。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度贝母素甲和贝母素乙的制备方法，其采用高速逆流色谱技术，包括如下步骤制备浙贝母提取物作为进样物；配置构成固定相和流动相的溶剂系统；固定相和流动相同时泵入柱内；主机转动，由进样阀进样，检测洗脱溶剂，接收目标组分，收集得到产品。所用的溶剂系统可以是由氯代烷烃，脂肪醇或脂肪酮，稀酸性溶液所构成。本方法可以从浙贝母粗提物中获得高纯度的单体生物碱贝母素甲和贝母素乙，纯度分别高达98％，95％。该方法操作简单方便，成本低廉，回收率高，较易于推广使用。
文档编号C07J75/00GK1982328SQ20051011154
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者沈平孃, 张继全, 刘峻, 金艳 申请人:上海中药制药技术有限公司, 国家中药制药工程技术研究中心